關鍵詞：油茶；兒茶素；抗病性

油茶（CamelliaoleiferaAbel.）為山茶科山茶屬油用植物總稱，常綠小喬木或灌木，與油橄欖（OleaeuropaeaL.）、椰子（CocosnuciferaL.）、油棕（ElaeisguineensisJacq.）并稱為世界四大木本油料植物；其經(jīng)濟價值高，市場前景廣闊，油茶具有保健、生態(tài)、食用等價值；其資源分布范圍廣，全國14個省份種植面積達302萬hm2；油茶種質資源豐富，全國目前大面積種植且具有悠久栽培歷史的油茶物種有13個，其中普通油茶分布最廣、面積最大、品系最多［1］。油茶炭疽?。–olletotrichumgloeosporioidesPenz）病菌能造成油茶落葉、落果、嚴重時能使整株死亡，是油茶發(fā)病率最高的主要病害。兒茶素是組成茶多酚的一類主要的物質，約占茶多酚總量的65%～80%，具有抗病菌、抗氧化、預防癌癥等效用［2］。兒茶素類化合物中含量大的主要有表兒茶素（epicatechin，EC）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechingallate，ECG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechingallate，EGCG）4種，約占兒茶素類化合物70%［3］。兒茶素類化合物對油茶炭疽病等植物病原真菌具有良好的抑制效果［4］。油茶中的兒茶素單體化合物在油茶品種間差異、空間分布特征及病菌抑制情況尚不明確，相關研究甚少。兒茶素單體化合物在油茶無性系品質及抗病性方面的優(yōu)質品系篩選上尚無研究結論，試驗通過研究分析4種主要兒茶素單體化合物在油茶品種間差異及炭疽病害的關聯(lián)性，為油茶無性系優(yōu)質品系篩選提供全面評價，同時為兒茶素類化合物在油茶葉炭疽病害協(xié)同防治上提供思考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

實驗材料為‘長林3號’‘長林4號’‘長林18號’‘長林27號’‘長林40號’‘長林53號’油茶枝條長短基本一致的頂部、中部、基部葉片，6月采摘于湖北省恩施天池嶺。取樣區(qū)域年平均氣溫18.5℃，平均海拔900m，日照時數(shù)1356h，無霜期年平均280d，年平均降水量1320mm，土壤為黃棕壤，油茶樹齡8年。取樣時每個品種隨機重復3株，每株在枝條不同部位采集葉片15片。

表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）標準品均為色譜純，購于上海源葉生物科技有限公司，甲醇（色譜純，北京邁瑞達科技有限公司），冰乙酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），超純水。DIONEXP680高效液相色譜儀（杭州康迪儀器設備有限公司），F(xiàn)A2004B電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司），HX-03超聲波清洗器（武漢恒信世紀科技有限公司），DZKW-D-2電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）。

1.2 實驗方法

兒茶素含量檢測方法主要有分光光度法、高效液相色譜法（HPLC）等［5，6］，本實驗采用采用GB/T8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》［7］，并對HPLC法測定兒茶素類含量的方法進行了調整。色譜柱C18（4.6mm×250mm，5μm），柱溫30℃；流動相A：0.1%乙酸水，流動相B：0.1%乙酸甲醇，梯度洗脫，洗脫程序見表1，流動相流速1.0mL/min，紫外檢測波長：273nm，進樣量10μL。

分別精密稱取EC、EGC、ECG、EGCG各10.000mg，分別置于10mL容量瓶中，用超純水配制成1mg/mL的對照品儲備液，低溫遮光保存。

將油茶葉片60℃風干并搗碎，過60目篩的油茶葉粉末準確稱取0.5g置于試管中，加入10mL超純水，70℃水浴鍋中提取15min，待冷卻后將上清液轉移到15mL容量瓶，并定容到10mL，搖勻，過0.22μm微孔濾膜待測。

1.3 油茶葉炭疽病害統(tǒng)計方法

按照《茶炭疽病測報調查與防治技術規(guī)程》（DB34/T2055-2014），在實驗樣地‘長林3號’區(qū)塊內采用對角線樣線法隨機確定一個基點，每隔10m選定1株油茶樹，總共選5株。每株油茶樹的東西南北隨機選取一個枝條，每個枝條頂部、中部、基部隨機取5片葉，共計300片葉，觀察其感染炭疽病害情況并記錄?！L林4號’‘長林18號’‘長林27號’‘長林40號’‘長林53號’采取同樣操作方式進行統(tǒng)計。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用IBMSPSSStatistics22版軟件進行方差分析、相關性分析等工作，采用單因素方差分析（one-wayANOVA）、最小顯著差數(shù)法（Least-SignificantDifference）進行多重比較差異顯著性檢驗（Plt;0.5），Pearson相關度分析。采用WPSoffice2019進行試驗數(shù)據(jù)處理和圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 樣品測定與分析

取供試品溶液10μL進樣分析，每份樣品重復3次并計算各種兒茶素單體化合物成分的均值含量，結果見表2。其相對標準差RSD均小于10%，數(shù)據(jù)穩(wěn)定性較高。

種內不同葉位的4種兒茶素單體化合物進行顯著性差異分析，其兒茶素單體化合物含量差異均達到顯著水平（Plt;0.05）。

對6個長林系列油茶品種間4種兒茶素單體化合物進行顯著性差異分析，除其中‘長林40號’與‘長林3號’、‘長林4號’、‘長林18號’的表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）差異達到顯著水平（P值分別為0.023、0.005、0.003），其他品種兒茶素單體化合物存在差異低，未達到顯著水平。

4種主要兒茶素單體化合物在品種內的總含量和枝條不同位置的總含量如圖1所示，油茶品種間4種主要兒茶素單體化合物總含量相差較大，其中‘長林4號’gt;‘長林18號’gt;‘長林3號’gt;‘長林53號’gt;‘長林27號’gt;‘長林40號’；長林4號’含量達到6500mg/kg，‘長林40號’含量低于4000mg/kg；品種內不同葉位4種兒茶素單體化合物總含量與枝條伸育度有關，呈現(xiàn)出枝條頂部gt;枝條中部gt;枝條基部。

不同油茶品種內4種兒茶素單體化合物含量如圖2所示，其4種兒茶素單體化合物含量大小依次為EGCGgt;EGCgt;ECGgt;EC；其中酯型兒茶素類化合物（EGCG、ECG）含量整體高于非酯型兒茶素類化合物，尤以表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）含量最高，如‘長林4號’EGC為603mg/kg、EGCG為988mg/kg、EC為244mg/kg、ECG為345mg/kg。

2.2 油茶葉片炭疽病害發(fā)生情況分析

通過樣線法，對不同油茶品種葉片炭疽病葉片進行統(tǒng)計，依據(jù)標準《油茶炭疽病防治技術規(guī)程》（DB34/T2055-2014），計算油茶葉片炭疽病感病指數(shù)100×Σ（各級葉片數(shù)×各級代表值）（/調查總葉數(shù)×最高級代表值）。結果見圖3，同一品種油茶葉片炭疽病感指數(shù)與葉位相關，呈現(xiàn)病感指數(shù)隨枝條伸育程度逐漸增加的趨勢；不同長林系油茶品種枝條基部葉片的感病指數(shù)明顯高于枝條中部、頂部葉片；‘長林40號’葉片整體感病指數(shù)最高。

通過對不同油茶品種枝條同部位的葉片發(fā)病率進行單因素方差分析，結果見表3。不同油茶品種枝條基部葉片發(fā)病率存在顯著性差異，其中‘長林40號’與多數(shù)品種出現(xiàn)顯著性差異；枝條相同部位葉片發(fā)病率差異不顯著的品種說明兒茶素對炭疽病真菌的抑制率處于相同的濃度區(qū)間內。

2.3 油茶葉炭疽病發(fā)病率與兒茶素相關性分析

對油茶品種與不同葉位葉片的兒茶素單體含量、葉片炭疽病發(fā)病率變量進行Pearson相關度分析，結果如表3-4種主要兒茶素含量與枝條葉位病害率成中高度負相關。其中酯型兒茶素單體化合物（EGCG、ECG）相關性極強。

3 討論

實驗通過高效液相色譜法，測出長林系6個油茶品種間4種主要兒茶素單體化合物（表兒茶素、表沒食子兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯）含量，其差異較大，據(jù)張賤根等［8］研究，兒茶素單體化合物含量與不同樹種種質資源，季節(jié)變化、生長環(huán)境、葉片老嫩程度相關。本次實驗葉片老嫩一致，采摘生長環(huán)境、時間相同，說明兒茶素單體含量差異與油茶種質有關。龍丹等［9］研究，兒茶素具有諸多醫(yī)療保健功能和一些特殊性質。所以將兒茶素類化合物作為優(yōu)質油茶品系選育輔助指標具有參考作用。

據(jù)單體江等［10］研究發(fā)現(xiàn)，葉部病害是危害油茶的主要病害，普遍是真菌性、細菌性病害，主要包括炭疽病、軟腐病等，嚴重時油茶落葉、落果，造成茶油減產(chǎn)和品質降低。茶多酚在植物抑菌抗病中具有重要作用，據(jù)汪金蓮等［11，12］研究，發(fā)現(xiàn)茶多酚對植物真菌具有顯著的抑制效果，茶多酚在一定范圍內對真菌的抑制率與多酚溶液的濃度成正比，本實驗表明兒茶素含量、葉片炭疽病的發(fā)病率與油茶枝條是呈線性關系的，但部分油茶品種同位置的差異無顯著性，可能兒茶素的濃度區(qū)間有關。目前關于茶多酚抗菌作用的研究很廣泛，但其作用機制的研究結果尚不十分清晰。但據(jù)曾亮等［13］、陳敏等［14］研究發(fā)現(xiàn)，在茶多酚中兒茶素單體物質（EGCG、EGC、ECG、EC）具有顯著的抑菌效果。本實驗揭示了油茶葉片病害率與4種主要兒茶素單體化合物含量成負相關性，相關性均在中度和高度以上，實驗對4種主要兒茶素單體化合物與油茶葉片炭疽病發(fā)病率之間的關聯(lián)性作出初步評價，同時對油茶品種間枝條不同部位的兒茶素含量、葉片炭疽病發(fā)病率差異進行顯著性分析，表明油茶枝條基部葉片的兒茶素含量可為油茶抗病品系選育提供參考。

實驗發(fā)現(xiàn)不同油茶品種中表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）含量遠高于其他4種主要兒茶素單體化合物，這與黃彪等［15］研究發(fā)現(xiàn)一致，即表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）約占兒茶素類化合物總量的50％以上。據(jù)Ara－kawa等［16］發(fā)現(xiàn)，茶多酚的抗菌作用機理可能是EGCG與活性氧反應生成的過氧化氫，據(jù)Yanagawa等［17］發(fā)現(xiàn)，EGCG能顯著提高藥品抗菌活性，華德興等［18］研究發(fā)現(xiàn)，EGCG和ECG能使苯唑西林抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA的效果增強。肖波等［19］研究，多酚與維生素c配合使用對幽門螺桿菌抑制效果明顯。實驗發(fā)現(xiàn)酯型兒茶素類化合物（EGCG、ECG）含量與不同油茶品種葉片病害率相關度極強，其中以表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）相關系數(shù)整體最高，這說明油茶葉片抗病能力與表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）抑菌濃度及活性明顯有關。據(jù)葛建等［20］發(fā)現(xiàn)，表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）在抗癌、抗氧化、心腦血管保護、神經(jīng)系統(tǒng)以及內分泌等方面作用突出，研究相對廣泛且深入。所以在油茶品質及抗性評價中，酯型兒茶素單體化合物（EGCG、ECG）作為突出指標，能快速在油茶優(yōu)質品系和抗病能力上做出初步評價。

實驗結果顯示4種主要兒茶素單體化合物含量與油茶葉片在枝條空間分布上相關，這與張瀾等［21］研究一致，枝條頂端嫩葉含量高于枝條基部老葉的含量，也說明兒茶素單體化合物含量與葉片成熟度有關。據(jù)晏秀梅等［22］研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚與茶皂素兩者聯(lián)合使用時具有協(xié)同抑菌效果。據(jù)陳書媛等［23］研究表明，兒茶素類化合物能與多種抗生素產(chǎn)生協(xié)同抑菌作用。本實驗在油茶兒茶素類化合物與不同藥品的協(xié)同防治效果，針對不同樹齡用藥濃度上提供了研究新思路，為油茶抗病性機理研究提供了新方向。

4 結論

本研究系統(tǒng)評價了4種主要兒茶素單體化合物（EC、EGC、ECG、EGCG）與油茶葉片病害在油茶長林系品種中的空間分布特征，分析了4種主要兒茶素單體化合物在不同油茶品種間差異性及油茶病害的相關性。研究發(fā)現(xiàn)EC、EGC、ECG、EGCG在不同油茶品種間存含量相差較大，兒茶素單體化合物與油茶葉片病害率在枝條空間上成中高度負相關。結果表明4種主要兒茶素單體化合物在油茶抗病性評價的參考作用，為油茶優(yōu)質品系篩選提供參考依據(jù)。結果表明，酯型兒茶素類化合物（EGCG、ECG）可作為突出性指標，為油茶抗病能力做出快速初步評價。實驗結果在不同環(huán)境下是否具有一般性還需進一步探討。為油茶病害協(xié)同防治篩選高效藥品及抗病機理研究提供思路。