摘要： 【目的】篩選和識別大河豬背脂沉積相關(guān)的關(guān)鍵候選基因?！痉椒ā繉Ω弑潮旌偷捅潮旄? 頭大河豬的背部脂肪組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選差異表達(dá)基因并對其GO 功能和KEGG 通路富集進(jìn)行分析，結(jié)合蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，對大河豬背脂沉積關(guān)鍵基因進(jìn)行發(fā)掘與鑒定，再隨機挑選3 個關(guān)鍵基因進(jìn)行RT-qPCR驗證?！窘Y(jié)果】共檢測到214 個差異表達(dá)基因，在高背膘組大河豬中有107 個基因上調(diào)，107 個基因下調(diào)。這些基因極顯著富集于氧酸代謝、有機酸代謝、脂質(zhì)代謝、羧酸代謝等生物學(xué)過程，以及過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR） 信號通路、腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activatedprotein kinase，AMPK） 信號通路、丙酮酸代謝、三羧酸循環(huán)等脂肪沉積調(diào)控通路（Plt;0.01），其中，PCK1、ME1、ACLY、ACACA、FASN 和SCD 為背脂沉積的關(guān)鍵基因。隨機挑選的3 個關(guān)鍵基因（PCK1、ACLY 和ME1） 在高、低背膘組大河豬背部脂肪中的表達(dá)差異達(dá)到顯著或極顯著水平（Plt;0.05 或Plt;0.01）?！窘Y(jié)論】研究結(jié)果初步鑒定了大河豬背脂沉積的關(guān)鍵基因，為深入揭示豬背脂沉積的分子機制及促進(jìn)瘦肉率等背脂相關(guān)性狀的遺傳改良提供了科學(xué)基礎(chǔ)和依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 大河豬；背脂沉積；轉(zhuǎn)錄組測序；關(guān)鍵基因

中圖分類號： S828.891 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號： 1004–390X （2024） 05?0023?08

隨著人們生活水平的提高，消費者對優(yōu)質(zhì)豬肉的需求日益增長，對豬的瘦肉率也有了更高要求。脂肪沉積作為豬的重要經(jīng)濟性狀之一，不僅直接影響瘦肉率和豬肉品質(zhì)，還影響生長速度和飼料轉(zhuǎn)化效率[1]。豬的背膘厚直接決定于背部脂肪沉積量，與豬肉的經(jīng)濟價值密切相關(guān)，已作為主選性狀普遍應(yīng)用于豬的育種方案[2]。然而，受測定規(guī)模和準(zhǔn)確性等因素影響，常規(guī)育種方法的選擇強度和改良效果受到了一定限制，特別是對群體規(guī)模普遍偏小的地方豬種而言，其育種效果更是大打折扣。因此，借助組學(xué)技術(shù)等發(fā)掘和鑒定具有育種價值的關(guān)鍵基因，在此基礎(chǔ)上實施分子育種以提高背膘厚及瘦肉率的改良效果，成為近年來豬遺傳育種領(lǐng)域的研究熱點。

隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展和成本降低，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)因其具有高通量、高分辨率、高靈敏度、適應(yīng)性廣等優(yōu)點，已成為揭示生物復(fù)雜性狀分子機制和解析轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的有力工具，被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)、基因注釋、代謝通路和基因調(diào)控機制等研究。近年來，人們應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)開展了豬脂肪沉積相關(guān)功能基因的挖掘，鑒定出一些與脂肪沉積相關(guān)的生物過程、代謝通路及相關(guān)基因。如：CHEN 等[3]通過不同發(fā)育階段寧鄉(xiāng)豬背部脂肪轉(zhuǎn)錄組測序，鑒定出13 個背脂組織發(fā)育的關(guān)鍵基因；PAN 等[4]基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，對杜洛克和陸川豬背部脂肪組織的差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs） 進(jìn)行功能富集分析，發(fā)現(xiàn)DEGs 主要富集于脂質(zhì)代謝、儲存和運輸通路。盡管如此，有關(guān)豬背脂沉積的分子機制至今仍不甚清楚。

大河豬是云南優(yōu)良地方豬品種，肉質(zhì)優(yōu)良，營養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨特[5]，但其背膘較厚、瘦肉率偏低（僅約42%）[6]。如何通過有效的育種措施減少背脂沉積、降低背膘厚和提高瘦肉率是大河豬選育及高效利用亟待解決的問題。但迄今為止，有關(guān)大河豬經(jīng)濟性狀的研究基本停留于表型分析層面，其背脂沉積的分子機制研究仍未見報道。本研究以高背膘和低背膘大河豬為材料，基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，通過高、低背膘組大河豬背部脂肪組織DEGs 篩選、蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)互作（protein-protein interaction，PPI） 網(wǎng)絡(luò)分析及RT-qPCR驗證，挖掘和鑒定豬背脂沉積性狀相關(guān)的關(guān)鍵基因，以探索豬背脂沉積的分子機制，為運用分子育種技術(shù)改良豬背膘厚和胴體組成提供一定的科學(xué)基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗豬群與樣品采集

選取體質(zhì)量約為25 kg 的同日齡大河豬30 頭（公母各半），在相同的日糧營養(yǎng)水平和飼養(yǎng)管理條件下飼養(yǎng)至約100 kg，根據(jù)《豬活體背膘厚和眼肌面積的測定 B 型超聲波法》（NY/T 2894—2016）測定活體背膘厚。根據(jù)測定結(jié)果選擇高背膘（highbackfat thickness，HBF） 和低背膘（low backfat thickness，LBF） 大河豬各6 頭（個體間無親緣關(guān)系，每組公、母各3 頭） 進(jìn)行屠宰，取其6～7 肋處背部脂肪組織，放入凍存管后迅速置入液氮中，于?80 ℃ 超低溫冰箱保存， 用于后續(xù)總RNA 的提取。

1.2 胴體性能測定

試驗豬在275 日齡、平均體質(zhì)量為101.93 kg時屠宰，根據(jù)《瘦肉型豬胴體性狀測定技術(shù)規(guī)范》（NY/T 825—2004） 測定宰前活質(zhì)量、平均背膘厚、胴體瘦肉率和脂肪率。

1.3 總RNA 提取與質(zhì)量檢測

采用Trizol 法進(jìn)行總RNA 的提取。使用NanoDrop2000 分光光度計測定RNA 濃度和純度；采用1% 瓊脂糖凝膠電泳和安捷倫2100 生物分析儀測定RNA 完整值，以此判斷RNA 的完整性。

1.4 全轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建與測序

所提取的總RNA 經(jīng)質(zhì)檢合格去除rRNA 后，將得到的RNA 隨機打斷為短片段，以其為模板先后合成cDNA 模板的第1、2 鏈。經(jīng)QiaQuickPCR 試劑盒純化EB 緩沖液洗脫、末端修復(fù)，加堿基A 和測序接頭后，再用尿嘧啶DNA 糖基化酶（uracil-N-glycosylase，UNG） 降解第2 鏈。構(gòu)建的測序文庫先用DNA 1000 assay Kit 試劑盒進(jìn)行質(zhì)檢，再用Illumina HiSeq? 4000 進(jìn)行測序。

1.5 DEGs 篩選及其功能分析

轉(zhuǎn)錄組測序的原始數(shù)據(jù)（raw reads） 經(jīng)FASTQ質(zhì)控后得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)（clean reads）。 采用HISAT2比對到豬參考基因組（Sscrofa11.1）， 再采用Stringtie重構(gòu)轉(zhuǎn)錄本，尋找出序列中的新基因，最后以FPKM （fragments per kilobase of transcript permillion mapped reads） 值進(jìn)行歸一化處理。以校正Plt;0.05、|log2FC|gt;1 作為基因差異表達(dá)的顯著性閾值[FC 為差異倍數(shù)（fold change）]。采用R 語言DESeq2 軟件包繪制DEGs 分布的火山圖及表達(dá)熱圖。以Plt;0.01 作為篩選顯著富集GO 條目和KEGG 通路的標(biāo)準(zhǔn)，采用clusterProfiler[7]和pathview[8]對DEGs 進(jìn)行GO 功能及KEGG 通路富集分析。

1.6 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵基因識別

為進(jìn)一步識別大河豬背脂沉積過程中起關(guān)鍵作用的基因，采用STRING 在線軟件分析了DEGs間的相互作用，并用Cytoscape 軟件構(gòu)建編碼基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)。采用cytoHubba 插件計算PPI網(wǎng)絡(luò)中各DEGs 的最大簇中心性（maximal cliquecentrality，MCC） 得分[9]。背脂沉積關(guān)鍵基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為連通性≥6，且MCC≥100。

1.7 關(guān)鍵基因驗證

從識別的關(guān)鍵基因中隨機選取3 個基因，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH） 基因為內(nèi)參基因，根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)基因的CDS 序列， 通過Primer-BLAST 設(shè)計引物，采用RT-qPCR 方法檢測關(guān)鍵基因在高、低背膘組大河豬背脂組織中的表達(dá)水平。

1.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

高、低背膘組大河豬的胴體性狀和背脂沉積關(guān)鍵基因表達(dá)水平的差異顯著性檢驗采用非配對試驗設(shè)計的t 檢驗，采用SAS 9.0 中的TTEST 過程完成，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 高、低背膘組大河豬背脂胴體性狀的差異

由表1 可知：高背膘組的平均背膘厚（52.21mm）、瘦肉率（46.32%） 和脂肪率（35.73%） 分別較低背膘組極顯著提高17.40 mm、降低5.05 個百分點和提高11.05 個百分點（Plt;0.01），而兩組豬的宰前活質(zhì)量無顯著差異（Pgt;0.05）。

2.2 DEGs 的篩選

轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控分析確認(rèn)其質(zhì)量可靠（12 個樣品Q30 均在92.76% 以上），之后進(jìn)行基因的差異表達(dá)分析。結(jié)果（圖1） 顯示：在高、低背膘組大河豬背部脂肪組織中共檢測到214 個DEGs。相較于低背膘組，高背膘組大河豬有107個DEGs 上調(diào)，107 個DEGs 下調(diào)。

2.3 GO 功能和KEGG 富集分析

GO 分析結(jié)果（表2） 顯示：大河豬背部脂肪的214 個DEGs 中，部分DEGs 極顯著富集于20條GO 條目上，包括氧酸代謝、有機酸代謝、脂質(zhì)代謝、羧酸代謝、核苷二磷酸代謝等19 個生物學(xué)過程和類固醇羥化酶活性1 個分子功能。KEGG 通路分析結(jié)果（表3） 顯示：部分DEGs 極顯著富集在6 個KEGG 通路上，且主要與過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferatoractivatedreceptor，PPAR） 信號通路、腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK） 信號通路、類固醇激素的生物合成、丙酮酸代謝、三羧酸循環(huán)等信號通路相關(guān)。

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析與背脂沉積關(guān)鍵基因鑒定

所構(gòu)建的PPI 網(wǎng)絡(luò)共包括61 個節(jié)點、98 條邊（圖2a）。MCC 得分最高的子網(wǎng)絡(luò)（圖2b） 包含6 個基因（FASN、PCK1、ACLY、ACACA、SCD、ME1） 和19 條邊。6 個基因的MCC 得分均在133以上（表4），為大河豬背部脂肪沉積的關(guān)鍵基因。

2.5 關(guān)鍵基因的RT-qPCR 驗證

由圖3 可知：隨機挑選的3 個背脂沉積關(guān)鍵基因（PCK1、ACLY、ME1） 在高、低背膘組大河豬背脂中的表達(dá)水平均呈顯著或極顯著差異（Plt;0.05 或Plt;0.01）。其中，高背膘組大河豬背脂中PCK1 基因的表達(dá)水平極顯著低于低背膘組（Plt;0.01），ACLY 和ME1 基因的表達(dá)水平顯著高于低背膘組（Plt;0.05）。

3 討論

本研究基于大河豬背部脂肪轉(zhuǎn)錄組測序篩選出214 個DEGs，識別出背脂沉積相關(guān)的6 個關(guān)鍵基因：PCK1、ME1、ACLY、ACACA、FASN 和SCD。其中PCK1 在高背膘組大河豬中下調(diào)表達(dá)， 其他基因均為上調(diào)表達(dá)， 3 個關(guān)鍵基因（PCK1、ACLY、ME1） 的RT-qPCR 驗證結(jié)果與此一致。

PCK1 基因是糖異生調(diào)控的主要控制點，其表達(dá)可通過胰島素、糖皮質(zhì)激素、高血糖素、環(huán)磷酸腺苷和飲食來調(diào)節(jié)。有研究表明：PCK1 基因可調(diào)節(jié)三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物水平，是葡萄糖生成過程的限速酶[10]。WANG 等[11]基于安慶六白豬和約克夏豬肝臟組織的轉(zhuǎn)錄組測序，推測PCK1基因可能是脂質(zhì)代謝和脂肪沉積的候選基因。JIANG等[12]對2 個不同來源約克夏豬群的全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)：PCK1 基因與背膘厚、生長速度顯著關(guān)聯(lián)。本研究顯示：PCK1 基因在高背膘組大河豬背脂中下調(diào)表達(dá)，且顯著富集在與脂肪酸（fatty acid，F(xiàn)A） 代謝、合成及成脂分化密切相關(guān)的PPAR 信號通路[13]、AMPK 信號通路[14]、丙酮酸代謝通路[15]和三羧酸循環(huán)通路[16]，推測其可能通過這些途徑調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝過程，進(jìn)而影響背脂沉積。

ME1 是一種NADP+依賴性酶，可產(chǎn)生用于FA 和膽固醇生物合成的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide pho-sphate，NADPH）。有研究發(fā)現(xiàn)：缺失ME1 基因的小鼠體質(zhì)量呈下降趨勢，且胰島素和瘦素濃度降低，腹部脂肪的LEP 基因表達(dá)也會減少[17]；但其過表達(dá)會導(dǎo)致膽固醇代謝和脂肪生成紊亂，并激活PPAR 信號通路， 增加誘發(fā)肥胖的潛在風(fēng)險[18]。LIN 等[19]發(fā)現(xiàn)：FASN 和ME1 基因在藏豬皮下脂肪中的表達(dá)明顯高于腎周脂肪。本研究中，ME1基因在高背膘組大河豬背脂中的表達(dá)顯著上調(diào)，且顯著富集在PPAR 信號通路[13]和丙酮酸代謝通路[16]中，表明該基因可能對背脂沉積有顯著影響。

ACLY 可以催化檸檬酸和CoA 形成乙酰CoA和草酰乙酸，是負(fù)責(zé)合成細(xì)胞質(zhì)中乙酰CoA （脂肪生成和膽固醇生成的常用底物） 的主要酶。高背膘組大河豬背脂中ACLY 基因表達(dá)上調(diào)，這與GARRIDO 等[20]對伊比利亞豬的研究結(jié)果一致；該基因顯著富集在與脂質(zhì)代謝相關(guān)的三羧酸循環(huán)通路上，表明其可能顯著影響背脂沉積。

ACACA 是催化乙酰CoA 羧化為丙二酰CoA的胞質(zhì)酶，這是FA 從頭合成的第1 步和限速步驟。GONG 等[21]對藏豬和約克夏豬的研究表明：ACACA 基因?qū)χ|(zhì)沉積能力有正向調(diào)節(jié)作用。DU 等[22]通過基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)：ACACA 基因可能對牛的皮下脂肪沉積具有重要影響。SHANG 等[23]分析了藏豬和約克夏豬的FA 及其組成，發(fā)現(xiàn)FASN、ACACA、ME3 和ACLY 基因具有調(diào)節(jié)棕櫚酸和單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acids，MUFA） 水平的功能。本研究結(jié)果顯示：ACACA 基因在高背膘組大河豬背脂中高表達(dá)，且顯著富集在AMPK 信號通路[14]和丙酮酸代謝通路[15]中，進(jìn)一步印證了該基因?qū)Ρ持练e的影響。

FASN 是一種多功能蛋白質(zhì)，可在NADPH作用下催化乙酰CoA 和丙二酰CoA 合成棕櫚酸，并將其轉(zhuǎn)化為飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）。LIU 等[24]發(fā)現(xiàn)：FASN 基因在松遼黑豬和長白豬脂肪組織中特異性表達(dá)。WANG 等[25]對南陽黑豬背最長肌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和蛋白組的研究發(fā)現(xiàn)：FASN 和ACACA 基因為脂肪沉積相關(guān)的候選基因。DENG 等[26]對寧鄉(xiāng)豬、巴克夏豬及其F1 代的研究也發(fā)現(xiàn)：FASN 和ACACA 在FA 的生物合成和代謝中發(fā)揮著重要作用。本研究結(jié)果顯示：FASN 基因在高背膘組大河豬背脂中上調(diào)表達(dá)，且顯著富集在AMPK 信號通路[14]，這也進(jìn)一步證實FASN 基因是影響豬背脂沉積的關(guān)鍵基因。

SCD 是一種催化SFA 轉(zhuǎn)化為MUFA 的關(guān)鍵酶，也與FA 合成有關(guān)。BENíTEZ 等[27]和MU?OZ等[28]對伊比利亞豬的研究發(fā)現(xiàn)：SCD、ACACA、ME1 和FASN 在脂肪含量較高的組織中呈過度表達(dá)。本研究中，SCD 基因在高背膘組大河豬背脂中上調(diào)表達(dá)，且通過調(diào)控PPAR 信號通路[13]和AMPK 信號通路[14]參與背部脂肪的形成，這與前人的研究結(jié)果[27-28]一致。

丙酮酸是聯(lián)系糖代謝與脂類代謝的重要中間化合物，乙酰CoA 和NADPH 是FA 合成過程中的重要原料，而丙酮酸經(jīng)氧化脫羧又可以形成乙酰CoA[16]。PCK1 可使丙酮酸經(jīng)糖異生過程轉(zhuǎn)化為葡萄糖，從而減少丙酮酸含量；ME1 可催化蘋果酸生成丙酮酸和NADPH。丙酮酸通過抑制乙酰CoA 羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）、脂肪酸結(jié)合蛋白4 （fatty acid-binding protein 4，F(xiàn)ABP4）、FASN 和AMPK 的表達(dá)水平，從而阻止脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)沉積[29-31]。邢凱[32]對松遼黑豬和長白豬的背脂轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：ME1 和PCK1 基因UTR 區(qū)上的變異位點顯著影響背膘厚。據(jù)此推測，PCK1 和ME1 基因可能通過間接影響乙酰CoA的水平，進(jìn)而影響背脂沉積。

有研究表明：脂肪型豬的ACACA、FASN、ME1、ACLY 和SCD 基因表達(dá)量均高于瘦肉型豬[33-34]。ACLY 可催化三羧酸循環(huán)產(chǎn)生乙酰CoA，ACACA 和FASN 可催化乙酰CoA 合成SFA 的過程，從而促進(jìn)脂肪沉積。TIAN 等[35]基于蛋白質(zhì)組學(xué)的分析結(jié)果表明：肥胖母豬胎盤中與脂質(zhì)代謝相關(guān)的FASN 和ACACA 基因表達(dá)上調(diào)會減弱WNT 和AMPK 信號通路，進(jìn)而導(dǎo)致豬足月胎盤中的脂質(zhì)顯著積累。此外，SCD 可催化SFA 向MUFA 轉(zhuǎn)化，為膜磷脂、甘油三酯、膽固醇酯等脂類的合成提供重要底物[36]，進(jìn)而影響脂肪沉積。

4 結(jié)論

本研究基于大河豬背部脂肪組織轉(zhuǎn)錄組測序篩選出214 個DEGs，在高背膘組中有107 個基因上調(diào)，107 個基因下調(diào)。 其中，PCK1、 ME1、ACLY、ACACA、FASN 和SCD 是與背脂沉積相關(guān)的關(guān)鍵基因，主要通過PPAR 信號通路、AMPK信號通路、丙酮酸代謝、三羧酸循環(huán)等途徑參與脂肪沉積。

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[36]責(zé)任編輯：何謦成

基金項目：云南省重大科技專項（202102AE090039）；云南省生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（2023KJTX016）；云南省產(chǎn)業(yè)技術(shù)領(lǐng)軍人才專項（YNWR-CYJS-2018-056）。