摘 要： 旨在對福建莆田某養(yǎng)殖場疑似感染鴨傳染性漿膜炎患病番鴨病料進行菌株的分離、純化、鑒定和致病性分析。采集10日齡患病番鴨的腦、肝組織進行菌株分離純化、16S rDNA PCR鑒定和血清型鑒定，并檢測分離純化菌株的致病性。結果得到2株11型鴨疫里氏桿菌，分別將其命名為LC1和CX1。對2株分離株進行16S rDNA序列測序，開展遺傳進化分析和MLST分型，發(fā)現(xiàn)LC1和CX1分離株16S rDNA遺傳進化上與鴨疫里氏桿菌福建分離株RAf115和上海分離株Yb2處在同一進化分支上，相似性為99.9%。測定其耐藥性發(fā)現(xiàn)，分離株對β-內酰胺類、氯霉素類及四環(huán)素敏感，對大環(huán)內酯類和氨基糖苷類等抗菌素不敏感。進一步檢測該分離株對雛番鴨致病性，結果發(fā)現(xiàn)兩株菌株（1.3×106 CFU·mL－1）的致死率為100%，且病死鴨表現(xiàn)典型心包炎、肝周炎、氣囊炎和脾腫大的鴨疫里氏桿菌病。病理結果發(fā)現(xiàn)，致死鴨脾紅白髓界線消失，呈現(xiàn)大量壞死灶。此外，兩分離株致死鴨的心肌纖維呈撕裂狀病變。綜上，本研究分離并鑒定2株11型鴨疫里氏桿菌LC1和CX MLST分型分別為ST111、ST114，為鴨疫里氏桿菌病的防控及后續(xù)研究提供參考依據(jù)。

關鍵詞： 鴨疫里氏桿菌；LC1；CX1；遺傳進化分析；致病性

中圖分類號：S852.617

文獻標志碼：A 文章編號： 0366-6964（2024）09-4196-08

Isolation， Identification and Pathogenicity Analysis of Riemerella anatipestifer

Strain LC1 and CX1

XIE" Bilin "LIN" Zhimin "LIN" Binbin "XU" Yijuan "LIN" Fengqiang2， YAN" Lu2， WU" Huini2，

LI" Cuiting2， ZHOU" Haiou2， LI" Zhaolong2*

（1.Putian Institute of Agricultural Sciences， Putian 351100，" China;

2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Fujian Academy of

Agricultural Sciences， Fuzhou 350013，" China）

Abstract： In currently study， LC1 and CX1 of Riemerella anatipestifer type 11 were isolated and purified from the brain and liver tissue of 10-day-old ducks，The aim of this study was to isolate， purify， identify and analyze the pathogenicity of the strains from the disease material of Muscovy ducks which suspected to be infected with infectious serositis from a farm in Putian， Fujian Province， China. Brain and liver tissues of 10-day-old diseased Muscovy ducks were collected for strain isolation and purification， and 16S rDNA PCR identification and serotyping were conducted， respectively. The isolates were subjected to 16S rDNA sequencing and genetic evolutionary analyses， and their drug resistance and pathogenicity to ducklings were determined. The 16S rDNA sequence sequencing and genetic evolution of these isolates were analyzed， and their drug resistance and pathogenicity to ducklings were further determined. （Results） The results showed that 2 strains of Riemerella anatipestifer type 11 were obtained and named as LC1 and CX1. The 16S rDNA sequences of LC1 and CX1 showed that the isolates were in the same evolutionary branch as the reference strains of Riemerella anatipestifer Fujian strain RAf115 and Shanghai strain Yb2， with 99.9% similarity. The isolates were sensitive to β-lactams， chloramphenicol， and tetracyclines， but less sensitive to macrolides and aminoglycosides. The pathogenicity assay indicated that the mortality of the two strains （1.3×106 CFU·mL-1） was 100%， and the lethal ducks showed the typical Riemer’s disease with pericarditis， perihepatitis， and enlarged spleen.The pathology results of the HE staining showed that the red-white medullary boundary of the spleen of the lethal ducks disappeared， and a large number of necrotic foci were presented. In addition， myocardial fibers of lethal ducks from the two isolates showed tear-like lesions. These datas demonstrated that two strains of Riemerella anatipestifer type 11 LC1 and CX1 were isolated and characterized， MLST to be ST111 and ST114， respectively， which provide reference basis for the prevention and control of Riemerella anatipestifer disease and subsequent research.

Key words： Riemerella anatipestifer; LC1; CX1; genetic evolution analysis; pathogenicity

*Corresponding author： LI Zhaolong，E-mail： lizhaolong522@163.com

鴨傳染性漿膜炎的病原為鴨疫里氏桿菌（Riemerella anatipestifer， RA），是一種以心包炎、肝周炎、氣囊炎（俗稱“三炎”）為病理變化的接觸性，急性敗血癥的傳染病。它是一種不運動、無芽孢的革蘭陰性短桿菌［1］，能感染鴨、鵝和火雞等［2-3］，國內學者郭玉璞等［4］曾從北京的商品鴨場首次分離到1型RA并確診為鴨傳染性漿膜炎。近年來RA感染的報道常見于文獻，其高致死率給養(yǎng)殖戶造成巨大的經(jīng)濟損失，是危害水禽養(yǎng)殖業(yè)的重要致病菌之一［5-8］。

由于RA是一種多血清型病原，且各血清型間無交叉保護性［9］，通過研制疫苗防控該病相對困難，因此，掌握發(fā)病地RA流行菌株的血清型分布顯得非常必要。此外，當前臨床上多用抗生素來預防和治療RA病，但由于抗生素的不合理使用，導致RA菌株耐藥性高和耐藥基因傳播廣，多重耐藥現(xiàn)象頻現(xiàn)［10］。因此，開展分離菌株的耐藥性研究對該病的防治具有重大的意義。本研究對分離自莆田地區(qū)的2株鴨疫里氏桿菌進行鑒定，并開展耐藥性及血清型等方面研究，以期為本地區(qū)的RA病的防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、麥康凱瓊脂購自北京索萊寶科技有限公司；新生胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司，藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司，細菌基因組提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，2×Taq PCR MasterMix、DL2000 DNA Marker、GeneRed核酸染料、瓊脂糖、TE緩沖液購自生工生物公司；試驗所使用引物的合成和測序工作均由生工生物公司完成。鴨疫里氏桿菌血清分型的標準血清及大腸桿菌ATCC 25922菌株由福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所惠贈。

1.2 病例

病料組織分別采集自福建省莆田市荔城區(qū)和城廂區(qū)的番鴨養(yǎng)殖場。番鴨的臨床癥狀為跛行、神經(jīng)癥狀、急性死亡等情況，剖檢見心包炎、氣囊炎和肝周炎，脾腫大，呈大理石樣病變。

1.3 細菌分離及鑒定

無菌操作采集病鴨腦部、肝等組織，用無菌接種環(huán)輕觸組織表面，三區(qū)劃線法接種至含有2%胎牛血清的TSA（下文中使用的TSA/TSB中均含有2%胎牛血清，不再重新標注）培養(yǎng)皿中，于CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24～48 h，隨后挑取疑似鴨疫里氏桿菌于TSB液體培養(yǎng)基中，置37 ℃搖床160 r·min－1振蕩培養(yǎng)24 h。用無菌接種環(huán)蘸取液體培養(yǎng)液，劃線到TSA培養(yǎng)皿中，如此操作3次后，獲得純培養(yǎng)物，并對其進行革蘭染色鑒定。分離菌的TSB培養(yǎng)物在30%的甘油保存液中-80℃凍存。

1.4 PCR鑒定及血清型分型

按照細菌基因組提取試劑盒說明，提取分離菌的核酸，用80 μL洗脫液溶解后存-20 ℃?zhèn)溆?。參考文獻［11］，合成鴨疫里氏桿菌PCR鑒定特異性引物（RA-F：CTTCGGATACTTGAGAGCG，RA-R：GCAGCACCTTGAAAATTGT），稀釋到10 μmol·L－1凍存?zhèn)溆?。應用以上引物對單一菌落純培養(yǎng)物進行鑒定，PCR反應體系及反應程序參照文獻［11］進行。采用瓊脂擴散法［12-13］開展分離菌的血清型分型鑒定。

1.5 生化特性鑒定

用微量移液槍吸取5 μL分離菌純培養(yǎng)物分別接種至生化反應管內，反應管包括葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、蛋白胨水、葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水、枸櫞酸鹽、硝酸鹽還原、硫化氫、明膠、精氨酸、賴氨酸、尿素和氧化酶等，置37 ℃ CO2培養(yǎng)24～48 h，觀測結果并記錄。

1.6 分離株的藥敏試驗

根據(jù)臨床實驗室標準化委員會（CLSI）抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標準，采用K-B紙片法，以大腸桿菌ATCC 25922菌株為質控，對分離菌進行β-內酰胺類、磺胺類、四環(huán)素類、氨基糖苷類、大環(huán)內酯類、多肽類和酰胺醇類的部分抗菌藥物的藥敏試驗。

吸取120 μL分離菌培養(yǎng)液（1.3×108 CFU·mL－1），用無菌涂布棒在TSA平板上均勻涂抹，待無明顯液體后，將藥敏紙片均勻敷貼在平板上，在含5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，觀測并記錄抑菌情況。

1.7 MLST分型

依據(jù)參考文獻［14］報道的鴨疫里氏桿菌的7個管家基因的引物序列，合成相應管家基因的引物（dnaB，groEL，gyrA，mdh，gluD，gpi，rpoB，具體序列見表1），對分離株進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，陽性樣品送生物公司測序。測序返回的序列經(jīng)拼接后，與數(shù)據(jù)庫（https：//pubmlst.org/）進行比對，獲取分離株的ST分型數(shù)據(jù)。

1.8 分離株的雛番鴨回歸試驗

挑取鴨疫里氏桿菌純培養(yǎng)單菌落至TSB中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)增長期，6 000×g離心10 min，棄去上清，用移液器吸取無菌PBS吹吸沉淀重懸并離心，重復2次后用無菌PBS調整至合適濃度存4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

購買規(guī)模養(yǎng)殖場的7日齡健康番鴨45只，隨機分成3組，每組15只，按照常規(guī)飼養(yǎng)7 d。其中一組以無菌PBS腿肌注射，其余2組分別以1.3×106 CFU·mL－1腿肌注射感染分離菌株，每只注射1 mL。感染后予以觀察1周，每天3次，記錄雛番鴨癥狀和死亡情況。

2 結 果

2.1 細菌分離及鑒定

三區(qū)劃線的TSA平板上長有半透明圓形菌落，邊緣整齊，直徑為1 mm左右的菌落。經(jīng)革蘭染色鑒定，分離菌為革蘭陰性的短桿菌，分別命名為LC1和CX1。

2.2 PCR鑒定及血清型分型

對分離菌進行PCR鑒定，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在960 bp處有條帶（圖1A）。將PCR擴增產(chǎn)物送生物公司測序，返回的序列拼接后于NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對，與鴨疫里氏桿菌的序列相似性超過99%，確定以上2株分離菌均為鴨疫里氏桿菌（分離株的序列信息已上傳至國家基因組科學數(shù)據(jù)中心https：//ngdc.cncb.ac.cn/，LC1登錄號：0002618; CX1登錄號：0002624），系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1B。鴨疫里氏桿菌福建分離株RAf115和上海分離株Yb2處在同一進化分支上，相似性為99.9%。瓊脂擴散法鑒定分離株的血清型，以上2株分離株均為11型。

2.3 生化特性

對2株分離菌生化特性鑒定后發(fā)現(xiàn)，其生化特性相同，均不發(fā)酵糖類（葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇和蔗糖），枸櫞酸鹽、靛基質、MR-VP、硝酸鹽還原等試驗均為陰性，未能液化明膠，不產(chǎn)生硫化氫，氧化酶試驗陽性，符合鴨疫里氏桿菌的生化特性。

2.4 分離株的耐藥表型

K-B紙片法測定分離株對抗菌藥的耐藥情況，試驗結果見表2。結果表明，分離株對β-內酰胺類的青霉素G、氨芐西林、頭孢曲松，酰胺醇類的氟苯尼考及四環(huán)素的四環(huán)素和強力霉素等敏感，對氨基糖苷類的慶大霉素、艾米卡星和新霉素，大環(huán)內酯類和磺胺類的部分抗菌素不敏感。

2.5 MLST分型

LC1和CX1分離株的7對管家基因引物的擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖電泳顯示，分別在570、519、797、532、769、575和686 bp處有相應的條帶（圖2），與文獻報道［14］一致。

測序返回的序列經(jīng)過拼接后，將基因序列提交到MLST網(wǎng)站［15］比對，在數(shù)據(jù)庫中未查詢到管家基因組合的ST分型，提示分離株為新的ST分型。將分離株的管家基因序列上傳數(shù)據(jù)庫后，新分配的ST分型見表3。

2.6 LC1和CX1分離株的致病性試驗

LC1和CX1分離株分別接種15只14日齡雛番鴨后能夠復制鴨傳染性漿膜炎的臨床典型癥狀，主要表現(xiàn)為精神萎靡，采食量降低、不喜飲水甚至廢絕，排綠色糞便，24 h內出現(xiàn)少食或拒食，行走不穩(wěn)。48 h部分鴨子出現(xiàn)共濟失調、頭頸震顫、轉圈、角弓反張等神經(jīng)癥狀。在接種48 h后試驗雛番鴨開始出現(xiàn)死亡，發(fā)病率100%，至試驗結束共死亡30只，死亡率100% （圖3）；對照組試驗雛番鴨無死亡，精神狀態(tài)和飲食均正常。

病死試驗雛番鴨剖檢肉眼可見心及心包、肝表面均有白色的纖維素沉著，氣囊混濁增厚，有干酪樣的纖維素性滲出物，膽囊充盈、脾腫大等。圖4所示的脾臟HE染色顯示，LC1和CX1分離株導致雛番鴨脾紅髓白髓界線不清，生發(fā)中心不明顯，脾臟嗜堿性粒細胞數(shù)量大增，并出現(xiàn)明顯的破裂和死亡（圖4）。此外，致死番鴨心肌纖維呈撕裂樣病變，肝細胞腫脹，間隙大。從鴨疫里氏桿菌分離株攻毒試驗的雛番鴨病變組織中均可分離鑒定到攻毒菌，革蘭染色呈陰性短小桿菌，生化試驗鑒定結果與分離株一致。因此，根據(jù)LC1和CX1的分離鑒定結果和敏感動物的回歸試驗，確定從莆田雛番鴨養(yǎng)殖場中分離得到2株鴨疫里氏桿菌。

3 討 論

鴨疫里氏桿菌的血清型較多，有25種血清型，且在各省份的流行優(yōu)勢血清型不盡相同［9］。據(jù)文獻報道，吉林省主要流行1型和2型，福建省主要以2型和11型為主，貴州三穗?yún)^(qū)流行2型菌株［16］。因血清型之間缺乏交叉保護，鴨疫里氏桿菌病的防控較為困難，該病已成為危害水禽養(yǎng)殖行業(yè)最為嚴重的疫病之一。

當前各地區(qū)防控鴨疫里氏桿菌病首要任務是確定各自發(fā)病菌株的血清型及敏感抗菌素，隨后才能制訂完善的免疫計劃或采用相對應的抗菌素予以治療，降低經(jīng)濟損失。但由于藥敏試驗的滯后性和繁瑣性，導致大部分番鴨養(yǎng)殖業(yè)主在日常飲水中盲目添加抗菌素，因此臨床上抗菌素的不合理治療造成細菌耐抗菌素的種類越來越多。開展鴨疫里氏桿菌病細菌耐藥譜的研究，是當前防控該病的首要任務。陸續(xù)有報道鴨疫里氏桿菌分離株對大環(huán)內酯類、氨基糖苷類等多種抗菌素不敏感，對β-內酰胺類、四環(huán)素類等抗菌素敏感［10，17］。本研究分離自兩個番鴨養(yǎng)殖場的2株鴨疫里氏桿菌，經(jīng)PCR鑒定和生化試驗，血清型均為11型，對β-內酰胺類、氯霉素類及四環(huán)素類敏感，分離株對抗菌藥的敏感性與林彬彬等［12］研究報道一致。

多位點序列分型（MLST）技術是通過分析菌株的酶管家基因序列，準確記錄細菌基因水平上的進化，以揭示分離株的地理來源及進化時間，且分型信息可以方便地在不同實驗室間進行共享，可用于細菌的流行病學和進化等方面的研究［14，18］。本研究通過PCR方法克隆出RA的7個管家基因，提交到數(shù)據(jù)庫未獲得ST分型號，提示分離的菌株可能為新的ST型。在MLST數(shù)據(jù)庫查詢到4個ST型與本研究分離的2株RA菌株僅有1個管家基因（gpi）的差異，說明RA在一定的范圍內發(fā)生基因突變。2株分離菌與福建分離株RAf115和上海分離株Yb2處在同一進化分支上，具有較高的同源性。

鴨感染RA的不同血清型菌株的臨床癥狀和解剖病變大體一致，心、肝和氣囊等臟器均有纖維性沉著現(xiàn)象［19］。陳國權等［20］分離鑒定的11型RA動物回歸試驗的結果顯示，攻毒的鴨子出現(xiàn)頭頸歪斜，角弓反張等神經(jīng)癥狀，解剖見心、肝、氣囊有纖維素附著；組織切片見心外膜，肝脾被膜外滲出的纖維素中有白細胞聚集的現(xiàn)象。本研究為了進一步驗證分離株的毒力情況，將分離株進行敏感動物回歸試驗，能夠成功復現(xiàn)鴨疫里氏桿菌的典型臨床癥狀和組織病變。感染后的鴨子出現(xiàn)不同程度的少食、行走不穩(wěn)、共濟失調等臨床癥狀；解剖病死鴨子發(fā)現(xiàn)鴨傳染性漿膜炎典型的“三炎”病變，肝脾腫大，心、肝和脾組織切片HE染色圖可見不同程度的病變和白細胞聚集，進一步證實了該分離株的毒力。

由于鴨疫里氏桿菌具有多血清型且無交叉保護性的特點，應用滅活全菌疫苗在預防該疫病的其他血清型顯得無能為力，但是安全有效的疫苗仍然是防控鴨疫里氏桿菌病較理想的途徑。

4 結 論

本研究成功地從兩個番鴨養(yǎng)殖場分離得到2株鴨疫里氏桿菌，分離株的血清型均為11型，經(jīng)過動物回歸試驗，證明該分離株具有強的致病性。通過K-B法分析，該2株分離株對β-內酰胺類的青霉素G、氨芐西林、頭孢曲松，酰胺醇類的氟苯尼考及四環(huán)素類和強力霉素等敏感，對氨基糖苷類的慶大霉素、阿米卡星和新霉素，大環(huán)內酯類和磺胺類的部分抗菌素缺乏敏感，為臨床患病的鴨場治療提供用藥指導。ST分型特性為鴨疫里氏桿菌的流行病學調查和細菌的跨區(qū)域傳播普查提供依據(jù)。

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（編輯 范子娟）