摘要：為探明湖北省地方杏品種資源的遺傳多樣性，以湖北省24個(gè)地方杏品種為試驗(yàn)材料，采用SSR分子標(biāo)記結(jié)合熒光毛細(xì)管電泳技術(shù)開展研究。結(jié)果表明，來自杏、桃、扁桃和櫻桃上的14對(duì)引物共擴(kuò)增出162個(gè)多態(tài)性等位基因位點(diǎn)，平均每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)目為11.571。有效等位基因總數(shù)為90.312，平均每個(gè)位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)目為6.451。觀測(cè)雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、香農(nóng)指數(shù)（I）的平均值分別為0.652、0.813、2.031，多態(tài)性信息含量（PIC）平均值為0.794，說明所選近源物種的引物具有較高的通用性，多態(tài)性豐富。在相似系數(shù)0.580處將24個(gè)品種分為3個(gè)大組，第1組由洪平杏獨(dú)立成組，第2組由榔梅、杏梅等4個(gè)品種組成，第3組由米杏、五祖杏等19個(gè)品種組成?？梢姡笔〉胤叫悠贩N具有豐富的遺傳多樣性，采用SSR特異性引物可以鑒別湖北省地方杏品種。

關(guān)鍵詞：地方杏；種質(zhì)資源；熒光SSR標(biāo)記；遺傳多樣性；湖北省

中圖分類號(hào)：S662.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2024）10-0097-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.10.017 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract：To explore the genetic diversity of local apricot variety resources in Hubei Province， 24 local apricot varieties materials were taken as test materials， and SSR molecular markers combined with fluorescence capillary electrophoresis technology were used for the study. The results showed that 14 pairs of primers from apricots， peaches， almonds， and cherries amplified a total of 162 polymorphic effective allele loci， with an average of 11.571 alleles per locus. The total number of effective alleles was 90.312， with an average of 6.451 effective alleles per locus. The average values of observed heterozygosity （Ho）， expected heterozygosity （He）， and Shannon's information index （I） were 0.652， 0.813， and 2.031， respectively. The average value of polymorphic information content （PIC） was 0.794， indicating that the primers for the selected related species had high universality and rich polymorphism. At a similarity coefficient of 0.580， 24 varieties were divided into three large groups. The first group was independently composed of Hongping apricot， the second group consisted of four varieties including Langmei and Xingmei et al， and the third group consisted of 19 varieties including rice apricot and Wuzu apricot. It could be seen that local apricot varieties in Hubei Province had rich genetic diversity， and SSR specific primers could effectively identify Hubei local apricot varieties.

Key words：local apricot； germplasm resources； fluorescent labeled SSR marker； genetic diversity； Hubei Province

杏（Prunus armeniaca L.）屬于薔薇科，在世界范圍內(nèi)廣泛種植，它是北半球的重要水果，也是除桃和李之外的第三大硬核水果。在所有的溫帶水果中，杏在全球產(chǎn)量中排名第七［1］。中國(guó)約有2 000個(gè)杏的品種和類型，有著悠久的栽培歷史，不僅是杏的原產(chǎn)國(guó)之一，也是世界上杏種質(zhì)資源最豐富的國(guó)家［2］。普通杏是杏屬中品種最多、栽培最廣泛、經(jīng)濟(jì)價(jià)值最高的一個(gè)種，它在世界各地的大部分地區(qū)種植，主要是在地中海盆地、北美和亞洲，栽培了廣泛的品種類型［3］。地方杏資源的遺傳多樣性研究對(duì)中國(guó)杏的生產(chǎn)和科研都具有重要意義。

SSR標(biāo)記，也稱為微衛(wèi)星DNA標(biāo)記或短串聯(lián)重復(fù)序列標(biāo)記，是高變DNA元件，由串聯(lián)重復(fù)的單、二、三、四核苷酸或五核苷酸基序組成，它們大量存在于高等生物的基因組中［4］。近些年，SSR標(biāo)記已在野杏、地方杏和普通杏等中廣泛應(yīng)用［5-9］，具有高水平的多態(tài)性、位點(diǎn)特異性、共顯性、可重復(fù)性、PCR方便、全基因組隨機(jī)分布等優(yōu)點(diǎn)［10］。

目前，杏樹上主要利用SSR標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性分析。Hedia等［1］利用25個(gè)SSR標(biāo)記，對(duì)從杏栽培地區(qū)收集的890份不同杏品種材料進(jìn)行基因分型，分析了栽培杏的遺傳多樣性和遺傳資源的結(jié)構(gòu)，揭示了該品種在世界范圍內(nèi)的傳播歷史，證實(shí)了杏自中國(guó)和中亞的起源。何天明等［11］利用SSR標(biāo)記進(jìn)行了新疆栽培杏的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析；張淑青等［12］利用SSR標(biāo)記對(duì)69個(gè)普通杏品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析；王玉安等［13］利用SSR標(biāo)記對(duì)甘肅地方杏品種資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析。熒光SSR相對(duì)于SSR檢測(cè)技術(shù)，在檢測(cè)速度和檢測(cè)效果上都有更明顯的優(yōu)勢(shì)［14，15］。近年來，熒光SSR標(biāo)記在果樹上得到應(yīng)用。苑克俊等［15］利用熒光SSR標(biāo)記構(gòu)建杏新品系的分子身份證；王璐偉等［16］采用熒光SSR標(biāo)記對(duì)79份桃種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析。這些研究主要是針對(duì)普通杏、中國(guó)北方的地方杏品種資源。

然而，對(duì)湖北省范圍內(nèi)杏種質(zhì)資源的研究報(bào)道較少，本研究旨在對(duì)湖北省11個(gè)縣（市）的 24份地方杏資源進(jìn)行基于熒光標(biāo)記的SSR遺傳多樣性分析，以期為利用中國(guó)地方杏品種進(jìn)行育種改良獲得新品種提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用24份地方杏資源葉片樣本來源于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所金水試驗(yàn)基地杏資源圃（表1）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取 每份杏種質(zhì)材料取幼嫩葉片約30 mg，液氮冷凍后研磨，采用改良CTAB法提取葉片基因組DNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，用ND-100微量紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo）檢測(cè)純度和濃度，稀釋至50 mg/L，保存于 -20 ℃冰箱，備用。

1.2.2 SSR引物合成 參考已報(bào)道的相關(guān)文獻(xiàn)，從杏、扁桃、桃、櫻桃的引物中合成18對(duì)SSR引物，篩選出14對(duì)多態(tài)性好的引物，序列見表2。由北京擎科生物科技股份有限公司合成。所有F引物的5′端合成修飾引物，可選FAM、HEX、TAMRA、ROX 4種修飾。R引物合成PAGE引物。

1.2.3 PCR反應(yīng)體系與擴(kuò)增程序 PCR反應(yīng)采用20 μL體系：TSINGKE金牌Mix（green）17 μL、正反向引物各1 μL，DNA模板1 μL。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃ 10 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min后4 ℃保存。4種熒光標(biāo)記體系及擴(kuò)增程序同上。

1.2.4 電泳及毛細(xì)管檢測(cè) 擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物zK6CLGZR2vmoJvxbJuYtDw==進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（2 μL樣品+6 μL溴酚藍(lán)），300 V電壓下12 min，獲取鑒定膠圖。通過膠圖確定模板濃度，加水稀釋到毛細(xì)管電泳所需濃度。將分別帶有4種熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物進(jìn)行混樣，加入LIZ 500內(nèi)標(biāo)Marker后在ABI3730XL測(cè)序儀進(jìn)行基因分型。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 將經(jīng)ABI3730XL測(cè)序儀測(cè)序后獲得的結(jié)果在GeneMapper 4.1軟件上進(jìn)行分析，校正后進(jìn)行片段大小分析，將讀取后的數(shù)據(jù)錄入Excel，進(jìn)行進(jìn)一步的分析。對(duì)PCR擴(kuò)增沒有結(jié)果的樣品重復(fù)驗(yàn)證該位點(diǎn)有無擴(kuò)增片段。分析數(shù)據(jù)按照引物對(duì)應(yīng)關(guān)系的核心堿基重復(fù)數(shù)來確定位點(diǎn)準(zhǔn)確大小。每對(duì)引物單獨(dú)分析并得出數(shù)據(jù)，建立原始數(shù)據(jù)矩陣。

使用GenALEx軟件對(duì)24份杏資源樣本的觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、香農(nóng)指數(shù)（I）、觀測(cè)雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、無偏期望雜合度（uHe）以及固定系數(shù)（F）等多樣性指數(shù)進(jìn)行分析。通過PowerMarker軟件分析獲得多態(tài)性信息含量（PIC）數(shù)據(jù)，基于Nei的遺傳距離獲得聚類數(shù)據(jù)，使用MEGA6軟件繪制UPGMA樹，進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光SSR引物篩選

熒光SSR標(biāo)記PCR產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳檢測(cè)后獲得電泳圖片和等位基因數(shù)據(jù)。圖1、圖2分別為PMS2、ASSR71標(biāo)記引物在1個(gè)杏品種上的擴(kuò)增產(chǎn)物帶型，峰型尖銳鋒利，周圍有若干小峰，無明顯雜峰，說明引物特異性較好，適合杏種質(zhì)資源的相關(guān)研究。參考已報(bào)道的相關(guān)文獻(xiàn)，從杏、扁桃、桃、櫻桃的引物中篩選18對(duì)引物進(jìn)行試驗(yàn)，最終獲得14對(duì)適用于杏種質(zhì)資源研究的SSR標(biāo)記引物。

2.2 不同引物的遺傳多樣性分析

利用14對(duì)引物對(duì)24份湖北杏種質(zhì)資源進(jìn)行DNA擴(kuò)增，共擴(kuò)增出162個(gè)多態(tài)性等位基因位點(diǎn)（Na，表3）。其中，最小的等位基因數(shù)目為6.000（ASSR71），最大的等位基因數(shù)目為18.000（AMPA105），平均每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)目為11.571。有效等位基因總數(shù)為90.312，數(shù)值變化范圍在2.887（ASSR71）～11.520（AMPA105），平均每個(gè)位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)目為6.451。有效等位基因數(shù)低于觀測(cè)等位基因數(shù)，表明在基因組中存在一些高頻率的等位基因。各位點(diǎn)的觀測(cè)雜合度（Ho）變異幅度在0.417（UDP97-402）～0.833（AMPA112），平均Ho為0.652，期望雜合度（He）在0.654（ASSR71）～0.913（AMPA105），平均He為0.813，說明試驗(yàn)材料具有較高的多態(tài)性，分子標(biāo)記質(zhì)量較好。香農(nóng)指數(shù)（I）范圍在1.302（ASSR71）～2.638（AMPA105），平均值為2.031。多態(tài)性信息含量（PIC）數(shù)值范圍在0.610（ASSR71）～0.907（AMPA105），平均值為0.794，其中所有引物的多態(tài)性信息含量均在0.600以上，說明試驗(yàn)使用的引物多態(tài)性較高。由以上結(jié)果可以看出，所選的標(biāo)記具有豐富的多態(tài)性，能在分子水平上準(zhǔn)確反映各品種間的遺傳關(guān)系，同時(shí)也說明24份湖北省地方杏樣本在分子水平上具有較高的遺傳多樣性。

2.3 聚類分析

為了解湖北杏種質(zhì)資源之間的遺傳關(guān)系，在PowerMarker中對(duì)24份資源的遺傳距離進(jìn)行計(jì)算?；贜ei的遺傳距離［22］，使用MEGA6軟件進(jìn)行個(gè)體的UPGMA樹聚類分析（圖3）。

根據(jù)聚類分析結(jié)果，在相似系數(shù)0.580處將24份資源分為3組。

第1組由洪平杏獨(dú)立成組。洪平杏是杏屬內(nèi)一狹域分布種，僅見于神農(nóng)架林區(qū)。關(guān)于洪平杏在杏屬的分類地位一直有爭(zhēng)議，有學(xué)者根據(jù)形態(tài)學(xué)推測(cè)其可能為梅和杏的天然雜交種，也有學(xué)者依據(jù)形態(tài)研究認(rèn)為其為梅的一個(gè)變種，另有相關(guān)形態(tài)研究表明其為一個(gè)獨(dú)立的種，但與梅的關(guān)系更近。

第2組由榔梅、杏梅、老杏梅、桃李杏4個(gè)品種組成。其中榔梅來自丹江口市，杏梅和老杏梅來自鐘祥市，桃李杏來自大悟縣。丹江口市的榔梅與鐘祥市的杏梅沒有區(qū)分開，疑似同名異物資源。榔梅、杏梅、桃李杏3個(gè)品種親緣關(guān)系非常近。

第3組由19個(gè)品種組成。來源于巴東縣的米杏與黃梅縣的五祖杏、大河杏（1）、大河杏（2）聚成小組，大悟縣的小麥杏與廣水市的中熟杏、秭歸縣的荷包杏與秭歸本地杏（2）聚成小組。

3 小結(jié)與討論

本研究采用熒光SSR分子標(biāo)記技術(shù)分析了湖北省地方杏品種資源的遺傳變異和親緣關(guān)系。用14對(duì)SSR特異性引物擴(kuò)增出豐富的多態(tài)性條帶，顯示出所用引物具有較高的鑒別湖北省地方杏品種資源的能力。SSR位點(diǎn)的特征指數(shù)數(shù)據(jù)，如雜合度、香農(nóng)指數(shù)等，揭示了湖北省地方杏品種具有豐富的遺傳變異性。本研究結(jié)果為進(jìn)一步分析和利用湖北省杏品種資源提供了理論依據(jù)。

目前，SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳技術(shù)在杏上已有應(yīng)用，主要用于種質(zhì)遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)鑒定、親本分析等方面。但是全世界范圍類已開發(fā)的杏SSR標(biāo)記都較少，近源物種的SSR分子標(biāo)記具有較高的通用性，杏種質(zhì)資源的研究大多采取近源物種的SSR分子標(biāo)記。本試驗(yàn)選用的14對(duì)引物中，除杏引物3對(duì)外，還有近源物種桃引物7對(duì)、扁桃引物2對(duì)和櫻桃引物2對(duì)。

14對(duì)SSR引物在24份杏種質(zhì)中共檢測(cè)到162個(gè)等位基因（Na），平均每個(gè)位點(diǎn)11.571個(gè)；多態(tài)信息含量（PIC）為0.610～0.907，均值為0.794，本研究結(jié)果表明近緣植物SSR分子標(biāo)記在杏種質(zhì)資源中具有較高的通用性，與斯欽畢力格等［8］、張淑青等［12］的研究結(jié)論一致。除杏引物外，相對(duì)于扁桃、櫻桃來說，普通桃SSR引物在杏中的種質(zhì)多態(tài)性最高，適合作為杏種質(zhì)資源研究的SSR分子標(biāo)記不足的補(bǔ)充。

聚類分析結(jié)果顯示，14對(duì)引物未能將來自丹江口市的榔梅與鐘祥市的杏梅進(jìn)行有效區(qū)分，兩份資源是否為同物異名資源，需要進(jìn)一步研究。同名的小麥杏資源有3份，分別來自鐘祥市、大悟縣、廣水市，根據(jù)DNA擴(kuò)增結(jié)果3份資源存在明顯差異，說明3份資源為同名異物資源。同名為杏梅的資源有3份，1份來自鐘祥市，另外2份來自廣水市，根據(jù)DNA擴(kuò)增結(jié)果3份資源存在明顯差異，說明3份資源為同名異物資源。通過SSR分子標(biāo)記擴(kuò)增，有效區(qū)分了湖北省的部分同名杏品種，甚至是同一區(qū)（縣）的同名物種，對(duì)湖北省地方同名異種品種的鑒定提供了有效的篩選SSR分子標(biāo)記。

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收稿日期：2024-04-16

基金項(xiàng)目：湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心項(xiàng)目（2021-620-000-001-01）；湖北省種業(yè)高質(zhì)量發(fā)展專項(xiàng)資金（HBZY2023A001-52）；湖北省農(nóng)業(yè)科技重點(diǎn)課題與平臺(tái)專項(xiàng)（2021-620-005-003）

作者簡(jiǎn)介：葉緣銘（1996-），女，湖北孝感人，研究實(shí)習(xí)員，碩士，主要從事果樹資源研究，（電話）18772129249（電子信箱）1376148681@qq.com；通信作者，田 瑞（1978-），男，湖北荊門人，副研究員，碩士，主要從事果樹種質(zhì)資源與遺傳育種研究，（電話）027-87770272（電子信箱）79011129@qq.com；蔡 化，（電子信箱）34582248@qq.com。