關鍵詞：油料作物；虎堅果；塊莖；液泡膜內在蛋白；亞細胞定位；表達模式

中圖分類號：S565.9 文獻標志碼：A

液泡膜內在蛋白（tonoplast intrinsic protein，TIP）隸屬于水通道蛋白（aquaporin， AQP）家族，因其定位在液泡膜而得名[1]。TIP 最先在模式植物擬南芥中被鑒定，擬南芥γ-TIP1（AtTIP1;1）及其同源基因在蟾蜍卵母細胞和酵母中異源表達通常表現(xiàn)出高效的水分轉運活性，高于或與細胞膜定位的質膜內在蛋白（plasma membrane intrinsicprotein， PIP）相當[2-3]。在體外，有些TIP 還被證實可以轉運甘油、尿素、硼酸、NH3、H2O2 等中性小分子[4-10]。擬南芥（Arabidopsis thaliana）基因組含有10 個TIP 基因，并根據進化關系分為TIP1～TIP5 等5 個亞類，其中，除TIP4 和TIP5僅有1 個成員外，其他亞類含有2～3 個成員不等[11]。晶體結構顯示，與PIP 類似，TIP 含有6 個由5個親水環(huán)（LA–E）連接的跨膜α 螺旋（TM1–6）、2 個由LB 和LE 折向膜內形成的半螺旋以及位于半螺旋頂端的NPA 基序[10， 12]，2 個NPA 基序與位于TM2、TM5 和LE 上的4 個保守殘基（即ar/R選擇性濾器：H2、H5、LE1 和LE2）共同決定了孔道的大小和底物的特異性[13-14]；此外，擬南芥AtTIP2;1 位于LC 的H131 為NH3 的高效轉運所必須[10]。與PIP 相比，擬南芥TIP 的ar/R 選擇性濾器變異較大，TIP1 為H-I-A-V，TIP2、TIP3 和TIP4為H-I-G/A-R，TIP5 為N-V-G-C，孔徑介于0.67～1.56 ? [15]。研究表明，不同TIP 亞類定位于不同類型的液泡，如TIP1 主要定位于裂解型液泡，TIP2 位于蛋白儲藏型液泡，TIP3 定位于種子的蛋白儲藏型液泡，并在種子的萌發(fā)過程中逐步被TIP1 所替代[16]。TIP4 也在裂解型液泡被發(fā)現(xiàn)，主要參與水分、尿素和甘油的轉運[5， 9]。

油莎豆（Cyperus esculentus L.），又名虎堅果，是一種隸屬于禾本目莎草科莎草屬的新型草本油料作物[17-20]。不同于傳統(tǒng)油料作物在種子中積累油脂，油莎豆不開花或開花不結實，但它可在地下塊莖中積累高達35%的油脂，這使其成為研究營養(yǎng)組織油脂合成與調控的理想模型[21-23]。油莎豆塊莖起源于地下匍匐莖，其發(fā)育過程主要分為起始、膨大和成熟等3 個階段[21， 24]。通過前期研究，團隊發(fā)現(xiàn)海南地區(qū)塊莖的發(fā)育非常迅速，自起始后35 d 即可成熟，成熟塊莖的含水量約為45%，而在此之前一般維持在85%左右[24]，表明水分平衡在塊莖發(fā)育和代謝中的重要作用。前期研究顯示，在新鮮成熟塊莖的蛋白組中鑒定到多個AQP 基因，如CePIP1;1、CePIP2;1、CeTIP1;1和CeTIP2;1[19， 25-28]。其中，CeTIP1;1 隸屬于TIP1亞類，在塊莖、葉片、葉鞘、根、匍匐莖和芽尖等主要油莎豆組織中均高水平表達，且其編碼蛋白定位在煙草葉片的液泡[27]。本研究報道另一個塊莖表達的TIP 基因CeTIP4;1，該基因源于團隊先前構建的油莎豆全長轉錄組[29]，其與AtTIP4;1同源。研究顯示，CeTIP4;1 的表達模式及其編碼蛋白的亞細胞定位與CeTIP1;1 明顯不同，這些研究結果將有助于深入解析油莎豆塊莖的水分平衡機制。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用油莎豆品系為熱研3 號，植株種植于中國熱帶農業(yè)科學院文昌實驗基地，不同發(fā)育時期塊莖的采集詳見文獻[24] ； 本氏煙草（Nicotiana benthamiana）種植于中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所溫室，具體生長條件詳見文獻[30] ； 大腸桿菌DH5α 和根癌農桿菌GV3101（內含pSoup-P19）感受態(tài)、亞細胞定位載體pNC-Cam1304-SubN 和pNC-HbPIP2;3-RFP[31]均由本實驗室保存；各類酶、試劑盒及生化試劑詳見文獻[17]。

油莎豆的基因組和轉錄組數據分別下載于CNGBdb（https：//db.cngb.org/search/assembly/CNA-0051961/）和NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/703731）數據庫；擬南芥和水稻（Oryzasativa）的TIP 蛋白下載于TAIR11（https：//www.arabidopsis.org/）和RGAP7（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）數據庫；菠菜（Spinacia oleracea）的SoPIP2;1 下載于NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/pdb/1Z98）數據庫。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 的提取和反轉錄 油莎豆塊莖總RNA 的提取及反轉錄方法參照文獻[17]，即用天根植物多糖多酚RNA 提取試劑盒抽提總RNA，并用寶生物反轉錄試劑盒合成cDNA 第一鏈。

1.2.2 基因克隆與載體構建 本課題組前期通過對油莎豆的全長轉錄組[29]進行功能注釋，發(fā)現(xiàn)1條與AtTIP4;1 同源的轉錄本，序列全長1098 bp，包含1 個753 bp 的開放讀碼框。為克隆該基因，采用Primer Premier 5.0 軟件設計巢式PCR 引物對CeTIP4;1F/R （ AAACAAAGCAACCAAGACAG/CTTGCATCTCATGATCCAAA）和CeTIP4;1HF/R（ AGTGGTCTCTGTCCAGTCCTATGGCAAAGATTGCATTAGG/GGTCTCAGCAGACCACAAGTTCAAAATTCTTCACCATCTC）。PCR 擴增和載體構建參照文獻[17]：首先利用外側引物CeTIP4;1F/R 分離基因的全長轉錄本，隨后采用內側引物CeTIP4;1HF/R 擴增基因的編碼區(qū)序列，最后運用NC 克隆試劑盒將目的片段克隆到亞細胞定位載體pNC-Cam1304-SubN。

1.2.3 序列的生物信息學分析 利用本地BLASTN 程序將上述CeTIP4;1 的轉錄本比對到油莎豆的基因組， 提取相應的基因序列后用GSDS 2.0（http：//gsds.gao-lab.org/）在線軟件分析其基因結構；蛋白的理化特性和保守結構域分析分別使用Protparam（https：//web.expasy.org/protparam/）和CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）在線軟件；亞細胞定位、二級和3D 結構的預測分別使用Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）、SOPMA（https：//npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）在線軟件；跨膜螺旋區(qū)及保守殘基的鑒定基于與已結晶AtTIP2;1[10]和SoPIP2;1[12]的序列比對。

1.2.4 多序列比對與進化樹的構建 蛋白的多序列比對采用MUSCLE 軟件，進化樹的構建采用MEGA（v6.06）軟件，所用參數為最大似然法、1000 次自舉重復。

1.2.5 亞細胞定位分析 以前期報道的pNCHbPIP2;3-RFP[31]作為細胞膜定位的陽性標記，參照文獻[30]將重組質粒pNC-Cam1304-CeTIP4;1導入農桿菌，挑選單克隆，用含Kan 和Rif 的LB培養(yǎng)基搖菌，隨后與含陽性標記的農桿菌工程菌等量混合，制備浸染液，轉化受體，選取4 周齡的煙草葉片，熒光觀察采用共聚焦顯微鏡ZeissLMS880。

1.2.6 基因表達分析 轉錄譜分析采用StringTie（v2.2.0）軟件，即將轉錄組數據比對到基因組，然后用FKPM（fragments per kilobase of exon permillion fragments mapped）法均一化基因的相對表達水平。qRT-PCR 分析參照文獻[20]，以CeUCE2（Fq： ATCATCAAGGAGACCCAGCG， Rq： CTTAGGGGCAGCCATAGGA）作為內參基因，所用基因特異性引物為CeTIP4;1Fq/Rq（GTCCTCACTTTCTCCCTCCTCT/CACTAACCCGACAAGCAACG）。

2 結果與分析

2.1 CeTIP4;1的克隆與序列分析

通過將CeTIP4;1 的轉錄本比對到基因組，發(fā)現(xiàn)該基因位于Scaffold40 反向鏈的5 229 867～5 231 478 位，基因全長1612 bp，包含2 個內含子，5?和3? UTR 分別為154、191 bp（圖1A）。重組質粒pNC-Cam1304-CeTIP4;1 的桑格測序顯示，克隆到的序列與基因的對應區(qū)域（外顯子）完全一致。進一步的序列分析顯示，CeTIP4;1 編碼區(qū)的GC 含量為58.03%，編碼250 個氨基酸（aa），理論分子量（MW）為25.57 kDa，等電點（pI）為6.02，總平均疏水指數（GRAVY）為0.884，脂肪族指數（AI）為119.40，不穩(wěn)定系數（II）為33.70，屬于穩(wěn)定的酸性疏水型蛋白，這與CeTIP1;1、CeTIP2;1 和AtTIP2;1 類似，但不同于SoPIP2;1 的堿性特性（表1）。CDD 分析顯示，CeTIP4;1 的第3～235 位殘基為保守的MIP 結構域（圖1B）。CeTIP4;1 與CeTIP1;1、CeTIP2;1、AtTIP2;1 和SoPIP2;1 的序列相似性分別為67.19%、70.92%、73.81%和44.08%，擁有6 個相對保守的跨膜螺旋（TM1–6）、2 個半螺旋（HB 和HE）以及2 個典型的NPA 基序（圖1C）。CeTIP4;1 的ar/R 選擇性濾器為H-I-A-R，不同于CeTIP1;1 的H-I-A-V、CeTIP2;1 和AtTIP2;1 的H-I-G-R 以及SoPIP2;1的F-H-T-R；CeTIP4;1 的Froger 位點為T-S-A-YW，與CeTIP1;1 和AtTIP2;1 一致，但不同于CeTIP2;1 的T-S-A-Y-I 和SoPIP2;1 的M-S-A-F-W。與SoPIP2;1 相比，CeTIP4;1、CeTIP1;1 和AtTIP2;1具有較短的N 端，且僅含有對應于SoPIP2;1 的S96 磷酸化位點；CeTIP4;1 的LC 區(qū)含有一個對應于AtTIP2;1 的H131 組氨酸，而CeTIP1;1 和SoPIP2;1 的相應位點分別為F 和N（圖1C）。與CeTIP1;1、CeTIP2;1AtTIP2;1 和SoPIP2;1 類似，CeTIP4;1 的二級結構以無規(guī)則卷曲和α-螺旋為主，分別占36.80%和36.00%（表1）?；贏tTIP2;1的同源建模顯示，CeTIP4;1 含有6 個跨膜螺旋，且可形成同源四聚體（圖1D）。

2.2 CeTIP4;1 進化分析

為確認CeTIP4;1 的進化關系，本研究將其與已報道的AtTIP[11]和OsTIP[32]構建如圖1E 所示的無根進化樹。結果顯示，這些蛋白被聚為5 組，分別對應于前期報道的TIP1～TIP5[11]，其中，CeTIP4;1與擬南芥和水稻中的TIP4 亞類聚在一起，其與AtTIP4;1、OsTIP4;1、OsTIP4;2 和OsTIP4;3 的序列相似性分別為78.57%、71.71%、69.62%和82.94%。以上結果證實CeTIP4;1 屬于AtTIP4;1的直系同源基因，而水稻中的3 個成員可能在其與油莎豆分化之后產生。

2.3 CeTIP4;1 亞細胞定位分析

為揭示CeTIP4;1 所起的功能部位，利用含pNC-Cam1304-CeTIP4;1 的農桿菌工程菌對煙草葉片進行瞬時轉化，共聚焦顯微鏡觀察結果如圖2 所示。雖然Plant-mPLoc 預測CeTIP4;1 定位在液泡膜，但本研究結果顯示其定位在細胞膜，并與細胞膜標記HbPIP2;3-RFP 的紅色熒光信號高度重合。

2.4 CeTIP4;1 基因表達分析

如圖3A 所示，轉錄譜分析顯示CeTIP4;1 主要在塊莖、根、匍匐莖和芽尖中表達，而在幼嫩葉片、葉鞘和成熟葉片中的表達量極低，表現(xiàn)出明顯的組織特異性。為進一步揭示基因在塊莖發(fā)育過程中的表達模式，本研究選取起始期、膨大中期、膨大晚期和成熟期等4 個典型的時期進行qRT-PCR 分析，結果顯示，CeTIP4;1 在4 個典型時期的表達量呈先升后降的趨勢，峰值出現(xiàn)在膨大中期，最低的是成熟期（圖3B）。

3 討論

在植物中，細胞的水分平衡主要由細胞膜定位的PIP 和液泡膜定位的TIP 介導[1， 33]。PIP 高度保守，僅存在2 個進化小組，相比而言，TIP高度分化，其在高等植物中至少存在5 個進化小組[3， 11， 32， 34-37]。本研究報道的CeTIP4;1 隸屬于TIP4 亞組，其與AtTIP4;1、OsTIP4;1、OsTIP4;2和OsTIP4;3 在蛋白水平的相似性介于69.62%～82.94%，且在進化分析中被聚在一起，推測它們可能具有類似的生物學功能。CeTIP4;1 含有2 個內含子，這與AtTIP4;1 和OsTIP4;1 一樣，但不同于僅含有1 個內含子的OsTIP4;2 和OsTIP4;3[11， 32]。蓖麻（ Ricinus communis ）、麻瘋樹（ Jatrophacurcas）、木薯（Manihot esculenta）、橡膠樹（Heveabrasiliensis）和楊樹（Populus trichocarpa）等植物中的TIP4 成員均含有2 個內含子，且內含子位置高度保守[11， 34-37]，這極可能是OsTIP4;2 和OsTIP4;3 的第2 內含子發(fā)生了丟失， 而非CeTIP4;1 和OsTIP4;1 獲得了新的內含子。

CeTIP4;1 含有1 個保守的MIP 結構域，其中包含6 個跨膜螺旋、2 個半螺旋以及2 個典型的NPA 基序，且具有與AtTIP4;1 和OsTIP4;3 完全一樣的ar/R 選擇性濾器（即H-I-A-R），其孔徑大小與AtTIP1;1 相當（0.72 ? vs 0.67 ?）[15]，推測CeTIP4;1 可能具有AtTIP1;1 類似的水分轉運活性。事實上，AtTIP4;1 和OsTIP4;1 均已被證實具有高效的水分轉運活性[5， 9]。相比于SoPIP2;1[12]，CeTIP4;1 與AtTIP2;1[10]的結構比較接近，且其LC 區(qū)含有1 個與NH3 轉運所必須的H 殘基[10]，推測CeTIP4;1 可能具有高效的NH3 轉運活性。此外， 研究還顯示AtTIP4;1 可以轉運尿素[5]，OsTIP4;1 可以轉運甘油[9]。

在擬南芥原生質中的亞細胞定位分析顯示AtTIP4;1 主要定位在液泡[5]，而本研究結果顯示CeTIP4;1 定位在煙草葉片的細胞膜，其中的原由還有待進一步研究?？赡艿脑蚴牵海?）TIP4 的亞細胞定位與組織類型有關，其中包括液泡的類型與數量，前人用的是原生質[5]，而本研究用的是幼嫩的煙草葉片；（2）TIP4 原本定位在液泡，但可以與PIP 互作從而定位到細胞膜，因為有研究顯示AtTIP1;2、AtTIP2;1 和AtTIP3;1 均可與AtPIP2;1 互作[38]；（3）CeTIP4;1 本身就定位在細胞膜，但這與其pI<7 的酸性特性不太相符。

作為主要塊莖表達的TIP1 基因，CeTIP4;1同時被發(fā)現(xiàn)在根、匍匐莖、芽尖中也有較高水平的表達，卻很少在光合組織葉片和葉鞘中表達，這與CeTIP1;1 和CeTIP2;1 的組成型高水平表達不同[27-28]。在塊莖發(fā)育過程中， CeTIP4;1 與CeTIP1;1 和CeTIP2;1 均表現(xiàn)出鐘型趨勢，但峰值出現(xiàn)不同，CeTIP4;1 和CeTIP2;1 較早，出現(xiàn)在膨大中期，而CeTIP1;1 出現(xiàn)在膨大晚期；此外，CeTIP4;1 和CeTIP2;1 在成熟期的表達量顯著低于起始期，而CeTIP1;1 在起始期和成熟期的表達量差異不顯著[27-28]。這表明CeTIP4;1 與CeTIP2;1類似，主要在塊莖發(fā)育前期起作用，同時也解釋了CeTIP4;1 未能在成熟塊莖的蛋白組中被鑒定到的原因[19]。與CeTIP1;1 相比，CeTIP4;1 在塊莖發(fā)育過程中的表達模式與含水量趨勢更為吻合，因為在本研究分析的4 個時期中，起始期和膨大中期的含水量約為85%，膨大晚期為75%，成熟期為45%[24]。

綜上，本研究首次報道了1個油莎豆TIP4 基因CeTIP4;1，該基因含有2 個保守的內含子，為AtTIP4;1 的直系同源基因；CeTIP4;1 定位在細胞膜，具有AtTIP2;1 類似的理化特性和結構特征；CeTIP4;1 的表達具有明顯的組織特異性，且其在塊莖發(fā)育過程中的表達模式與含水量趨勢基本吻合。本研究結果為深入解析油莎豆塊莖的水分平衡機制及遺傳改良奠定堅實的基礎。