關(guān)鍵詞：芒果；可可毛色二孢；咪鮮胺；轉(zhuǎn)錄組；解毒代謝酶

中圖分類號(hào)：S436.67 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

芒果（Mangifera indica L.）是我國重要的熱帶經(jīng)濟(jì)作物，海南地區(qū)的芒果產(chǎn)量和種植面積均位居我國前列。芒果果肉香味濃郁，除鮮食外還可制作果醬和飲品，深受消費(fèi)者喜愛。芒果蒂腐病是危害芒果品質(zhì)、導(dǎo)致采后果實(shí)嚴(yán)重腐爛的重要病害。可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae）是引發(fā)芒果蒂腐病的主要病原菌之一[1]。該病原菌是一種全球性病原真菌，能夠在芒果等多種熱帶果樹及林木作物上侵染為害，造成采后果實(shí)蒂腐病和田間樹木、枝干的枯死等病害[1]。此外，該菌具有潛伏侵染的特性，病菌可在幼果期侵染并在果實(shí)中潛伏，果實(shí)成熟后病斑迅速擴(kuò)展，發(fā)生褐變并散發(fā)出酸臭味，在芒果采后貯藏和運(yùn)輸?shù)倪^程中爆發(fā)，嚴(yán)重影響芒果的品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2]。目前防治芒果病害的方法主要包括物理防治、生物防治與化學(xué)防治，其中化學(xué)防治是最常用的方式，異菌脲、多菌靈、咪鮮胺等殺菌劑能夠有效防治芒果蒂腐病[3-4]。然而，隨著藥劑施用量持續(xù)增加，使得病原菌的選擇壓力持續(xù)增大，單一靶標(biāo)位點(diǎn)的殺菌劑已經(jīng)產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性。據(jù)報(bào)道，芒果可可毛色二孢對(duì)多菌靈、嘧菌酯抗性已經(jīng)達(dá)到十分嚴(yán)重的水平[5-6]。

大量研究表明，害蟲、雜草及病原菌對(duì)農(nóng)藥的抗性機(jī)制主要包括靶標(biāo)抗性機(jī)制和非靶標(biāo)抗性機(jī)制[6]。靶標(biāo)抗性主要是殺菌劑靶標(biāo)基因發(fā)生突變所致，致使藥劑與作用位點(diǎn)酶的親和性降低。而非靶標(biāo)抗性主要是增加藥劑外排作用、解毒作用和對(duì)藥劑的通透性下降所致，又稱為代謝抗性，增加藥劑外排與代謝解毒常常協(xié)同發(fā)揮作用[7]。以細(xì)胞色素P450 介導(dǎo)的微粒體多功能氧化酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶等代謝酶系為主體的解毒系統(tǒng)能夠把農(nóng)藥分解成毒性更低、親水性更強(qiáng)的物質(zhì)，便于排出體外[8]。代謝抗性的發(fā)生不僅會(huì)提升抗藥性水平，也有可能導(dǎo)致交互抗性及多藥抗性的發(fā)生[9]。目前，代謝抗性的研究主要集中在害蟲及雜草抗藥性的產(chǎn)生機(jī)制，病原真菌的代謝抗性研究尚處于初步階段。本研究擬在芒果上分離獲得的咪鮮胺抗藥性菌株為供試材料，通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及差異表達(dá)基因的分析，挖掘與代謝抗性相關(guān)的基因，對(duì)代謝抗性的機(jī)制進(jìn)行初步探析，為后續(xù)代謝抗性機(jī)制的深入研究提供依據(jù)。研究芒果可可毛色二孢抗藥性產(chǎn)生機(jī)制，是延緩田間抗藥性發(fā)展的關(guān)鍵所在，對(duì)提升芒果蒂腐病防治效果及提高芒果產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要指導(dǎo)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 供試3 株芒果蒂腐病可可毛色二孢菌株HL02、M108 和DF04 由海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院殺菌劑生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。將菌株接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上，于28 ℃黑暗中培養(yǎng)3 d 后備用。

1.1.2 供試藥劑 97%咪鮮胺購自海南正業(yè)中農(nóng)高科股份有限公司；總RNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；DL2000 DNA Marker、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、ChamQ Universal qPCR SYBRMaster Mix 購自南京諾唯贊生物科技有限公司；DNA 1000 assay Kit 購自安捷倫科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 咪鮮胺敏感性測(cè)定 采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定3株可可毛色二孢菌株對(duì)咪鮮胺的敏感性。咪鮮胺用少量丙酮溶解并配制成1×10³ mg/L 的母液備用。在PDA 培養(yǎng)基中加入不同量的殺菌劑母液，配制得到不同濃度的含藥培養(yǎng)基平板，最終試驗(yàn)濃度為0、0.2、0.8、3.2、12.8、51.2 mg/L。對(duì)照培養(yǎng)基中加入等量的溶劑。每處理3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3 次。從培養(yǎng)3 d 的菌落邊緣取菌餅（直徑5 mm）轉(zhuǎn)移到含藥PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)36 h 后，測(cè)量菌落直徑并計(jì)算抑制率。將供試濃度轉(zhuǎn)換為濃度對(duì)數(shù)，抑制率轉(zhuǎn)換為幾率值，使用Probit 分析求回歸方程y=a+bx，計(jì)算半數(shù)有效濃度EC 值。

1.2.2 可可毛色二孢的RNA 提取及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序從培養(yǎng)3 d 的菌落邊緣取菌餅（直徑5 mm）轉(zhuǎn)移到100 mL 馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)（PDB），每瓶培養(yǎng)液接種5 個(gè)菌餅，于145 r/min 震蕩培養(yǎng)24 h；然后加入咪鮮胺使其終濃度為10 mg/L，再培養(yǎng)12 h 后取出每個(gè)樣品的菌絲，使用總RNA 提取試劑盒，嚴(yán)格按照說明書提取樣品的總RNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳及微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其純度和濃度。每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)樣品，將質(zhì)檢合格的樣品混合，然后設(shè)3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。用Oligo（dT）磁珠從上述RNA 樣品中富集mRNA 并進(jìn)行超聲處理，以片段化的mRNA 為模板合成cDNA 第一鏈，隨后用RNaseH 降解RNA 鏈，并在DNA polymerase Ⅰ體系下，在第二鏈合成時(shí)加入dNTPs 補(bǔ)齊雙鏈DNA的末端。在純化后的雙鏈DNA 的兩端各加上1 個(gè)A 堿基后與末端帶有T 堿基的接頭進(jìn)行連接，使用AMPure XP beads磁珠篩選200 bp 左右的cDNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增并再次純化后獲得cDNA 文庫，選擇DNA 1000assay Kit 對(duì)文庫進(jìn)行質(zhì)檢合格后，使用IlluminaHiSeq TM 2500 測(cè)序儀測(cè)序。利用HISAT2 將雙端測(cè)序得到的序列比對(duì)到參考基因組（ NCBI_ASM982982v1）。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析和差異表達(dá)基因篩選 測(cè)序原始數(shù)據(jù)raw reads 利用fastp 過濾和質(zhì)控得到cleanreads[10]。使用短reads 比對(duì)工具Bowtie 2將cleanreads 比對(duì)到可可毛色二孢的核糖體數(shù)據(jù)庫[11]，在不允許錯(cuò)配情況下去除比對(duì)上核糖體的reads，將保留下來的unmapped reads 用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組分析。利用DESeq2軟件比較不同處理的樣品與對(duì)照樣品，從而鑒定差異基因[12]。以FDR<0.05 且|log2（FC）|>1 為標(biāo)準(zhǔn)篩選識(shí)別顯著變化的差異表達(dá)基因（ DEG ）， 并對(duì)差異基因進(jìn)行GO（ http：//www.geneontology.org/ ） 功能分析和KEGG（http：//www.genome.jp/kegg/）通路富集分析。另外，使用HMMER3.0 軟件和BLASTP 程序比對(duì)含有細(xì)胞色素P450 蛋白結(jié)構(gòu)域、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶蛋白結(jié)構(gòu)域和ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域的序列，篩選后比對(duì)到轉(zhuǎn)錄組差異基因篩選結(jié)果中，結(jié)合差異基因功能和通路富集分析結(jié)果篩選與抗藥性相關(guān)的解毒代謝基因。

1.2.4 差異表達(dá)基因的定量驗(yàn)證3個(gè)菌株分別設(shè)10 mg/L 咪鮮胺處理組和未處理組（對(duì)照），每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)。提取芒果可可毛色二孢菌株總RNA 并使用RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，使用ChamQ Universal qPCR SYBRMaster Mix 配制熒光定量檢測(cè)體系，以actin 基因作為內(nèi)參基因測(cè)定差異基因表達(dá)量。使用PrimerPremier 5 軟件設(shè)計(jì)特異性引物（表1），所有引物均由楠山科技有限公司（海南）合成。qPCR 反應(yīng)體系：2×ChamQ Universal qPCR SYBR Master Mix10 μL、10 μmol/L 上/下游引物各0.4 μL、cDNA 模板1 μL、ddHO 8.2 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，循環(huán)42 次。每個(gè)處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)性重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用2?ΔΔCT 方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量[13]。使用GraphPad Prism 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用LSD法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 咪鮮胺處理對(duì)菌株的作用

供試3個(gè)菌株對(duì)咪鮮胺的EC50 值在0.12～3.92 mg/L 之間，與敏感菌株DF04 相比，抗性菌株HL02和M108的抗性倍數(shù)分別為7.67倍和32.67倍（表2）。咪鮮胺敏感菌株的菌絲生長(zhǎng)受藥劑的抑制，除了菌落大小的差異，菌絲也較抗性菌株稀薄。

2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

3個(gè)菌株分別設(shè)10mg/L 咪鮮胺處理組和未處理組，共6個(gè)樣品，每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)。過濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)后，從8 個(gè)文庫中生成了超過50 億個(gè)clean reads，3 個(gè)重復(fù)的平均Q介于97.10%～97.443%之間，Q介于92.375%～93.09%之間，GC 含量介于58.46～58.71 之間（表3）。質(zhì)控后的clean reads 數(shù)超過3500 萬條，其中超過90.81%（unique map）比對(duì)到參考基因組唯一位置上，全部的可以定位到基因組上的reads數(shù)量及占有效reads 比例（total mapped）超過91.40%。以上結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量高，可用于后續(xù)生物信息學(xué)分析。

2.3 差異表達(dá)基因表達(dá)分析

以FDR<0.05 且|log2（FC）|>1 為條件進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選。差異基因火山圖數(shù)據(jù)顯示（圖1A），10 mg/L 咪鮮胺處理（Pro）與未處理（CK）樣品間的基因表達(dá)水平及差異基因數(shù)量存在差異：經(jīng)10 mg/L 咪鮮胺處理后的抗性菌株HL02、M108 分別有609、1570 個(gè)顯著上調(diào)表達(dá)基因，539、998 個(gè)顯著下調(diào)表達(dá)基因；而敏感菌株DF04有2026 個(gè)顯著上調(diào)表達(dá)基因，3316 個(gè)顯著下調(diào)表達(dá)基因，敏感菌株的差異基因數(shù)量顯著高于抗藥菌株。韋恩圖顯示（圖1B），3 個(gè)菌株添加咪鮮胺處理前、后共有566 個(gè)差異表達(dá)基因。

針對(duì)咪鮮胺處理后抗性菌株與敏感菌株之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，結(jié)果表明，抗性菌株HL02、M108 分別有2078、3096 個(gè)上調(diào)表達(dá)基因，1527、1793 個(gè)下調(diào)表達(dá)基因（圖2），上調(diào)表達(dá)基因數(shù)量遠(yuǎn)大于下調(diào)表達(dá)基因。

2.4 咪鮮胺caWio5UGbH3r9GPI2F1ULw==處理后的差異表達(dá)基因GO富集分析

GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，咪鮮胺處理后的抗性和敏感菌株的差異表達(dá)基因分別集中在生物學(xué)進(jìn)程（biological process）、分子功能（molecularfunction）及細(xì)胞組分（cellular component）方面，其中，基因功能主要集中在27 個(gè)term 中，它們的差異表達(dá)基因數(shù)均大于100。生物學(xué)進(jìn)程中富集的差異基因數(shù)量最多，主要富集在細(xì)胞過程（cellular process）和代謝過程（metabolic process），其中，DF04 vs HL02 中分別有2249（18%）、2005（16%）個(gè)DEGs，DF04 vs M108 中分別有3073（17%）、2683（15%）個(gè)DEGs。分子功能進(jìn)程中差異表達(dá)基因主要富集在結(jié)合（binding）、催化活性（catalytic activity），DF04 vs HL02 中分別有1774（38%）、1606（35%）個(gè)DEGs，DF04 vsM108 中分別有2422（38%）、2095（33%）個(gè)DEGs。細(xì)胞組分進(jìn)程中的差異表達(dá)基因顯著富集在細(xì)胞結(jié)構(gòu)體（cellular anatomical entity）和含蛋白質(zhì)復(fù)合物（protein-containing complex）中，DF04 vs HL02中分別有1846（67%）、899（32%）個(gè)DEGs，DF04vs M108 中分別有2573（65%）、1354（34%）個(gè)DEGs（圖3）。2 個(gè)抗性菌株HL02、M108 與敏感菌株DF04 之間的差異表達(dá)基因分類趨勢(shì)表現(xiàn)一致，但DF04 vs M108 比對(duì)的差異表達(dá)基因高于DF04 vs HL02。

2.5 咪鮮胺處理后差異表達(dá)基因KEGG信號(hào)通路富集

KEGG 信號(hào)通路富集分析結(jié)果顯示，咪鮮胺處理后的差異表達(dá)基因集中在代謝（metabolism）、遺傳信息處理（genetic information processing）、細(xì)胞過程（cellular processes）、環(huán)境信息處理（environmental information processing）及有機(jī)系統(tǒng)（organismal systems）通路，DF04 vsHL02 和DF04 vs M108 中DEGs 分別為1479、1961個(gè)DEGs?？剐跃昱c敏感菌株之間差異表達(dá)基因顯著富集在代謝通路中，代謝通路差異基因在DF04 vs HL02 和DF04 vs M108 比對(duì)中分別占64.98%和63.39%；其中，位于前五的分別是全局和總覽圖（global and overview maps）、碳代謝（carbon metabolism）、氨基酸代謝（amino acidsmetabolism）、脂質(zhì)代謝（lipid metabolism）和輔助因子和維生素的代謝（metabolism of cofactorsand vitamins）（圖4）。

2.6 與代謝抗性相關(guān)基因的篩選及表達(dá)分析

使用細(xì)胞色素P450蛋白結(jié)構(gòu)域、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶蛋白結(jié)構(gòu)域和ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域比對(duì)到參考基因組后，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分別篩選出46 個(gè)細(xì)胞色素P450（Cytochrome P450）差異表達(dá)基因、19個(gè)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）差異表達(dá)基因和84個(gè)ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ABC transporter）差異表達(dá)基因。其中，抗敏菌株間基因表達(dá)水平存在明顯差異，被注釋為顯著差異表達(dá)基因的有：細(xì)胞色素P450差異表達(dá)基因27 個(gè)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶差異表達(dá)基因17 個(gè)和ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白差異表達(dá)基因59 個(gè)。聚類熱圖分析表明，與敏感菌株相比，2 個(gè)抗性菌株的差異表達(dá)基因基本一致。DF04 vs HL02 和DF04 vs M108 比對(duì)中，呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)P450s 基因分別有14 和15 個(gè)（圖5A），呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)GSTs基因分別有12 和11 個(gè)（圖5B），呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因分別有46 和47 個(gè)（圖5C）。

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，隨機(jī)選取4 個(gè)細(xì)胞色素P450 基因（56011963、56011911、56015966、56023668）、2 個(gè)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因（56016123、56022618）和2 個(gè)ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（56013411、56014441）進(jìn)行qPCR 驗(yàn)證（圖6），結(jié)果表明差異表達(dá)基因變化趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致，說明該轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠。

代謝抗性相關(guān)的基因中，與敏感菌株相比，在2 個(gè)抗性菌株中均呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)的基因包括：7 個(gè)P450s 基因、8 個(gè)GSTs 基因和11 個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（表4）。上述基因在芒果可可毛色二孢對(duì)咪鮮胺的解毒代謝中可能發(fā)揮重要作用，抗性菌株表達(dá)水平的變化很可能與可可毛色二孢菌株抗藥性相關(guān)。

3討論

苯并咪唑類及甲氧丙烯酸酯類均為高抗性風(fēng)險(xiǎn)的殺菌劑，在國內(nèi)的海南及國外的阿曼均有發(fā)現(xiàn)。芒果蒂腐病菌可可毛色二孢對(duì)苯并咪唑類多菌靈、甲基硫菌靈和甲氧丙烯酸酯類吡唑醚菌酯、嘧菌酯等已經(jīng)產(chǎn)生嚴(yán)重抗藥性，在田間形成了具有較高抗性水平的抗藥性亞種群[14-17]；此外，在木瓜上有報(bào)道蒂腐病菌可可毛色二孢對(duì)甲基硫菌靈和嘧菌酯產(chǎn)生抗藥性[18]。被劃分為中等抗性風(fēng)險(xiǎn)的甾醇脫甲基抑制劑類（DMIs）如咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑等，單用或者作為復(fù)配制劑廣泛應(yīng)用于芒果病害防治，但目前生產(chǎn)上已經(jīng)出現(xiàn)敏感性下降或藥效降低的現(xiàn)象。咪鮮胺主要通過抑制植物病原真菌細(xì)胞膜上麥角甾醇的生物合成從而抑制菌絲生長(zhǎng)，作為內(nèi)吸性殺菌劑同樣存在作用位點(diǎn)單一的缺點(diǎn)，長(zhǎng)期使用同樣具有產(chǎn)生抗藥性的潛在危險(xiǎn)。WANG 等[19-20]發(fā)現(xiàn)我國海南芒果可可毛色二孢對(duì)DMI 類殺菌劑苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺存在敏感性下降，并發(fā)現(xiàn)抗藥性菌株與戊唑醇存在正交互抗性。

據(jù)報(bào)道，已有許多植物病原真菌對(duì)DMI 類殺菌劑產(chǎn)生抗藥性，如桃褐腐病菌（Moniliniafructicola）[21-22]，蘋果黑星病菌（Venturia inaequalis）[23]。DMI 類殺菌劑的抗藥性機(jī)制較為復(fù)雜，抗藥性菌株除了存在靶標(biāo)抗性，即殺菌劑靶標(biāo)14α-脫甲基酶CYP51 基因突變和過表達(dá)導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性[19， 24-26]；還包括外排轉(zhuǎn)運(yùn)和解毒代謝酶的變化導(dǎo)致代謝抗性。研究指出，DMI類藥劑的靶標(biāo)基因CYP51 的點(diǎn)突變、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AtrD 和MFS 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因Mfs1 的誘導(dǎo)表達(dá)，均有可能介導(dǎo)灰葡萄孢（Botrytis cinerea）高抗突變體對(duì)啶菌噁唑的抗藥性[ 2 7 ]。研究發(fā)現(xiàn)ABC-G 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的過量表達(dá)是導(dǎo)致草坪草幣斑病病菌（Sclerotinia homoeocarpa）對(duì)丙環(huán)唑產(chǎn)生抗藥性的原因[28]。ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠?qū)⒂H脂性藥物和代謝產(chǎn)物排出體外，ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AG1IA_06082 的過表達(dá)能夠增強(qiáng)立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）對(duì)殺菌劑SYP-14288 的外排作用從而導(dǎo)致病原菌對(duì)殺菌劑的抗藥性[29]。WANG 等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，芒果可可毛色二孢咪鮮胺抗性菌株CYP51 基因及ABCG 基因的過表達(dá)與抗藥性的產(chǎn)生有關(guān)。這些研究說明抗藥性產(chǎn)生的機(jī)制不是單一的，可能存在多種機(jī)制。有研究表明解毒代謝相關(guān)基因的特異性表達(dá)與病原菌抗藥性有關(guān)，如細(xì)胞色素P450，這是一類由含鐵血紅素蛋白組成的超家族單加氧酶，具有廣泛的底物特異性，能夠催化多種氧化和還原反應(yīng)[30]。此外，谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）通過催化谷胱甘肽與各種疏水性和親電性基團(tuán)的結(jié)合參與解毒代謝[31]。細(xì)胞色素P450 基因AG1IA_05136 和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因AG1IA_07383 過表達(dá)增強(qiáng)立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）的解毒代謝，與病原菌對(duì)解偶聯(lián)劑SYP-14288、百菌清和苯醚甲環(huán)唑的多藥抗性有關(guān)[32]。上述研究表明，ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因、細(xì)胞色素P450 基因和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因過表達(dá)均與病菌抗藥性密切相關(guān)。

大量文獻(xiàn)報(bào)道轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）可以篩選及挖掘抗藥性相關(guān)基因，如HELLIN等[33]通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)Fusarium culmorum 在經(jīng)過戊唑醇處理后，抗性菌株ABC1基因的表達(dá)量明顯高于敏感菌株的表達(dá)量。ZHANG 等[34] 通過RNA-seq 發(fā)現(xiàn)ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因和MFS 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因參與了Penicillium italicum 對(duì)咪鮮胺的抗藥性。目前尚未有代謝酶參與可可毛色二孢抗藥性的研究報(bào)道。因此，本研究采用RNA-seq 技術(shù)分析對(duì)芒果可可毛色二孢咪鮮胺的抗敏菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)咪鮮胺處理后抗敏菌株之間差異表達(dá)基因的分析發(fā)現(xiàn)，2個(gè)抗性菌株的差異表達(dá)基因主要集中在代謝通路中。根據(jù)GO 分析和KEGG 信號(hào)通路富集分析，將篩選出的與解毒代謝相關(guān)的細(xì)胞色素P450 基因、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因和ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因進(jìn)行進(jìn)一步比較，發(fā)現(xiàn)2個(gè)抗性菌株的表達(dá)模式基本一致。本研究從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出的7 個(gè)細(xì)胞色素P450 基因、8個(gè)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因和11個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在咪鮮胺抗敏菌株間顯著上調(diào)表達(dá)。其中，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因56017578 和56024245 在GO功能注釋上被認(rèn)為是編碼多藥耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因，在灰葡萄孢上發(fā)現(xiàn)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因BcatrB 敲除突變體對(duì)植物抗毒素白藜蘆醇和殺菌劑拌種咯的敏感性均增加[35]，煙曲霉中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因atrF 的過表達(dá)被證明與伊曲康唑耐藥性相關(guān)[36]。已有研究報(bào)道煙曲霉和白色念珠菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的多藥耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因過表達(dá)可能導(dǎo)致真菌的多藥抗性[37]。其它差異表達(dá)基因并沒有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道與殺菌劑抗藥性相關(guān)，推測(cè)這些基因很可能與芒果可可毛色二孢菌株對(duì)咪鮮胺的抗藥性有關(guān)，但這些基因是否真正參與病原菌抗藥性還需要采用基因過表達(dá)、基因敲除和RNAi 等方法進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究首次對(duì)可可毛色二孢進(jìn)行代謝抗藥性的研究，并發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞色素P450、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶和ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在咪鮮胺處理芒果可可毛色二孢后顯著上調(diào)表達(dá)，表明芒果可可毛色二孢對(duì)咪鮮胺的抗藥性可能與多種代謝途徑相關(guān)。