關(guān)鍵詞：五價釩；釩還原菌；電子傳遞；小球藻；斜生柵藻

釩（V）是普遍存在于地殼中的過渡金屬元素，其具有良好的延展性、抗腐蝕性以及導電性被廣泛應(yīng)用于鋼鐵生產(chǎn)、航天航空、材料等領(lǐng)域。長期以來含釩合金鋼的生產(chǎn)、釩礦的開采以及化石燃料的燃燒等人為活動造成環(huán)境中的釩污染嚴重。釩的毒性與其價態(tài)相關(guān)，化合價越高毒性越強，V（V）毒性最大且遷移性強。研究表明，人體暴露于高劑量釩后可能會損害人體腎臟及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導致生殖和發(fā)育異常，長期累積會促使蛋白質(zhì)變性以及干擾酶的運輸，進而會誘發(fā)癌癥的產(chǎn)生。相比物理法和化學法修復釩污染，微生物法因具有效率高、選擇性強以及成本低等優(yōu)點而受到研究者們的廣泛關(guān)注。

電子傳遞是微生物重要的代謝方式，其可以將胞內(nèi)氧化有機物過程中產(chǎn)生的電子輸出到胞外受體，實現(xiàn)了電子在胞內(nèi)和胞外物質(zhì)之間的高效傳遞并產(chǎn)生能量以維持微生物自身生長。電子傳遞主要有直接電子傳遞和間接電子傳遞兩種方式，直接電子傳遞是通過胞外膜上的細胞色素c或納米導線將電子傳遞至胞外受體，間接電子傳遞是由電子穿梭體如核黃素、吩嗪類等介導電子傳遞至電子受體。研究表明，V（V）還原與電子傳遞過程密切相關(guān)，并且V（V）和V（Ⅳ）能分別通過磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白和陽離子通道進入細胞質(zhì)。Myers等首次證明V（V）還原是由一個完整的電子傳遞鏈介導，該過程由細胞質(zhì)膜成分（甲醌和細胞色素CVmA）和外膜細胞色素OmcB、OmcA組成，并通過電子自旋共振譜證實溶液中的V（V）被還原為V（Ⅳ）。Carpentier等以釩酸鹽為Shewanella oneiden.si.s MR-1唯一電子受體，以乳酸為電子供體驅(qū)動厭氧釩呼吸。通過氧化脈沖實驗發(fā)現(xiàn)釩酸鹽還原過程中發(fā)生了質(zhì)子跨細胞膜易位，并證實膜結(jié)合的甲醌和細胞色素c參與釩還原。在Shewanella loihica PV-4處理V（V）和Cr（Ⅵ）的復合污染中發(fā)現(xiàn)，含有細胞色素c的膜組分、可溶性蛋白質(zhì)以及NADH的細胞質(zhì)組分可能參與V（V）和Cr（Ⅵ）的還原，并且發(fā)現(xiàn)大多數(shù)Cr（Ⅵ）在細胞外被還原，而V（V）則傾向于通過細胞內(nèi)過程被還原。

重金屬對生物體的毒性評價一直是環(huán)境毒理領(lǐng)域的研究重點。藻類作為初級生產(chǎn)者，其易培養(yǎng)、繁殖快、對重金屬敏感，在較短時間內(nèi)可得到重金屬對藻類的毒性系數(shù)，是檢測毒性效應(yīng)的重要途徑。在釩對藻類的毒性評價研究中，Shu等發(fā)現(xiàn)高濃度的釩抑制了小球藻Chlorella vulgaris的生長，Meisch等研究表明釩對小球藻Chlorella pyrenoido.sa的細胞分裂具有毒性影響。Tambat等發(fā)現(xiàn)受釩脅迫的山梨小球藻Chlorella .sorokiniana SU1和岡綠小藻Picochlo-rum oklahomen.si.s會導致活性氧積累，抑制葉綠素的合成，還會產(chǎn)生膜脂過氧化等現(xiàn)象。

盡管一些具有V（V）還原功能的細菌被鑒定并分離出來，但釩還原菌如何在代謝過程中傳遞電子還原V（V）仍是值得探討的問題。此外，關(guān)于微生物還原V（V）后產(chǎn)物的毒性研究較少?；诖?，本研究采用篩選菌株Enterobacter kobei NC1-2，研究不同的電子傳遞抑制劑阻斷電子傳遞鏈，以探討菌株還原V（V）過程中的電子傳遞途徑，并以核黃素為電子穿梭體探究其對菌株還原V（V）的影響，最后利用兩種綠藻對菌株還原V（V）后的產(chǎn)物進行毒性評價，為利用微生物修復釩污染提供科學依據(jù)。

1材料和方法

1.1供試材料

藥品：釩標準液，濃度1000mg·L-1，購于國家標準物質(zhì)檢測中心；偏釩酸鈉（NaV03），純度gt;99.5%；環(huán)乙二胺四乙酸（CyDTA），純度99.5%；4-（2-吡啶）偶氮間苯二酚（PAR），純度98%；核黃素（Riboflavin），純度98%；奎那克林（Quinacrine Dihydrochloride），純度98%；無水氯化銅（CuC12），純度99.99%；N-乙酰-L-蛋氨酸（AcMet），純度98.5%；辣椒素（N-Vanillvlnon-anamide），純度97%；魚藤酮（Rotentone），純度98%；抗霉素A（Antimycin A），純度98%。以上試劑均購于上海阿拉丁試劑有限公司。

試驗菌種：供試菌株為本實驗室從釩污染礦區(qū)土壤中分離篩選出的對釩具有較高抗性的Enterobacterkobei NC1-2。菌株NC1-2為一株革蘭氏陰性菌，單菌落呈淡黃色，表面光滑濕潤，邊緣整齊。菌體呈現(xiàn)短棒狀，周身有鞭毛。吲哚、甲基紅、檸檬酸鹽、鳥氨酸脫羧酶反應(yīng)以及山梨醇、蔗糖、蜜二糖、過氧化氫酶反應(yīng)均為陽性，VP試驗、淀粉水解為陰性。

菌懸液制備：將菌株NC1-2接種至固體培養(yǎng)基（胰蛋白胨30g·L-1，酵母浸粉3g·L-1，瓊脂15g·L-1），置30℃完全厭氧條件下培養(yǎng)24h。挑取單菌落接至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中（胰蛋白胨10g·L-1，牛肉浸粉3g·L-1，氯化鈉5g·L-1），培養(yǎng)24h后4000r·min-1離心10min收集菌體，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS，0.1mol·L-1pH=7.0）沖洗3次再將其重懸于無菌PBS溶液中，得到菌體濃度為10cells·mL-1的單一菌懸液。

綠藻的來源和培養(yǎng)：蛋白核小球藻（Chlorella py-renoido.so）和斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）均購于中國科學院淡水藻種庫，編號分別為FACHB-5和FACHB-13，采用高溫高壓滅菌后的BG11培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

藻種培養(yǎng)條件：照度2000lx，明暗比12h：12h，溫度25℃。將小球藻和斜生柵藻分別培養(yǎng)至藻密度在683nm和690nm波長下光密度值為0.4-0.5，備用。

1.2試驗方法

初始V（V）濃度對菌株還原V（V）的影響：向滅菌后的NB培養(yǎng)基中加入不同劑量的NaV03儲備液，使溶液中V（V）濃度分別為0、20、40、80mg·L-1和160mg·L-1，體系中初始接菌量為1×106 cells·mL-1，于30℃、150r.min-1恒溫振蕩培養(yǎng)。使用無菌注射器在0、1、2、3、4、5、6d和7d內(nèi)定期取樣，測定OD600以及V（V）濃度。

電子傳遞抑制劑對V（V）還原的影響試驗：選擇辣椒素、奎那克林（濃度設(shè)置均為5、10、50umol·L-1和100umol·L-1），CuCl2、N-乙酰-L-蛋氨酸（濃度設(shè)置均為25、50、100umol-L-1和200umol·L-1），魚藤酮（濃度設(shè)置為0.1、0.5、1.0mmol·L-1和2.0mmol·L-1），抗霉素A（濃度設(shè)置為0、25、50umol·L-1和100umol．L-1），V（V）初始濃度為40mg·L-1，細菌接種量1X106cells·mL-1．在30℃、150r.min-1的恒溫搖床中避光培養(yǎng)。每個處理3次重復。

核黃素對V（V）還原的影響試驗：以核黃素作為電子穿梭體，設(shè)置核黃素濃度為0、2.5、5、10umol·L-1，初始V（V）濃度為40mg·L-1，pH 7.0，細菌接種量1X106cells·mL-1，充氮氣保證體系處于厭氧環(huán)境下，在30℃、150r.min-1的恒溫搖床中避光培養(yǎng)48 h測定V（V）的濃度。同時測定樣品OD600值以表征核黃素對菌株受釩脅迫下生長狀況的影響。采用電化學循環(huán)伏安法表征核黃素對微生物還原V（V）的電子得失能力。

V（V）還原對兩種綠藻生長的影響試驗：設(shè)置V（V）濃度為160 mg·L-1，微生物接種量為1X106cells·mL-1，還原試驗在30℃、150r·min-1的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進行，在第0天和第7天取樣測定V（V）含量。菌株還原V（V）后對綠藻的毒性試驗在96微孔板中進行，在空白組和對照組中各加入培養(yǎng)至對數(shù)生長期的藻液100uL，對照組中依次加入V（V）還原產(chǎn)物溶液100uL，空白組中加入純培養(yǎng)菌液離心過濾所得上清液100uL，使孔內(nèi)溶液總體積為200uL。將微孔板置于25℃、照度2000lx、明暗比為12h：12h的人工氣候箱中培養(yǎng)，分別在24、48、72h和96h時取樣，用酶標儀測定OD值以表征綠藻生長情況。同時，測定暴露96h后藻體葉綠素a含量的變化。

1.3分析測定方法

V（V）測定：采用4-（2一吡啶）偶氮間苯二酚分光光度法。綠藻葉綠素a含量測定：采取乙醇提取法，取10mL搖勻后的藻液置于離心管中，在10000r·min-1下離心10min，棄上清液，加入5mL95%的乙醇溶液，超聲破碎20min，置于4℃條件下避光保存。提取液于24h后取出，將其在4℃、10000r·min-1條件下離心10min，取上清液測定其在649nm及665nm處的吸光度，以95%乙醇做空白參比，并計算綠藻葉綠素a含量。

V（V）還原后溶液的循環(huán)伏安法分析：將待測樣品用氮氣曝氣20min后密封，快速移至電化學三電極體系中測定（CHI-660E型電化學工作站，上海辰華儀器有限公司）。工作電極：玻碳電極；對電極：鉑絲電極；參比電極：飽和甘汞電極。掃描范圍為-0.8～0.8V，掃描速率為0.005V·s-1。

掃描電鏡一能量散射X射線譜（SEM-EDS）：4000r·min-1離心10min收集反應(yīng)后的菌體沉淀，于5%戊二醛溶液中4℃固定過夜，用PBS緩沖溶液洗滌菌體3次，通過30%、50%、70%和90%的乙醇溶液依次梯度脫水，用丙酮溶液置換兩次，將樣品置于C02臨界點干燥儀中干燥，最后使用Hitachi S-4800冷場發(fā)射掃描電鏡（日立，日本）觀察菌株及還原V（V）后的細胞形貌，X-Max N150X射線能譜儀（牛津儀器，上海）點掃描分析沉淀物成分。

X射線光電子能譜（XPS）：樣品溶液8000r·min-1、10min離心得到沉淀，并用去離子水清洗2～3遍，放人-80℃冷凍干燥，24h后取出樣品并將其研磨過200目篩，采用高性能X射線光電子能譜進行觀察。

1.4數(shù)據(jù)處理

V（V）還原率計算方法：

除產(chǎn)物表征外，搖瓶試驗均重復3次，處理結(jié)果均以平均值±標準差表示，相關(guān)數(shù)據(jù)使用Excel和Ori-gin 2021軟件分析處理。XPS數(shù)據(jù)使用XPSPEAK軟件分析。

2結(jié)果與分析

2.1Enterobacter kobei NCI-2對V（V）的還原及其產(chǎn)物分析

Enterobacter kobei NC l-2對V（V）的還原動力學如圖1所示。當V（V）初始濃度為20mg·L-1時，連續(xù)培養(yǎng)3d時V（V）的還原率為90.3%，連續(xù)培養(yǎng)7d時V（V）的還原率為91.2%。當V（V）濃度為160mg'L-1時，培養(yǎng)3d時V（V）的還原率為82.6%，培養(yǎng)7d時V（V）的還原率為96.3%。研究結(jié)果表明，菌株NCl-2在較大V（V）濃度范圍內(nèi)具有良好的V（V）還原能力，且初始V（V）濃度越高，其還原速率越快。圖1b顯示，菌株NC1-2生長活性隨V（V）濃度的升高呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，當V（V）濃度低于40mg·L-1時，對NC1-2生長有一定的刺激作用，隨著V（V）濃度增加，菌株生長受到抑制。低濃度V（V）促進菌株的生長，但高濃度V（V）在一定程度上抑制菌株生長。

通過掃描電鏡觀察菌體還原V（V）前后形貌的變化，從圖2中可以觀察到添加V（V）的菌體呈現(xiàn)凹陷、破損且不規(guī)則的形態(tài)，可能是還原過程中菌體受到氧化損傷所致。此外，還觀察到細胞表面有無定形物質(zhì)附著，其可能是V（V）生物還原過程中的還原產(chǎn)物。進一步對該無定形物質(zhì)進行能譜分析，結(jié)果表明無定形物質(zhì)中含有V。SEM-EDS證實菌株表面有含V化合物的存在。

為了驗證V（Ⅳ）的存在，采用X射線光電子能譜儀對微生物還原V（V）試驗中固相產(chǎn)物進行表征分析，如圖3所示。在250-550 eV之間監(jiān)測到4個明顯的特征峰，分別代表Cls、Nls、V2p和Ols。通過V2p軌道峰后可以看出3個不同的特征峰，2pl/2軌道中524.1 eV和2p3/2軌道中517.7 eV處出現(xiàn)的特征峰對應(yīng)V（V），2p3/2軌道中515.9 eV出現(xiàn)的特征峰對應(yīng)V（Ⅳ）。以上結(jié)果證實NC1-2能將V（V）還原為V（Ⅳ），從而有效地降低了V（V）毒性。

2.2電子傳遞抑制劑對E．kobei NC1-2還原V（V）的影響

呼吸鏈抑制劑能阻斷特定的電子傳遞途徑，菌株在還原V（V）過程中的電子轉(zhuǎn)移過程如圖4所示。當添加50umol·L-1的辣椒素和奎那克林，培養(yǎng)24h時菌株對V（V）的還原率分別為40.0%和74.3%，培養(yǎng)48h菌株對V（V）的還原率分別為68.3%和92.8%；隨著兩種抑制劑濃度升高，菌株對V（V）的抑制作用增強。研究發(fā)現(xiàn)，辣椒素可作用于NADH脫氫酶抑制電子傳遞途徑，奎那克林可用作FAD脫氫酶的抑制劑阻礙電子傳遞過程。研究結(jié)果表明NADH脫氫酶和FAD脫氫酶可能催化菌株對V（V）還原過程的電子傳遞過程，且NADH在電子傳遞過程中起主導作用。

CuCl2可以通過抑制NADH-CoQ從而抑制電子傳遞途徑，當分別添加100、200umol·L-1 CuC12時，培養(yǎng)24h時V（V）的還原率分別為54.1%、33.9%，培養(yǎng)48h時V（V）的還原率分別為73.7%、65.4%。但當CuC12濃度為25umol·L-1時，培養(yǎng)后期對菌株還原V（V）有輕微的促進作用。Cu2+作為重金屬離子對菌株有毒害作用，可能在生長過程中產(chǎn)生氧化損傷，隨著CuC12濃度升高，V（V）的還原被明顯的抑制。

抗霉素A可以阻礙Cyt bL-CVt bH的胞外電子傳遞途徑，魚藤酮常用于細胞膜內(nèi)電子傳遞系統(tǒng)，包括泛醌氧化還原活性酶、醌類、細胞周質(zhì)的細胞色素載體等，N-乙酰-L-蛋氨酸多用于細胞膜上細胞色素c功能障礙的研究。當添加不同濃度的上述三種抑制劑時發(fā)現(xiàn)，菌株對V（V）的還原并未被抑制，并且當添加魚藤酮時，V（V）的還原反而被促進。以上結(jié)果表明，菌株對V（V）的還原可能仍主要在胞內(nèi)進行，當使用抑制細胞膜上細胞色素等相關(guān)電子傳遞抑制劑時，并未對菌株還原V（V）的過程產(chǎn)生明顯抑制作用。這驗證了菌株對V（V）的還原主要在胞內(nèi)進行，而菌株生長代謝產(chǎn)生的對V（V）具有氧化還原活性的物質(zhì)主要在胞內(nèi)產(chǎn)生。

2.3電子穿梭體核黃素對E．kobei NCl-2還原V（V）的影響

微生物自身分泌或外源的黃素類物質(zhì)、吩嗪、醌類等有機分子被認為能作為電子穿梭體參與微生物的胞外電子傳遞。為探究核黃素能否促進菌株還原V（V）的過程，不同核黃素濃度下菌株對V（V）的還原結(jié)果如圖5所示。當核黃素濃度分別為0、2.5、5、10umol·L-1時，培養(yǎng)12h時，V（V）的還原率分別為51.3%、53.8%、58.9%、67.7%；培養(yǎng)24h時，V（V）的還原率分別為84.2%、91.6%、92.4%、91.4%。隨著核黃素濃度升高，菌株生長也受到不同程度的促進作用，如圖5b所示，培養(yǎng)24h時，菌株生長隨核黃素濃度增大而明顯增強。以上結(jié)果表明核黃素有利于菌株對V（V）的還原，同時促進菌株生長代謝。

為探究核黃素在還原過程中的作用機理，分別測定了不含核黃素以及添加10umol·L-1核黃素的菌株還原V（V）時溶液氧化還原電位變化及CV曲線，如圖6所示。培養(yǎng)12h時，不添加核黃素和添加10umol·L-1核黃素溶液體系的氧化還原電位分別為-79、-102mV；隨著培養(yǎng)時間延長，氧化還原電位差異逐漸增大，培養(yǎng)48 h時，不添加核黃素和添加10umol·L-1核黃素溶液體系的氧化還原電位分別為-304、-382mV，如圖6a所示。這可能是由于核黃素加速菌株生長代謝，使得氧化還原電位降低并加速V（V）的還原，也可能核黃素促進菌株還原V（V）時，產(chǎn)生較多的還原酶等物質(zhì)，使得氧化還原電位降低。

從圖6b可以看出，不添加V（V）時，菌液的CV曲線在-0.236V處m現(xiàn)特征峰，表明菌株在生長代謝過程中可能產(chǎn)生了氧化還原活性物質(zhì)。CV曲線的封閉區(qū)域可用于表征體系中的電子轉(zhuǎn)移能力。對比不添加V（V）、添加40mg·L-1V（V）時CV曲線面積和峰值電流明顯增大，溶液分別在-0.119V和0.094V附近出現(xiàn)氧化還原峰，表明溶液中的氧化還原反應(yīng)增強。添加核黃素后對電化學活性有明顯增強的效果，可能的原因是核黃素促進了菌株還原V（V）的電子傳遞過程。

2.4E.kobei NC1-2還原V（V）過程中的電子傳遞強化機制

為了驗證核黃素對菌株還原V（V）的促進機理及V（V）還原過程中的電子傳遞鏈，向含有電子傳遞抑制劑的溶液中加入核黃素，研究體系中V（V）的微生物還原效率，結(jié)果如圖7所示。根據(jù)V（V）與3種電子傳遞抑制劑的直接化學反應(yīng)表明，抑制劑并不會直接還原V（V），當向菌株還原V（V）溶液中加入抑制劑后，V（V）還原率降低，這表明抑制劑能有效阻斷V（V）還原的電子傳遞過程。

如圖7a所示，當向含100umol·L-1辣椒素的V（V）微生物還原體系中加入10umol·L-1核黃素，培養(yǎng)24h時V（V）的還原率為55.6%，培養(yǎng)48h時V（V）還原率增加至88.0%。如圖7b所示，當向含100umol·L-1奎那克林的V（V）微生物還原體系中加入10umol·L-1核黃素，培養(yǎng)48h時V（V）的還原率為91.1%，略高于只含抑制劑的組分。如圖7c所示，當向含100pmol·L-1 CuCl2的V（V）微生物還原體系中加入10pmol·L-1核黃素，培養(yǎng)48h時V（V）的還原率為93.6%，高于微生物體系中加入CuC12，其V（V）的還原率為73.4%。以上結(jié)果表明，連續(xù)培養(yǎng)48h后，添加核黃素的處理中電子傳遞抑制劑的作用明顯減弱，這表明核黃素降低了抑制劑在V（V）還原的電子傳遞過程中的影響，NADH脫氫酶及FAD脫氫酶可能是菌株還原V（V）電子傳遞鏈中的重要一環(huán)。核黃素作為黃素輔酶FAD和FMN的前體物質(zhì)可能參與菌株生長，促進微生物代謝過程，另一方面核黃素可能參與到微生物還原V（V）的電子傳遞過程中，并強化被特定阻斷的電子傳遞過程，從而促進菌株對V（V）的還原。

2.5V（V）微生物還原對蛋白核小球藻和斜生柵藻生長的影響

V（V）微生物還原前后對蛋白核小球藻及斜生柵藻生長的影響，如圖8所示。V（V）對兩種綠藻的生長在不同暴露時間內(nèi)呈現(xiàn)不同的作用效果，根據(jù)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)隨著時間的延長，小球藻和斜生柵藻的藻密度增加，且V（V）還原前后對藻密度具有顯著的影響（Plt;0.05）。圖8a為V（V）微生物還原前后蛋白核小球藻藻密度的變化，與對照處理相比，V（V）還原前在48h后，藻密度顯著降低，說明V（V）對小球藻生長有抑制，這可能與小球藻對V（V）的耐受性有關(guān)。V（V）還原后，藻密度明顯增加，OD683值為1.5，且高于對照組OD683值（1.2），說明V（V）還原為V（Ⅳ）后對小球藻毒性會降低。圖8b為V（V）生物還原前后對斜生柵藻生長的影響，V（V）還原后的產(chǎn)物同樣在48h后顯著促進了斜生柵藻的生長，以上結(jié)果表明菌株對V（V）的還原降低了釩對藻類的脅迫作用。這可能是因為E.kobei將V（V）還原為V（Ⅳ），毒性降低，同時釩能參與固氮酶作用，對藻類生長具有一定程度的促進效果。

圖9為菌株還原V（V）前后兩種綠藻中葉綠素a含量。葉綠素含量的高低與藻類的生長密切相關(guān)，葉綠素含量降低表明環(huán)境對其生長有阻礙作用，反之則有促進作用。與對照處理相比，V（V）還原前，在暴露96h后小球藻和斜生柵藻的葉綠素a含量分別為13.9、9.5mg·L－1，與V（V）還原前的處理相比，V（V）還原后在暴露96 h后小球藻和斜生柵藻的葉綠素a含量分別顯著增加3.5、6.3mg·L-1（Plt;0.05）。結(jié)果表明隨著V（V）被還原沉淀，暴露在還原產(chǎn)物中生長的小球藻和斜生柵藻中的葉綠素a含量均有所提高。菌株對V（V）的還原降低了釩對綠藻可能產(chǎn)生的脅迫作用，且低濃度釩對藻類的生長有促進效果。

3討論

3.1微生物對V（V）的還原及其影響因素

微生物通過其自身的代謝過程將V（V）轉(zhuǎn)化為毒性較小的V（Ⅳ），已成為環(huán)境中釩污染治理的研究熱點。Zhang等發(fā)現(xiàn)在純培養(yǎng)條件下兩種產(chǎn)甲烷菌Methano.sarcma mazeL和Methanothermobacter thermau-totrophicu.s均對V（V）具有還原能力，且后者作為嗜熱菌，能在65℃環(huán)境下表現(xiàn)出較優(yōu)的釩還原能力。Carpentier等發(fā)現(xiàn)Shewanella oneiden.si.s通過乳酸鹽、甲酸鹽和丙酮酸的厭氧氧化反應(yīng)還原V（V），并形成固體沉淀。Shewanella putrefaciens能將V（V）作為唯一電子受體還原，當初始V（V）濃度為5mg·L-1時，在2d內(nèi)對V（V）的去除率達到77%。Ortiz-Bemad等發(fā)現(xiàn)Geobacter metallireducens以醋酸鹽作為電子供體，能有效去除地下水中V（V），電子顯微探針分析V（V）還原沉淀物可能是[CaV2（PO4）2（0H）4．3H20]。van Marwijk等分離出一株腸桿菌Entero-bacter cloacae能還原V205并形成沉淀，但未對較高濃度下釩還原及機理進行探究。近年來通過高通量測序和宏基因組等技術(shù)發(fā)現(xiàn)腸桿菌（Enterobacter）、假單胞菌（P.se udomona.s）、沉淀桿菌（Sedimentibacter）、芽孢桿菌（Bacillu.s）、陶氏菌（Thauera）等能作為優(yōu)勢菌屬參與到V（V）還原過程中，但目前有關(guān)神戶腸桿菌還原V（V）的報道較少。

本研究表明隨著V（V）初始濃度增大，會加快菌株NC1-2對V（V）的還原。郝麗婷通過屎腸球菌Enterococcus faecium對不同初始濃度的V（V）還原研究與我們的研究結(jié)論一致。Zhang等研究結(jié)果也表明隨著V（V）初始濃度的增大，Lactococcus raf-finolactis對V（V）的還原率升高。菌株的生長受到初始V（V）濃度的影響，低濃度V（V）可能會促進微生物生長，高濃度V（V）對菌株可能產(chǎn)生毒害作用，進而抑制菌株的生長。釩酸鹽和磷酸鹽化學結(jié)構(gòu)相似，相較于其他重金屬元素的毒性較小。

本研究通過SEM發(fā)現(xiàn)菌株在還原V（V）后，細胞表面有不定形物質(zhì)附著，且出現(xiàn)凹陷、破損現(xiàn)象，因此V（V）還原過程中可能會對菌體產(chǎn)生氧化損傷，導致部分菌體細胞膜破損使得胞內(nèi)V（Ⅳ）溶出，最終附著在細胞表面。通過對V（V）還原后的固相產(chǎn)物進行XPS分析，結(jié)果顯示存在V（V）和V（Ⅳ），表明菌株NC1-2吸附還原V（V）時，其表面除V（Ⅳ）外還存在部分V（V），證明菌株NCI-2吸附還原V（V）過程同時包含吸附作用和還原作用。

3.2微生物還原V（V）過程中的電子傳遞

在研究菌株的電子傳遞過程中，利用電子傳遞抑制劑特異性阻斷了菌株可能存在的電子傳遞鏈，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與細胞色素c等膜上電子傳遞機制相關(guān)的抑制劑效果不顯著，表明E．kobei NC1-2對V（V）的還原可能與膜結(jié)合物質(zhì)的直接關(guān)聯(lián)較小。CV曲線結(jié)果表明純培養(yǎng)的菌液中存在氧化還原活性物質(zhì)，但相比文獻報道中的產(chǎn)電菌能力較差。研究表明核黃素作為內(nèi)源性電子穿梭體具備增強電子傳遞的能力，地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis可以利用希瓦氏菌分泌的核黃素加速不銹鋼的腐蝕，嗜甲基菌Methylophi-lus methylotrophs能通過核黃素和細胞色素c將電子傳遞至細胞外的水鐵礦。通過向菌株還原V（V）溶液中添加核黃素，發(fā)現(xiàn)促進了菌株生長和V（V）還原，并使得氧化還原電位降低，因此核黃素在參與菌株代謝過程中可能直接充當電子穿梭體的作用。Masuda等發(fā)現(xiàn)Lactococcus lactis以黃素單核苷酸作為電子穿梭體能促進電子轉(zhuǎn)移。當向抑制菌株NADH脫氫酶、FAD脫氫酶的溶液中加入核黃素后發(fā)現(xiàn)，菌株對V（V）的還原被明顯促進，表明這些物質(zhì)可能在E．kobei NC1-2還原V（V）過程中起到重要的催化作用，核黃素在E．kobei NC1-2代謝過程中扮演重要角色，也表明菌株在還原V（V）過程中存在多條電子傳遞途徑，核黃素可能作為FAD的前體物質(zhì)參與菌株對V（V）的胞內(nèi)還原。

3.3 V（V）微生物還原的毒性評價

從V（V）微生物還原前后對藻類生長的影響可以看到，E．kobei NC1-2對V（V）的還原產(chǎn)物減少了其對小球藻和斜生柵藻生長過程中的抑制作用，提高了藻類生物量和葉綠素a含量。菌株還原過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可能在一定程度上會刺激藻類的生長。Shu等發(fā)現(xiàn)釩抑制了Chlorella vulgaris拘生長，在初始濃度為400mg·L-1，50mg藻類生物量下40℃培養(yǎng)24h后，最大吸附容量達到94.0mg·g-1，但過程中并未發(fā)生氧化還原而是化學吸附的作用。Tambat等利用小球藻在處理2周后的釩去除量為25.5mg·L-1，研究表明小球藻細胞對釩的吸附及轉(zhuǎn)化主要是通過糖類及蛋白質(zhì)上的COO-基團發(fā)揮著作用。目前關(guān)于微生物菌株對V（V）還原后的產(chǎn)物進行毒性評價的相關(guān)研究較少，盡管試驗表明V（V）還原產(chǎn)物的毒性降低，但利用微生物方法還原V（V），其過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物在藻類生長過程中是否產(chǎn)生積極或消極影響仍是一個值得探討的問題。

4結(jié)論

（1）篩選獲得的菌株E．kobei NC1-2能有效還原V（V），初始濃度20mg·L-1、培養(yǎng)第3天時V（V）的還原率達到90.3%。

（2） SEM-EDS和XPS結(jié)果顯示，菌株E．kobeiNC1-2將V（V）還原為V（Ⅳ），并形成不溶性的無定型物質(zhì)附著在菌體表面。

（3）當電子傳遞抑制劑辣椒素、奎那克林濃度分別為50umol·L-1，CuCl2濃度為100umol·L-1時，均對E．kobei NC1-2還原V（V）產(chǎn)生明顯的抑制作用，而魚藤酮、N-乙酰-L-蛋氨酸和抗霉素A的抑制效果不顯著。添加電子穿梭體核黃素能加快菌株的生長，促進了V（V）微生物還原。

（4）將小球藻和斜生柵藻培養(yǎng)在V（V）微生物還原后的溶液中，96h后兩種綠藻的藻密度均提高，同時葉綠素a含量均顯著升高，菌株E．kobei NC1-2對V（V）的還原降低了V（V）對小球藻和斜生柵藻生長的抑制作用。