摘 要： 旨在確定引起河南某規(guī)?；脠?chǎng)病死兔發(fā)病的病原及其藥物敏感性。本研究對(duì)河南某規(guī)?；脠?chǎng)中病死兔進(jìn)行剖檢并采集3份病死兔病料組織，通過(guò)問(wèn)診，結(jié)合發(fā)病情況、臨床表現(xiàn)、剖檢變化、細(xì)菌的分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)、16S rRNA PCR鑒定、構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)和藥敏試驗(yàn)，確定引起該兔場(chǎng)發(fā)病的病原及其藥物敏感性。結(jié)果顯示，經(jīng)細(xì)菌分離培養(yǎng)得到2株大小不等的革蘭陰性短桿菌（分別命名為L(zhǎng)Y-01和LY-02株），其分別符合大腸桿菌和奇異變形桿菌的生化特性。經(jīng)PCR鑒定發(fā)現(xiàn)，LY-01和LY-02的16S rRNA基因序列片段大小分別為833 bp和1 500 bp。經(jīng)同源比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)LY-01與OR717622.1同源性為99.88%；LY-02與CP042907.1同源性為99.93%。經(jīng)球蟲(chóng)檢查發(fā)現(xiàn)，其糞便中存在大量球蟲(chóng)卵，其OPG值分別為0.64×104、0.62×104和0.68×104，均達(dá)到腸球蟲(chóng)感染標(biāo)準(zhǔn)。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離得到的大腸桿菌和奇異變形桿菌同時(shí)對(duì)青霉素和頭孢曲松敏感。綜上，本研究為家兔養(yǎng)殖過(guò)程中大腸桿菌、奇異變形桿菌和球蟲(chóng)混合感染的防治提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 兔；大腸桿菌；奇異變形桿菌；球蟲(chóng)；分離鑒定；耐藥性

中圖分類(lèi)號(hào)：S858.291

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)： 0366-6964（2024）09-4204-09

Mixed Infection and Drug Sensitivity Analysis of Escherichia coli， Proteus mirabilis

and Coccidia from Rabbits

WANG" Jianing， ZHANG" Ziqiang， WANG" Shuaishuai， LIU" Yumei*

（College of Animal Science and Technology， Henan University of

Science and Technology， Luoyang 471000，" China）

Abstract：" The purpose of this study was to determine the pathogen and its drug sensitivity of rabbits who died in a large-scale rabbit farm in Henan province. In this study， the dead rabbits in a large-scale rabbit farm in Henan province were dissected， three rabbits’ diseased tissues were collected， the pathogen causing the disease in the rabbit farm and its drug sensitivity were determined by asking questions， combining with the incidence， clinical manifestations， autopsy changes， bacterial isolation and culture， biochemical tests， 16S rRNA PCR identification， phylogenetic tree construction and drug sensitivity tests. The results showed that two strains of Gram-negative Brevibacterium （named LY-01 and LY-02， respectively） with different sizes were obtained by bacterial isolation and culture， which accorded with the biochemical characteristics of Escherichia coli and Proteus mirabilis， respectively. It was found by PCR that the 16S rRNA gene fragments of LY-01 and LY-02 were 833 bp and 1 500 bp， respectively. The homology of LY-01 and OR717622.1 was 99.88%. The homology of LY-02 and CP042907.1 was 99.93%. After coccidiosis examination， it was found that there were a large number of coccidia eggs in their feces， and their OPG values were 0.64×104， 0.62×104 and 0.68×104， respectively， which all reached the infection standard of enterococcidia. The results of drug sensitivity test showed that Escherichia coli and Proteus mirabilis were sensitive to both penicillin and ceftriaxone. To sum up， this study provides a theoretical basis for the prevention and treatment of mixed infection of Escherichia coli， Proteus mirabilis and coccidia in rabbit breeding.

Key words： rabbit;" Escherichia coli; Proteus mirabilis; coccidian; separation and identification; drug-fast

*Corresponding author： LIU Yumei，E-mail： yumeiliu@haust.edu.cn

兔大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌及其產(chǎn)生的毒素引起的兔急性消化道傳染病，主要表現(xiàn)為排果凍樣或水樣糞便［1］。大腸桿菌作為一種條件性致病菌，當(dāng)其他致病菌入侵機(jī)體后，機(jī)體免疫力降低，大腸桿菌便成為一種致病菌誘發(fā)機(jī)體患病。因此，大腸桿菌對(duì)各日齡兔均有較大程度危害。奇異變形桿菌是一種無(wú)莢膜、無(wú)芽孢的革蘭陰性短桿菌，其廣泛存在于自然界中，可引起宿主食物中毒、腹瀉等［2］。家兔感染奇異變形桿菌后，常表現(xiàn)為畏寒、腹瀉，在短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)大面積死亡，會(huì)對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。兔球蟲(chóng)病是由多種球蟲(chóng)（例如艾美爾科、艾美爾屬等）寄生于腸和膽管上皮細(xì)胞而引起的消化道疾病，也是一種常見(jiàn)且危害嚴(yán)重的寄生蟲(chóng)病［3］。兔感染球蟲(chóng)后主要表現(xiàn)為腹瀉、腹圍膨大等，且其感染程度與致死率呈正比，感染越嚴(yán)重，其致死率越高［4］。

兔大腸桿菌病、奇異變形桿菌病和球蟲(chóng)病均為兔消化道疾病，且無(wú)年齡和季節(jié)特異性，各日齡和各季節(jié)皆可發(fā)病，但主要發(fā)生在溫度驟變的春秋季節(jié)。這三種病原混合感染后，兔病情加重，從而導(dǎo)致病兔死亡率極高，對(duì)養(yǎng)殖戶(hù)造成較大經(jīng)濟(jì)損失。因此，本研究通過(guò)對(duì)河南某規(guī)?；脠?chǎng)病死兔進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)、PCR鑒定和藥敏試驗(yàn)，確定引起該兔場(chǎng)發(fā)病的病原及其耐藥情況，以期為后續(xù)類(lèi)似疫病的診治和防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源

2023年4月，河南某規(guī)?；脠?chǎng)突然發(fā)現(xiàn)數(shù)只剛生產(chǎn)完不久的獺兔出現(xiàn)急性腹瀉，且部分病兔在腹瀉癥狀發(fā)生不久后，便出現(xiàn)死亡。無(wú)菌采集3份病死兔心、肝、脾、肺等組織及糞便，進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定、耐藥性分析和球蟲(chóng)檢測(cè)。

1.2 主要試劑與儀器

LB固體培養(yǎng)基；LB液體培養(yǎng)基；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基；血瓊脂培養(yǎng)基；DL 2000 DNA Marker（武漢賽維爾生物科技有限公司）；細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒（北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司）；革蘭染液（北京博奧拓達(dá)科技有限公司）；電子天平（JA3003N）；凝膠電泳儀（DYY-8C）；雙目生物顯微鏡（S500-2）。

1.3 細(xì)菌的分離純化

無(wú)菌條件下，將采集的樣品用接種環(huán)挑取，并通過(guò)四區(qū)劃線法接種于LB固體培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基中，在37℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察菌落的形態(tài)特征和生長(zhǎng)情況。隨后挑取單菌落進(jìn)行革蘭染色和鏡檢（得到2株大小不等的革蘭陰性短桿菌）。

1.4 生化試驗(yàn)

分別將分離純化的菌株接種于各個(gè)微量生化管內(nèi)，37℃培養(yǎng)24～48 h后，觀察并記錄其結(jié)果。

1.5 引物的設(shè)計(jì)與合成

大腸桿菌（登錄號(hào)：CP042982.1）和奇異變形桿菌（登錄號(hào)：CP138492.1）引物由通用生物（安徽）股份有限公司合成，具體序列和各目的片段長(zhǎng)度信息見(jiàn)表1。

1.6 分子生物學(xué)鑒定

將純化后的菌液進(jìn)行細(xì)菌DNA的抽提后，作為DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Premix TaqTM 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，DNA模板1 μL，上游和下游引物各1 μL。反應(yīng)條件為：94℃ 4 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min；4℃保存。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用2％的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。擴(kuò)增產(chǎn)物送至通用生物（安徽）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與GenBank中已登錄的菌株進(jìn)行同源性比對(duì)分析，并使用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.7 藥敏試驗(yàn)

選用臨床常用抗生素，通過(guò)紙片擴(kuò)散法（K-B法）測(cè)定該分離菌的耐藥性，并參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）制定的藥敏判定標(biāo)準(zhǔn)判定其結(jié)果?？股丶埰ǎ簯c大霉素、新霉素、卡那霉素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、多西環(huán)素、丁胺卡那、桿菌肽、多黏菌素B、阿奇霉素、青霉素、復(fù)方新諾明、磺胺異噁唑、頭孢曲松。

1.8 球蟲(chóng)檢查

取適量糞便于燒杯內(nèi)，加入適量飽和食鹽水混合后，用濾網(wǎng)將其過(guò)濾到另一個(gè)燒杯中，靜置5 min后移取適量上清進(jìn)入麥克馬斯特蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)板鏡檢、計(jì)數(shù)，并計(jì)算其OPG值。

OPG=（n1/0.15）×60÷m，其中n1為卵數(shù)，0.15為每個(gè)計(jì)數(shù)室有效體積（mm3），60為糞液總體積（mm3），m為糞便克數(shù)（g）。

1.9 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

將分離菌分別接種于普通營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，通過(guò)平板法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，稀釋菌液濃度至108 CFU·mL－1。將15只SPF級(jí)KM小鼠（體質(zhì)量在20 g左右）隨機(jī)分為3組（每組5只），分別為對(duì)照組、試驗(yàn)1組和試驗(yàn)2組。試驗(yàn)1、2組分別腹腔注射0.2 mL稀釋菌液，對(duì)照組小鼠注射等量PBS。接種后觀察各組小鼠狀態(tài)，并對(duì)病死鼠進(jìn)行剖檢。

2 結(jié) 果

2.1 臨床剖檢

臨床剖檢發(fā)現(xiàn)病兔嚴(yán)重腹瀉（圖1A），腸壁明顯變薄，且有彌漫性充血和出血斑點(diǎn)（圖1B）；直腸內(nèi)充滿膠凍樣糞，且有腥臭味；有的胃底黏膜部分脫落，胃表面有出血斑點(diǎn)；肝稍腫、發(fā)黃，且有部分結(jié)節(jié)灶（圖1C）；病兔脾萎縮呈深褐色（圖1D）；肺部分充血或淤血。

2.2 細(xì)菌的形態(tài)及培養(yǎng)特性觀察

無(wú)菌采集病死兔心、肝、脾、肺、腎等組織，進(jìn)行細(xì)菌分離，于37℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行革蘭染色、鏡檢，可見(jiàn)兩種革蘭陰性桿菌，并將其分別命名為L(zhǎng)Y-01和LY-02株。此外，將2株分離菌分別接種于普通瓊脂培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，進(jìn)行病原菌的分離與純化。經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)后，觀察發(fā)現(xiàn)LY-01在普通瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)出光滑、圓形、濕潤(rùn)、邊緣整齊的乳白色菌落（圖2A）；在血瓊脂培養(yǎng)基上呈邊緣整齊、表面光滑的灰白色菌落（圖2B）；在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上呈粉紅色、濕潤(rùn)、光滑的小菌落（圖2C）。LY-02在普通瓊脂培養(yǎng)基上呈擴(kuò)散生長(zhǎng)，形成遷徙生長(zhǎng)現(xiàn)象，且具有腐敗臭味（圖2E）；在血瓊脂培養(yǎng)基上呈無(wú)色小菌落（圖2F）；在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上呈表面光滑的半透明扁平菌落（圖2G）。

2.3 生化試驗(yàn)

為進(jìn)一步鑒定兩種分離菌，將純化好的分離菌分別接種于各類(lèi)生化培養(yǎng)基中鑒定其生化特性。結(jié)果如表2所示，參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》初步判定這兩種分離菌可能為大腸桿菌和奇異變形桿菌。

2.4 分子生物學(xué)鑒定

取提取的細(xì)菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳后，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)兩種分離菌均出現(xiàn)特異性條帶且與預(yù)期結(jié)果大小一致，進(jìn)一步表明兩種分離菌可能是大腸桿菌和奇異變形桿菌（圖3）。

分別將兩種分離菌的擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI分析，通過(guò)DNAStar軟件中MegAlign進(jìn)行多序列比對(duì)，采用MEGA 7.0軟件分別構(gòu)建其遺傳進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示LY-01與登錄號(hào)為OR717622.1的大腸桿菌同源性為99.88%（圖4A），LY-02與登錄號(hào)為CP042907.1的奇異變形桿菌同源性為99.93%（圖4B）。以上表明，病兔混合感染大腸桿菌和奇異變形桿菌。

2.5 藥敏試驗(yàn)

分別將兩種分離菌均勻涂布于普通瓊脂培養(yǎng)基上，用多種抗菌藥物紙片做藥敏試驗(yàn)。結(jié)果表明，大腸桿菌對(duì)丁胺卡那、多黏菌素B、青霉素和頭孢曲松敏感，對(duì)阿奇霉素中介，對(duì)慶大霉素、新霉素、卡那霉素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、多西環(huán)素、桿菌肽、復(fù)方新諾明和磺胺異噁唑耐藥；奇異變形桿菌對(duì)環(huán)丙沙星、青霉素和頭孢曲松敏感，對(duì)阿奇霉素中介，對(duì)慶大霉素、新霉素、卡那霉素、恩諾沙星、四環(huán)素、多西環(huán)素、丁胺卡那、桿菌肽、多黏菌素B、復(fù)方新諾"" 明和磺胺異噁唑耐藥（表3）。

2.6 球蟲(chóng)檢查

分別取3只病兔適量糞便，加入適量飽和食鹽水后靜置5 min后，鏡檢可見(jiàn)大量球蟲(chóng)卵，其OPG值分別為0.64×104、0.62×104和0.68×104，均達(dá)到腸球蟲(chóng)感染標(biāo)準(zhǔn)（OPG≥0.5×104，圖5）。

2.7 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

用2株分離菌攻毒后，試驗(yàn)1、2組小鼠均表現(xiàn)為精神沉郁，48 h內(nèi)全部死亡，而對(duì)照組小鼠表現(xiàn)正常、精神良好。剖檢病死小鼠發(fā)現(xiàn)注射大腸桿菌組小鼠脾腫大；胃部膨大且充滿液體和氣體；各段腸道呈不同程度腫脹，腸道內(nèi)充滿膠凍樣黏液。注射奇異變形桿菌組小鼠脾充血淤血，腸黏膜脫落，腸道內(nèi)充滿黃綠色內(nèi)容物。無(wú)菌采集病死小鼠肺、肝等具有典型病變的組織，在普通瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行分離培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)與原分離菌株一致，16S rRNA的PCR鑒定證實(shí)序列與原分離株相同。

3 討 論

近年來(lái)，隨著兔養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，疾病問(wèn)題也變得愈發(fā)突出［5］，尤其是腹瀉、肺炎等［6-8］，嚴(yán)重阻礙了養(yǎng)兔業(yè)的發(fā)展。其中，大腸桿菌作為一種條件性致病菌，在宿主免疫力低下時(shí)，該菌可在機(jī)體內(nèi)大量繁殖，導(dǎo)致宿主腹瀉。有大量研究表明，大腸桿菌可感染多種動(dòng)物，例如，兔、雞、豬、羊等［9-11］。研究表明，當(dāng)大腸桿菌感染兔后，常導(dǎo)致其發(fā)生消化道疾病，臨床上表現(xiàn)出腹瀉、嘔吐等癥狀。大腸桿菌可通過(guò)單獨(dú)或混合感染導(dǎo)致兔發(fā)病。在生產(chǎn)過(guò)程中，混合感染發(fā)生概率很高［12-15］。徐靖怡等［16］從急性死亡的兔中發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌和金黃色葡萄球菌混合感染；劉照波等［17］從發(fā)生腹瀉兔群中分離得到大腸桿菌和魏氏梭菌；李欣［18］以腹瀉、發(fā)熱、死亡的兔群為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌和沙門(mén)菌是引起該兔群發(fā)病的主要原因。

奇異變形桿菌病是一種多發(fā)的細(xì)菌性傳染病，而最近的報(bào)道大多集中在雞、牛、羊等動(dòng)物中，兔感染奇異變形桿菌的報(bào)道鮮見(jiàn)。閆建英等［19］從具有腹瀉、消瘦等癥狀的雛雞體內(nèi)分離出1株奇異變形桿菌；張健鵬等［20］從具有腹瀉、死亡等癥狀的驢中分離出奇異變形桿菌，發(fā)現(xiàn)引起該場(chǎng)區(qū)驢駒死亡的主要病原是奇異變形桿菌；廖娟等［2］從腹瀉死亡的病兔腸道中分離得到1株奇異變形桿菌，并對(duì)其耐藥情況進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)多種抗生素出現(xiàn)不同程度耐藥；王俊書(shū)等［21］發(fā)現(xiàn)引起其種兔腹瀉死亡的病原是奇異變形桿菌；此外，有研究表明哺乳動(dòng)物感染奇異變形桿菌后常導(dǎo)致腹瀉、肺炎等癥狀［2］。與本研究通過(guò)剖檢發(fā)現(xiàn)病兔肺部出現(xiàn)出血、化膿的結(jié)果一致。

在兔養(yǎng)殖過(guò)程中，球蟲(chóng)病是一類(lèi)常見(jiàn)且危害嚴(yán)重的疾病。根據(jù)球蟲(chóng)的寄生部位可將其分為肝型、腸型和混合型。有研究表明，肝型球蟲(chóng)主要表現(xiàn)為肝腫大、肝表面有許多結(jié)節(jié)且膽囊腫大；腸型球蟲(chóng)主要癥狀為腹瀉，病理變化主要為腸黏膜充血且有片狀或散在充血點(diǎn)，本研究中病兔也感染了球蟲(chóng)，其特征與上述研究一致。而混合型球蟲(chóng)既有肝型，也有腸型的病理變化［22］。此外，大量研究發(fā)現(xiàn)許多兔場(chǎng)均發(fā)現(xiàn)不同程度球蟲(chóng)感染［23-26］。球蟲(chóng)可導(dǎo)致幼兔發(fā)病，而成年兔可耐過(guò)，但耐過(guò)兔長(zhǎng)期消瘦、免疫力低下，極易繼發(fā)其他致病菌的感染。

目前，在兔消化道疾病中，大腸桿菌病、奇異變形桿菌病和球蟲(chóng)病流行廣泛且嚴(yán)重。截至目前，還未見(jiàn)兔大腸桿菌、奇異變形桿菌和球蟲(chóng)混合感染的相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)腹瀉獺兔的病料采用細(xì)菌的分離鑒定等方法，確定了引起該兔場(chǎng)發(fā)病的病原主要是大腸桿菌、奇異變形桿菌和球蟲(chóng)。通過(guò)與養(yǎng)殖戶(hù)交流后，判定這可能跟近期氣溫驟變有關(guān)。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)該兔場(chǎng)生物安全防控措施不規(guī)范，導(dǎo)致了病原的散播。因此，對(duì)兔舍、用具和四周場(chǎng)地進(jìn)行全面消毒；病兔及時(shí)隔離、治療；病死兔進(jìn)行無(wú)害化處理是十分必要的。此外，腹瀉常導(dǎo)致機(jī)體脫水，因此可在飲水中加入多種維生素和電解質(zhì)，以補(bǔ)充病兔機(jī)體流失的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

在生產(chǎn)實(shí)踐中，常通過(guò)聯(lián)合用藥的方式給藥，以增強(qiáng)其療效。因此，根據(jù)本研究的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，最終確定通過(guò)飲水添加環(huán)丙沙星和多黏菌素B聯(lián)合或通過(guò)肌注頭孢曲松的方式進(jìn)行治療大腸桿菌和奇異變形桿菌。關(guān)于球蟲(chóng)，可采用磺胺氯丙嗪鈉和恩拉霉素或者單獨(dú)使用妥曲珠利進(jìn)行治療。通過(guò)5 d的綜合治療，兔群病死率下降明顯，并趨于穩(wěn)定。本次疫情得到控制，兔群逐漸恢復(fù)正常。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)對(duì)河南省某規(guī)?；脠?chǎng)腹瀉病死獺兔進(jìn)行臨床剖檢、分離培養(yǎng)、生化鑒定、序列分析及動(dòng)物回歸試驗(yàn)等確定分離菌株為大腸桿菌和奇異變形桿菌。經(jīng)球蟲(chóng)檢查發(fā)現(xiàn)糞便中存在大量球蟲(chóng)卵。經(jīng)藥敏試驗(yàn)測(cè)定發(fā)現(xiàn)分離得到的大腸桿菌和奇異變形桿菌均對(duì)青霉素和頭孢曲松2種藥物敏感，對(duì)所檢測(cè)的其他藥物有不同程度的耐藥性。

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（編輯 范子娟）