摘 要： 旨在研究白藜蘆醇對輪狀病毒（porcine rotavirus，PoRV）感染豬腸上皮細胞的抗病毒作用。本試驗以豬腸上皮細胞（IPEC-J2）為研究對象，先測定不同白藜蘆醇濃度對IPEC-J2細胞活力的影響，再根據(jù)是否用PoRV或白藜蘆醇（100 μmol·L-1）處理IPEC-J2細胞，分別設(shè)置陰性對照組、PoRV感染組和不同時間段添加白藜蘆醇+PoRV感染組。通過實時熒光定量PCR技術(shù)、病毒滴度測定法和蛋白免疫印跡法檢測PoRV在IPEC-J2細胞的復(fù)制與增殖情況。結(jié)果表明：1）在PoRV感染IPEC-J2的后期和全期添加白藜蘆醇（100 μmol·L-1）可顯著抑制PoRV的感染和復(fù)制（Plt;0.05）；2）與PoRV感染組相比，在PoRV感染IPEC-J2的全期添加白藜蘆醇（100 μmol·L-1）可極顯著抑制IPEC-J2細胞上清液中炎癥細胞因子IL-1β、IL-10、TNF-α和IFN-β的含量（Plt;0.01），后期添加白藜蘆醇可顯著抑制IL-10和IFN-β的含量（Plt;0.05）；

后期和全期添加白藜蘆醇極顯著抑制了IPEC-J2細胞中的免疫相關(guān)因子MDA5、RIG-I、TRIF、MAVS、LGALS9、EIF2AK2、IRF9和IFI44L的mRNA相對表達量（Plt;0.01），極顯著抑制了IPEC-J2細胞中可變剪接因子SRPK1、SRPK2、HNRNPC和HNRNPR的mRNA相對表達量（Plt;0.01）；3）與陰性對照組相比，PoRV感染顯著促進了IPEC-J2細胞中LGALS9的5號外顯子和EF2AK2的2號外顯子發(fā)生外顯子跳躍，而在PoRV感染IPEC-J2的后期和全期添加白藜蘆醇（100 μmol·L-1）可顯著抑制靶基因發(fā)生外顯子跳躍。綜上證實，本研究添加100 μmol·L-1白藜蘆醇可抑制PoRV對IPEC-J2細胞的感染和復(fù)制，且在PoRV感染后的維持階段發(fā)揮作用，可為預(yù)防和治療仔豬病毒性腹瀉提供新的依據(jù)和參考。

關(guān)鍵詞： 白藜蘆醇；豬輪狀病毒；抗病毒；可變剪接

中圖分類號： S828.9

文獻標志碼：A 文章編號： 0366-6964（2024）09-4213-13

Inhibitory Effect of Resveratrol on Rotavirus-infected Porcine Intestinal Epithelial

Cells IPEC-J2

PENG" Ning， LIANG" Yaxu， LONG" Fei， YU" Dongming， ZHONG" Xiang*

（College of Animal Science and Technology， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095，" China）

Abstract：" The aim of this study was to investigate the antiviral effect of resveratrol on porcine rotavirus （PoRV） infected porcine intestinal epithelial cells（IPEC-J2）. In this experiment， IPEC-J2 cells were used as research object. Firstly， the effect of different concentration of resveratrol on the cell viability of IPEC-J2 was determined. Then experimental groups including negative control group， PoRV-infected group and PoRV-infected group with the addition of resveratrol at different time points were set up depending on whether the IPEC-J2 cells were treated with PoRV or resveratrol （100 μmol·L-1）. The replication and proliferation of PoRV in IPEC-J2 cells were detected by real-time fluorescence quantitative PCR， viral titer assay and Western blot. The results showed that： 1） The addition of resveratrol （100 μmol·L-1） significantly inhibited PoRV replication and infection at the late and full phases of viral infection of PoRV infection with IPEC-J2 （Plt;0.05）; 2） Compared with the PoRV-infected group， the addition of resveratrol （100 μmol·L-1） during the full phase of PoRV-infected IPEC-J2 extremely significantly suppressed the levels of inflammatory cytokines IL-1β， IL-10， TNF-α and IFN-β in the supernatant fluid of IPEC-J2 cells （Plt;0.01）， while significantly suppressed the IL-10 and IFN-β levels during the late phase （Plt;0.05）; Extremely significantly suppressed the relative expression of immune-related factors MDA5， RIG-I， TRIF， MAVS， LGALS9， EIF2AK2， IRF9 and IFI44L in IPEC-J2 cells （Plt;0.01） during late and full phases; Extremely significantly suppressed the relative mRNA expression of variable splicing factors SRPK "SRPK2， HNRNPC and HNRNPR in IPEC-J2 cells （Plt;0.01） during late and full phases; 3）Compared with the negative control group， PoRV infection significantly promoted exon jumps in exon 5 of LGALS9 and exon 2 of EF2AK2 in IPEC-J2 cells， while the addition of resveratrol （100 μmol·L-1） significantly inhibited the exon skipping of target genes in the late and full phases of PoRV infection IPEC-J2 cells. In conclusion， this study confirmed that the addition of 100 μmol·L-1 resveratrol could inhibit the infection and replication of PoRV in IPEC-J2 cells and play a role in the late phases of PoRV replication， which can provide a new basis and reference for the prevention and treatment of viral diarrhea in piglets.

Key words： resveratrol; porcine rotavirus; antiviral; alternative splicing

*Corresponding author： ZHONG Xiang，E-mail： zhongxiang@njau.edu.cn

豬輪狀病毒（porcine rotavirus，PoRV）是引起低齡仔豬發(fā)生急性胃腸炎的主要病毒之一，一般通過接觸病畜的排泄物后經(jīng)糞口途徑進行傳播［1-2］。PoRV感染可引起仔豬嘔吐、厭食、腹瀉，嚴重導(dǎo)致死亡，給我國畜牧業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失［3-4］。PoRV是屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，電子顯微鏡下呈車輪狀，是無囊膜的雙鏈核糖核酸（dsRNA）病毒，包含11段dsRNA基因組，分別編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白VP1～VP4、VP6、VP7 和6種非結(jié)構(gòu)蛋白NSP1～NSP6［5］。其中，NSP5和VP6是病毒入侵和復(fù)制的重要組成部分?？勺兗羟性诟叩日婧松镏袕V泛存在，人類幾乎所有的基因都是交替剪接的［6］。很多證據(jù)表明，多種病毒感染可影響宿主細胞的可變剪切［7-8］。大約10%的人類癌癥與致癌病毒感染有關(guān)，這些致癌病毒需要宿主RNA剪接機制才能發(fā)揮其致癌活性［9-10］。在病毒感染期間，宿主的可變剪切的調(diào)節(jié)可能由病毒蛋白或RNA直接引起，或可能由細胞自身觸發(fā)，作為對抗病毒的自我防御機制［11-12］。

可變剪接（alternative splicing，AS）是指從一個mRNA前體中通過不同的剪接方式（選擇不同的剪接位點組合）產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體的過程［13］。AS分為不同類型，包括外顯子跳躍、內(nèi)含子保留、替代3′剪接位點、替代5′剪接位點和互斥外顯子［14］。研究表明，人類免疫缺陷病毒通過選擇性剪接產(chǎn)生額外的病毒蛋白，病毒的感染性可通過細胞蛋白與剪接增強子和沉默子的結(jié)合來調(diào)節(jié)［15］；甲型流感病毒（IAV）的mRNA（M和NS）經(jīng)過選擇性剪接，然后從細胞核輸出，從而產(chǎn)生不同毒力的病毒［16］。因此，從可變剪切的方向研究豬輪狀病毒是可行的。

白藜蘆醇是一種植物來源的多酚類化合物，可從不同品種植物中獲得，其中，葡萄、虎杖、花生等藥用植物中的含量較高［17-18］。白藜蘆醇具有抗炎、抗氧化、抗衰老、抗癌、抗病毒等多種功能［19-20］，在養(yǎng)殖業(yè)減抗、替抗的大環(huán)境下，白藜蘆醇具有良好的應(yīng)用前景［17］。研究表明，白藜蘆醇可以在體內(nèi)和體外抑制單純皰疹病毒（HSV）感染，當(dāng)在體外感染后1 h內(nèi)添加白藜蘆醇時，表現(xiàn)出抗HSV活性［21］；在體外，白藜蘆醇以劑量依賴性方式有效抑制偽狂犬病病毒復(fù)制，也可以緩解感染偽狂犬病病毒仔豬的炎癥，減少病理變化并增強免疫力［22］；白藜蘆醇以劑量依賴性方式抑制寨卡病毒的復(fù)制，當(dāng)用80 μmol·L-1白藜蘆醇處理感染細胞時，病毒滴度和病毒mRNA拷貝數(shù)顯著降低［23］。越來越多的研究表明，白藜蘆醇有很好抗病毒作用［24-25］，但白藜蘆醇是否能抑制豬輪狀病毒的復(fù)制和入侵，及其作用機制還不明確，有研究表明，白藜蘆醇具有調(diào)控可變剪切的作用，比如白藜蘆醇可以廣泛影響HNRNPA1相關(guān)的前mRNA剪接途徑［26］，白藜蘆醇緩解了Htau小鼠tau外顯子10剪接的失調(diào)，挽救了Htau小鼠空間記憶的缺陷［27］，那么白藜蘆醇發(fā)揮抗病毒作用是否通過影響宿主的可變剪切尚未清楚。因此，本文通過篩選合適的白藜蘆醇濃度，研究其是否能夠抑制豬輪狀病毒的復(fù)制，并通過對免疫、炎癥和可變剪接方面進行探討，旨在揭示白藜蘆醇的抗病毒機制，為研究豬輪狀病毒提供新的研究方向，同時為生產(chǎn)抗病毒藥物或飼料添加劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

G9P7型PoRV毒株NJ2012和PoRV NSP5基因陽性標準品，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所人獸共患病防控研究室李彬研究員惠贈；IPEC-J2細胞和Vero細胞均由本實驗室保存?zhèn)鞔?。DMEM/F12（1∶1）培養(yǎng)基購自HyClone公司；胎牛血清（FBS）、Trypsin-EDTA（0.25%）溶液和青霉素-鏈霉素溶液均購自Gibco公司；1×PBS緩沖液、胰蛋白酶（1∶250）、二甲基亞砜（DMSO）和無菌無酶水（DNase/RNase-free H2O）均購自索萊寶公司；白藜蘆醇購自Sigma-Aldrich公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑購自APExBIO公司；RNA isolater總RNA提取試劑盒、HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）反轉(zhuǎn)錄試劑盒和ChamQTM SYBR qPCR Master Mix熒光定量PCR試劑盒均購自諾唯贊公司，其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 病毒的感染與擴繁

IPEC-J2細胞培養(yǎng)24～48 h，長滿至單層貼壁。取適量溶于DMEM/F12中的PoRV，加入胰蛋白酶并使其終濃度為10 μg·mL- 37℃金屬浴30 min以激活PoRV。用1×PBS緩沖液潤洗細胞2次，棄凈殘液，加入病毒-胰蛋白酶混合液，置于37℃和5% CO2條件下吸附1 h，期間每隔20 min搖動細胞培養(yǎng)瓶，使病毒均勻吸附。吸附結(jié)束后，再用1×PBS緩沖液潤洗細胞1次，棄凈殘液，加入含1 μg·mL-1胰蛋白酶的適量DMEM/F12作為細胞維持液，置于37℃和5% CO2條件下維持細胞至出現(xiàn)85%以上細胞病變效應(yīng)（CPE）。Vero細胞感染方法同IPEC-J2細胞。將感染后病變的Vero細胞置于-80℃和室溫下反復(fù)凍融3次，隨后5 000 r·min-1離心10 min，去除細胞沉淀，取上清液即為擴繁后的病毒。

1.3 病毒滴度的測定與PoRV基因拷貝數(shù)的測定

半數(shù)細胞培養(yǎng)物感染量（TCID50）法測定病毒滴度。將病毒溶于DMEM/F12中并連續(xù)作10倍梯度稀釋，從10-1稀釋至10-10。將稀釋后的病毒分別接種至96孔板的Vero細胞中，每一稀釋度接種一列共8孔，每孔接種100 μL。設(shè)置兩列未接種的正常細胞作為陰性對照。接種病毒后24 h觀察CPE，按照Reed-Muench兩氏法計算作為病毒滴度。計算方式如下：病毒滴度（-lg TCID50·mL-1）=（高于50%的病變率－50%）/（高于50%的病變率－低于50%的病變率）×稀釋度對數(shù)差+高于50%病變率的稀釋度對數(shù)。

分別用不同濃度的白藜蘆醇（0、10、20、40、60、100、μmol·L-1）預(yù)處理細24h后感染PoRV，觀察細胞病變反應(yīng)，收取細胞樣品，用于檢測病毒NSP5的mRNA相對表達量。

1.4 白藜蘆醇處理后IPEC-J2細胞活力的測定

將適量白藜蘆醇溶于DMSO中配制成100 mmol·L-1的貯存液，置于-20℃保存。在96孔板中接種1×104個IPEC-J2細胞，置于37℃和5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。將白藜蘆醇用DMSO稀釋至5、10、20、40、60、80、100、150、200、300、500 μmol·L-1。將不同濃度的白藜蘆醇稀釋液加入96孔板中，每種濃度各設(shè)置4個重復(fù)，并分別設(shè)置只含DMSO的對照孔和不做處理的空白孔。將96孔板置于37℃和5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。隨后每孔均加入10 μL CCK-8試劑，置于37℃和5% CO2條件下孵育1～4 h，再使用酶標儀測量450 nm處的吸光度。

1.5 不同時間段添加白藜蘆醇后對PoRV感染和復(fù)制的測定

為進一步探究白藜蘆醇影響PoRV感染的具體過程，分別在PoRV（MOI=0.1）感染的不同時間段添加白藜蘆醇處理IPEC-J2細胞。分組設(shè)置及處理方法如下：1）陰性對照組（NC）：各階段均不添加白藜蘆醇且不感染PoRV；2）陽性對照組（PoRV）：只接種PoRV，各階段均不添加白藜蘆醇；3）白藜蘆醇組：各階段均添加白藜蘆醇；4）感染前階段（前期）：在PoRV感染前添加白藜蘆醇預(yù)處理細胞24 h，1×PBS緩沖液潤洗后接種PoRV，置于37℃和5% CO2條件下維持24 h；5）藥物與病毒共處理階段（中期）：白藜蘆醇溶于病毒培養(yǎng)液中再感染細胞，吸附1 h，1×PBS緩沖液潤洗后置于37℃和5% CO2條件下維持24 h；6）感染后維持階段（后期）：PoRV感染細胞后，用含白藜蘆醇的細胞維持液在37℃和5% CO2條件下維持24 h；7）全階段（全期）：在感染前、藥物與病毒共處理和感染后階段，病毒、細胞培養(yǎng)液和維持液中均含有白藜蘆醇，置于37℃和5% CO2條件下維持24 h。每組3個重復(fù)。觀察各組細胞病變效應(yīng)，收取細胞RNA、蛋白樣品和病毒上清液，檢測病毒基因組拷貝數(shù)、病毒滴度和VP6蛋白表達。

1.6 感染后IPEC-J2細胞上清液中炎癥因子含量的測定

使用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）對細胞中子IL-1β、IL-10、TNF-α和IFN-β的含量進行檢測。首先，設(shè)置標準品孔和樣品孔，標準品孔各加入50 μL不同濃度的標準品，樣品孔加入10 μL待測樣品和40 μL樣品稀釋液。其次，每孔均加入100 μL辣根過氧化物酶標記的檢測抗體，置于37℃條件下孵育60 min。孵育結(jié)束后棄去液體，在吸水紙上拍干，每孔均加滿洗滌液，在室溫下靜置1 min，棄去洗滌液，在吸水紙上拍干，重復(fù)洗滌5次。洗滌結(jié)束后每孔均先后加入底物A和底物B各50 μL，置于37℃條件下避光孵育15 min。最后，每孔均加入50 μL終止液，在15 min內(nèi)使用酶標儀測量450 nm處的吸光度。根據(jù)吸光度數(shù)值繪制標準曲線并計算對應(yīng)樣品細胞炎癥因子含量。試驗分組同“1.5”類似（除去白藜蘆醇組）。

1.7 感染后IPEC-J2細胞RNA的提取和基因表達的測定

采用熒光定量PCR方法檢測病毒基因組拷貝數(shù)、IPEC-J2細胞的免疫和可變剪接因子相關(guān)基因的表達量。按照總RNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA，測定RNA濃度后進行濃度的統(tǒng)一，取1 μg總RNA作為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA，加入ddH2O對cDNA進行5倍稀釋，配制qPCR體系。qPCR體系如下：2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 5.0 μL，50×ROX Reference Dye I 0.2 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各0.2 μL，cDNA 2.0 μL，ddH2O 2.4 μL，共10 μL。qPCR反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性10 s，60℃退火30 s，40個循環(huán)后進行熔解曲線分析。以GAPDH為內(nèi)參基因?qū)颖具M行歸一化處理，每個樣本重復(fù)3次。采用2-ΔΔct法計算目的基因相對表達量。本試驗所用的引物序列如表1所示。

1.8 靶基因外顯子跳躍的測定

使用半定量PCR方法檢測靶基因外顯子跳躍型可變剪切。在發(fā)生外顯子跳躍的外顯子前后設(shè)計引物，以制備的cDNA為模版進入PCR擴增，25μL的反應(yīng)體系為：2×TB Green Premix Ex TaqI 12.5μL、正/反引物各1 μL、無菌無酶水8 μL、cDNA 2.5 μL。PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性1 min；95℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，共28個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR樣品在3%的瓊脂糖凝膠中電泳，在紫外燈下觀察，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存并計算。計算公式為：剪切百分比（percent spliced in，PSI）=外顯子跳躍部分/（外顯子跳躍部分+非外顯子跳躍部分）。

1.9 感染后IPEC-J2細胞蛋白的提取和蛋白含量的測定

使用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。首先，設(shè)置標準品孔和待測樣品孔，標準品孔中分別按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加入標準品，再加入RIPA裂解液補足至20 μL，而待測樣品孔中加入20 μL待測樣品。其次，每孔均加入200 μL BCA工作液，置于37℃條件下孵育20～30 min。最后使用酶標儀測量562 nm處的吸光度。根據(jù)吸光度數(shù)值繪制標準曲線并計算對應(yīng)樣品蛋白濃度。將蛋白濃度統(tǒng)一后加入5×上樣緩沖液，95℃金屬浴10 min使蛋白充分變性。

使用蛋白免疫印跡法（Western blot）測定目的蛋白含量。通過SDS-PAGE凝膠電泳將變性后的蛋白樣品進行濃縮和分離。電泳結(jié)束后進行濕法轉(zhuǎn)膜，將蛋白從凝膠上轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將PVDF膜置于5%的脫脂奶粉溶液中，室溫下置于搖床上封閉2 h。封閉結(jié)束后加入含有Tween-20的洗膜緩沖液（TBST），置于搖床上潤洗3～5次，每次5 min。潤洗結(jié)束后加入對應(yīng)蛋白一抗，4℃條件下置于搖床上孵育12 h。孵育結(jié)束后回收一抗，加入TBST，置于搖床上潤洗3～5次，每次5 min。潤洗結(jié)束后加入對應(yīng)二抗，室溫下置于搖床上孵育90 min。孵育結(jié)束后回收二抗，加入TBST，置于搖床上潤洗3～5次，每次5 min。潤洗結(jié)束后加入增強型化學(xué)發(fā)光液，使用超靈敏化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)對PVDF膜進行曝光。以GAPDH為內(nèi)參抗體。所用抗體信息見表2。

1.10 數(shù)據(jù)分析

本試驗數(shù)據(jù)均以“平均值±平均標準誤差（SEM）”表示，使用IBM SPSS Statistics 20軟件對試驗結(jié)果進行單因素ANOVA分析和獨立樣本t檢驗。利用GraphPad Prism 8.0軟件對統(tǒng)計結(jié)果進行圖表繪制。組間*均表示Plt;0.05，即差異顯著并具有統(tǒng)計學(xué)意義，**表示Plt;0.0 即差異極顯著并具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度的白藜蘆醇對IPEC-J2細胞活力的影響

為研究白藜蘆醇對IPEC-J2細胞的細胞活力作用，用不同濃度的白藜蘆醇（0、5、10、20、40、60、100、150、200、300和500μmol·L-1）處理IPEC-J2細胞24 h。如圖1所示，與不添加白藜蘆醇的對照組相比，白藜蘆醇濃度≤100 μmol·L-1時，對細胞活力影響不顯著（Pgt;0.05），但在白藜蘆醇濃度為150 μmol·L-1時，觀察到細胞活力極顯著降低（Plt;0.01），利用GraphPad Prism 8.0計算出白藜蘆醇對IPEC-J2的半數(shù)致死濃度CC50為（237.36±1.19）μmol·L-1。因此，選取100 μmol·L-1白藜蘆醇進行后續(xù)試驗。

2.2 不同階段添加白藜蘆醇對PoRV感染IPEC-J2細胞的影響

為研究不同階段添加白藜蘆醇對PoRV感染和復(fù)制的影響，本研究在PoRV感染前期、中期、后期和全期分別添加100 μmol·L-1白藜蘆醇處理IPEC-J2細胞，在感染后24 h時，觀察細胞病變效應(yīng)并檢測病毒滴度、病毒拷貝數(shù)和病毒蛋白表達。如圖2所示，與陽性對照組相比，在PoRV感染的后期和全期添加100 μmol·L-1白藜蘆醇可極顯著抑制PoRV的NSP5基因表達（圖2A）、顯著降低病毒滴度（圖2C）和極顯著降低VP6蛋白的表達（圖2B），在PoRV感染的后期添加不同濃度的白藜蘆醇，隨著白藜蘆醇濃度的增加（10、20、40、60和100 μmol·L-1）處理后，豬輪狀病毒拷貝數(shù)呈下降趨勢（圖2D）。

2.3 白藜蘆醇對PoRV感染IPEC-J2細胞炎癥細胞因子的影響

為評估白藜蘆醇是否能減輕PoRV誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，本研究對IPEC-J2細胞培養(yǎng)液中炎癥細胞因子的濃度進行了檢測。圖3表明，與陰性對照組相比，PoRV感染極顯著上調(diào)細胞培養(yǎng)液中IL-1β、IL-10、TNF-α和IFN-β的水平（Plt;0.01），而在后期添加100 μmol·L-1白藜蘆醇可顯著抑制PoRV導(dǎo)致的IL-10和IFN-β水平的上調(diào)（Plt;0.05），在全期添加100 μmol·L-1白藜蘆醇可極顯著抑制PoRV導(dǎo)致的炎癥因子水平的上調(diào)（Plt;0.01）。

2.4 白藜蘆醇對PoRV感染IPEC-J2細胞免疫調(diào)控因子的影響

通過實時熒光定量PCR檢測免疫相關(guān)基因的表達研究白藜蘆醇是否緩解PoRV誘導(dǎo)的免疫失調(diào)。如圖4所示，與對照組相比，添加白藜蘆醇顯著提高了細胞TRIF和IRF9的 mRNA表達（Plt;0.05，圖4A），PoRV感染顯著提高了細胞MDA5、RIG-I、TRIF、MAVS、LGALS9、EIF2AK2、IRF9和IFI44L的mRNA表達（Plt;0.01），而在后期和全期添加100 μmol·L-1白藜蘆醇可顯著抑制PoRV導(dǎo)致的免疫相關(guān)因子的高表達（Plt;0.0 圖4B）。

2.5 白藜蘆醇對PoRV感染IPEC-J2細胞可變剪接因子的影響

為研究白藜蘆醇是否改變PoRV誘導(dǎo)的可變剪接因子的表達，通過實時熒光定量PCR分析可變剪接因子相關(guān)基因的表達。如圖5所示，與對照組相比，添加白藜蘆醇顯著降低了細胞SRPK1的 mRNA表達（Plt;0.0 圖5A），PoRV感染顯著提高了細胞SRPK1、SRPK2、HNRNPC和HNRNR的mRNA的表達（Plt;0.01），而在后期和全期添加100 μmol·L-1白藜蘆醇可顯著抑制PoRV導(dǎo)致的可變剪接因子的表達（Plt;0.0 圖5B）。

2.6 白藜蘆醇對PoRV感染IPEC-J2細胞的靶基因的可變剪接的影響

為了研究白藜蘆醇是否改變PoRV誘導(dǎo)的靶基因的可變剪切，通過半定量PCR分析靶基因可變剪接（外顯子跳躍）變化。如圖6A所示，通過分析本實驗室前期對照組與輪狀病毒感染組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)得知（數(shù)據(jù)未發(fā)表），LGALS9在5號外顯子發(fā)生外顯子跳躍，EIF2AK2在2號外顯子發(fā)生外顯子跳躍。設(shè)計相應(yīng)引物，LGALS9在瓊脂糖凝膠電泳下形成232 bp和136 bp的PCR產(chǎn)物，EIF2AK2在瓊脂糖凝膠電泳下形成189 bp和103 bp的PCR產(chǎn)物。如圖6B所示，與對照組相比，PoRV感染后顯著提高了LGALS9的5號外顯子跳躍和EIF2AK2的2號外顯子跳躍后的PCR產(chǎn)物（Plt;0.01），而在后期和全期添加100 μmol·L-1白藜蘆醇可顯著抑制PoRV導(dǎo)致的外顯子跳躍的變化（Plt;0.01）。

3 討 論

輪狀病毒為呼腸孤病毒科、輪狀病毒屬，PoRV是一種腸致病性胃腸炎病毒，可引起仔豬嚴重腹瀉、嘔吐和高死亡率，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟損失［28-29］。腸上皮細胞是PoRV感染的主要靶點，PoRV在覆蓋豬小腸絨毛的腸細胞中復(fù)制，導(dǎo)致絨毛萎縮和隱窩增生，并損害患病仔豬的腸道屏障，PoRV感染的發(fā)病機制與炎癥密切相關(guān)［4，30］。本試驗結(jié)果表明，通過檢測病毒滴度、豬輪狀病毒的mRNA水平和蛋白水平，證明豬輪狀病毒入侵宿主并復(fù)制。感染PoRV的IPEC-J2細胞中促炎細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平顯著升高、免疫細胞產(chǎn)生的干擾素INF-β水平顯著上升，這表明豬輪狀病毒入侵宿主，造成宿主的免疫失調(diào)和炎癥反應(yīng)。當(dāng)細胞模式識別受體檢測到病原體相關(guān)分子模式時，抗病毒反應(yīng)開始，PoRV感染IPEC-J2細胞后，RIG-I和MDA-5檢測到病毒雙鏈RNA（dsRNA）后表達量上升，并經(jīng)歷構(gòu)象變化以與下游MAVS結(jié)合，MAVS與TANK結(jié)合激酶1和I-κB激酶ε結(jié)合，促進干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）和干擾素調(diào)節(jié)因子7（IRF7）的磷酸化［30］。這兩種轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)移到細胞核并驅(qū)動I型和III型干擾素（IFN）mRNA的轉(zhuǎn)錄和生產(chǎn)，從而使下游的IFI44L、IRF9、LGALS9的EIF2AK2表達量上升，這表明宿主通過產(chǎn)生大量的抗病毒免疫因子來抵抗病毒的入侵。目前，疫苗接種是預(yù)防病毒感染的主要手段，但還不能完全抵抗PoRV。因此，在禁抗和替抗的大環(huán)境下，還可以選擇控制PoRV的替代策略，如中草藥藥物治療。

白藜蘆醇是存在于葡萄、花生和虎杖等植物中的一種多酚類物質(zhì)，由于具有其多種生物學(xué)效應(yīng)，如抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗菌和抗病毒活性，已引起人們的廣泛關(guān)注［25，31］。值得注意的是，白藜蘆醇對多種病毒的增殖具有抑制能力，如單純皰疹病毒（HSV）、水痘-帶狀皰疹病毒（VZV）、偽狂犬病病毒（PRV）、呼吸道合胞病毒（RSV）、寨卡病毒（ZIKV）和腸道病毒71（EV71）［24-25］。然而，白藜蘆醇抗PoRV的效力尚未報道。本試驗研究了白藜蘆醇對PoRV的抗病毒特性。首先通過CCK-8的方法評估白藜蘆醇對IPEC-J2細胞的細胞毒性，結(jié)果表明，100 μmol·L-1白藜蘆醇對細胞活力無顯著影響。病毒感染細胞可分為吸附、穿透、復(fù)制和釋放4個階段，為進一步研究受白藜蘆醇影響的關(guān)鍵病毒感染周期，本研究設(shè)計了不同添加時間對相關(guān)指標的影響，主要包括病毒感染前期、中期、后期和全期，其中中期為病毒復(fù)制階段，后期為感染后維持階段。結(jié)果表明，單獨添加100 μmol·L-1白藜蘆醇可提高細胞免疫能力，在PoRV感染的后期和全期添加100 μmol·L-1可顯著抑制豬輪狀病毒的病毒滴度、NSP5的mRNA水平和VP6的蛋白水平，這表明白藜蘆醇在病毒進入后具有最重要的抑制作用。在后期和全期添加100 μmol·L-1白藜蘆醇可抑制PoRV導(dǎo)致的炎癥因子水平和抗病毒免疫調(diào)控因子的上調(diào)，這表明白藜蘆醇可以抵抗豬輪狀病毒帶來的炎癥反應(yīng)和免疫失調(diào)，使宿主維持在相對穩(wěn)定的狀態(tài)。

可變剪接是調(diào)節(jié)基因表達和產(chǎn)生蛋白質(zhì)組多樣性的重要機制，與人類生命活動息息相關(guān)。AS是通過由蛋白質(zhì)和RNA組成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)實現(xiàn)的，這些結(jié)構(gòu)圍繞要編輯的RNA組裝，病毒感染后可以改變RNA剪接方式和位點［6］，通過調(diào)控剪接機制促進或抑制自身復(fù)制，比如1型單純皰疹病毒（HSV-1）感染會改變宿主AS以增強病毒復(fù)制［32］；甲型流感病毒（FLUAV）可以誘導(dǎo)外顯子包涵體和較少的內(nèi)含子保留或廣泛的全局AS變化［33］；人巨細胞病毒（HCMV）感染通過誘導(dǎo)宿主mRNA翻譯調(diào)節(jié)因子CPEB1的表達，導(dǎo)致3′UTR的全局縮短和poly（A）尾的延長，這種活性被證明是病毒復(fù)制所必需的［34］。剪接位點強度影響選擇性剪接，這主要取決于共識序列，也叫RNA結(jié)合蛋白（RBP）識別的基序，通過招募或閉塞剪接體蛋白或通過改變剪接體對接的RNA結(jié)構(gòu)可用性的方式結(jié)合沉默和增強基序的RBP，從而影響選擇性剪接［6］。有兩個主要的RBP家族通過與這些基序相互作用來協(xié)調(diào)AS，即絲氨酸/精氨酸剪接因子（SRSF）蛋白和異質(zhì)核糖核蛋白（hnRNPs）［35］。本研究表明，單獨添加100 μmol·L-1白藜蘆醇可降低細胞的SRPK1的mRNA表達，而豬輪狀病毒感染IPEC-J2細胞后SRSF蛋白的SRPK1和SRPK2和hnRNPs蛋白的hnRNPC和hnRNPR的mRNA水平顯著提高，與此同時，LGALS9和EIF2AK2發(fā)生外顯子跳躍，且更傾向生成較短的可變剪切體（圖6A，EIF2AK2的外顯子1和3和LGALS9的外顯子4和6），這預(yù)示著不同的可變剪切體與輪狀病毒的感染性可能不同。在后期和全期添加100 μmol·L-1白藜蘆醇可顯著抑制PoRV導(dǎo)致的可變剪接因子的表達，同時LGALS9和EIF2AK2更傾向生成較長的可變剪切體（圖6A，EIF2AK2的外顯子1、2和3和LGALS9的外顯子4、5和6），這預(yù)示著白藜蘆醇通過影響可變剪切因子的表達，進而影響靶基因LGALS9和EIF2AK2的外顯子跳躍的方式，較長的可變剪切體對輪狀病毒的復(fù)制有抑制作用，提示白藜蘆醇可能具有通過調(diào)控可變剪接因子，從而影響靶基因的可變剪切方式，發(fā)揮抑制豬輪狀病毒感染和復(fù)制的功能。未來的研究需要進一步揭示白藜蘆醇控制宿主剪接的其他潛在機制，并確定對這些機制的操縱是否具有抗病毒治療干預(yù)的潛力。

4 結(jié) 論

本研究揭示了100 μmol·L-1白藜蘆醇可以在病毒感染后維持階段抑制豬輪狀病毒的感染和復(fù)制，能夠緩解豬輪狀病毒的感染造成的炎癥反應(yīng)和免疫失調(diào)，其機制可能通過調(diào)控可變剪接方式抑制病毒復(fù)制。

參考文獻（References）：

［1］ 沈思思.豬輪狀病毒的研究進展［J］.中國畜牧業(yè)，2022（14）：48-49.

SHEN S S.Research progress of porcine rotavirus［J］.China Animal Industry，2022（14）：48-49.（in Chinese）

［2］ VLASOVA A N，AMIMO J O，SAIF L J.Porcine rotaviruses：epidemiology，immune responses and control strategies［J］.Viruses，2017，9（3）：48.

［3］ 楊志剛，湯德元，張 森，等.豬輪狀病毒檢測技術(shù)研究進展［J］.動物醫(yī)學(xué)進展，202 42（7）：96-100.

YANG Z G，TANG D Y，ZHANG S，et al.Progress on detection techniques of porcine rotavirus［J］.Progress in Veterinary Medicine，202 42（7）：96-100.（in Chinese）

［4］ 卓儒浩，吳嘉敏，許夢慧，等.姜黃素抑制輪狀病毒感染豬腸上皮細胞的作用研究［J］.動物營養(yǎng)學(xué)報，2022，34（2）：1285-1295.

ZHUO R H，WU J M，XU M H，et al.Inhibitory effect of curcumin against rotavirus infection in intestinal porcine epithelial cells［J］.Chinese Journal of Animal Nutrition，2022，34（2）：1285-1295.（in Chinese）

［5］ REN X L，SALEEM W，HAES R，et al.Milk lactose protects against porcine group A rotavirus infection［J］.Front Microbiol，2022，13：989242.

［6］ MANN J T，RILEY B A，BAKER S F.All differential on the splicing front：host alternative splicing alters the landscape of virus-host conflict［J］.Semin Cell Dev Biol，2023，146：40-56.

［7］ EMERY A，SWANSTROM R.HIV-1：to splice or not to splice，that is the question［J］.Viruses，202 13（2）：181.

［8］ MEYER F.Viral interactions with components of the splicing machinery［J］.Prog Mol Biol Transl Sci，2016，142：241-268.

［9］ AJIRO M，ZHENG Z M.Oncogenes and RNA splicing of human tumor viruses［J］.Emerg Microbes Infect，2014，3（9）：e63.

［10］ ZHENG Z M.Viral oncogenes，noncoding RNAs，and RNA splicing in human tumor viruses［J］.Int J Biol Sci，2010，6（7）：730-755.

［11］ LI R X，GAO S Y，CHEN H Y，et al.Virus usurps alternative splicing to clear the decks for infection［J］.Virol J，2023，20（1）：131.

［12］ BOUDREAULT S，ROY P，LEMAY G，et al.Viral modulation of cellular RNA alternative splicing：a new key player in virus-host interactions？［J］.Wiley Interdiscip Rev RNA，2019，10（5）：e1543.

［13］ FRANCIES F Z，DLAMINI Z.Aberrant splicing events and epigenetics in viral oncogenomics：current therapeutic strategies［J］.Cells，202 10（2）：239.

［14］ LYU M Y，LAI H L，WANG Y L，et al.Roles of alternative splicing in infectious diseases：from hosts，pathogens to their interactions［J］.Chin Med J （Engl），2023，136（7）：767-779.

［15］ BEEMON K L.Retroviral RNA processing［J］.Viruses，2022，14（5）：1113.

［16］ ESPARZA M，BHAT P，F(xiàn)ONTOURA B M.Viral-host interactions during splicing and nuclear export of influenza virus mRNAs［J］.Curr Opin Virol，2022，55：101254.

［17］ GAN Z D，WEI W Y，WU J M，et al.Resveratrol and curcumin improve intestinal mucosal integrity and decrease m6A RNA methylation in the intestine of weaning piglets［J］.ACS Omega，2019，4（17）：17438-17446.

［18］ PASQUARIELLO R，VERDILE N，BREVINI T A L，et al.The role of resveratrol in mammalian reproduction［J］.Molecules，2020，25（19）：4554.

［19］ MENG T T，XIAO D F，MUHAMMED A，et al.Anti-inflammatory action and mechanisms of resveratrol［J］.Molecules，202 26（1）：229.

［20］ ZHOU D D，LUO M，HUANG S Y，et al.Effects and mechanisms of resveratrol on aging and age-related diseases［J］.Oxid Med Cell Longev，202 2021：9932218.

［21］ DOCHERTY J J，F(xiàn)U M M H，STIFFLER B S，et al.Resveratrol inhibition of herpes simplex virus replication［J］.Antiviral Res，1999，43（3）：145-155.

［22］ ZHAO X H，CUI Q K，F(xiàn)U Q T，et al.Antiviral properties of resveratrol against pseudorabies virus are associated with the inhibition of IκB kinase activation［J］.Sci Rep，2017，7（1）：8782.

［23］ MOHD A，ZAINAL N，TAN K K，et al.Resveratrol affects Zika virus replication in vitro［J］.Sci Rep，2019，9（1）：14336.

［24］ CHEN X X，SONG X，ZHAO X H，et al.Insights into the anti-inflammatory and antiviral mechanisms of resveratrol［J］.Mediators Inflamm，2022，2022：7138756.

［25］ ALESCI A，NICOSIA N，F(xiàn)UMIA A，et al.Resveratrol and immune cells：a link to improve human health［J］.Molecules，2022，27（2）：424.

［26］ OTSUKA K，YAMAMOTO Y，OCHIYA T.Regulatory role of resveratrol，a microRNA-controlling compound，in HNRNPA1 expression，which is associated with poor prognosis in breast cancer［J］.Oncotarget，2018，9（37）：24718-24730.

［27］ QIAN S，GU J L，DAI W F，et al.Sirt1 enhances tau exon 10 inclusion and improves spatial memory of Htau mice［J］.Aging （Albany NY），2018，10（9）：2498-2510.

［28］ ZHOU X，NIU J W，ZHANG J F，et al.Commentary：identification of pulmonary infections with porcine Rotavirus A in pigs with respiratory disease［J］.Front Vet Sci，2023，10：1102602.

［29］ LI W，LEI M K，LI Z F，et al.Development of a genetically engineered bivalent vaccine against porcine epidemic diarrhea virus and porcine rotavirus［J］.Viruses，2022，14（8）：1746.

［30］ WANG A M，TAO W，TONG J Y，et al，et al.m6A modifications regulate intestinal immunity and rotavirus infection［J］.eLife，2022，11：e73628.

［31］ 李 萍，程曉馨.白藜蘆醇抗菌抗病毒作用的研究進展［J］.中國微生態(tài)學(xué)雜志，2014，26（10）：1215-1219.

LI P，CHENG X X.The effects of resveratrol on antibacterial and antiviral properties［J］.Chinese Journal of Microecology，2014，26（10）：1215-1219.（in Chinese）

［32］ RUTKOWSKI A J，ERHARD F，L’HERNAULT A，et al.Widespread disruption of host transcription termination in HSV-1 infection［J］.Nat Commun，2015，6：7126.

［33］ ASHRAF U，BENOIT-PILVEN C，NAVRATIL V，et al.Influenza virus infection induces widespread alterations of host cell splicing［J］.NAR Genom Bioinform，2020，2（4）：lqaa095.

［34］ BATRA R，STARK T J，CLARK A E，et al.RNA-binding protein CPEB1 remodels host and viral RNA landscapes［J］.Nat Struct Mol Biol，2016，23（12）：1101-1110.

［35］ BUSCH A，HERTEL K J.Evolution of SR protein and hnRNP splicing regulatory factors［J］.Wiley Interdiscip Rev RNA，2012，3（1）：1-12.

（編輯 范子娟）