摘要： 【目的】研究幼齡期、初情期和成年期關(guān)中奶山羊睪丸間質(zhì)細(xì)胞（Leydig cells，LCs） 的形態(tài)、分布特點(diǎn)、超微結(jié)構(gòu)特征及睪酮合成水平，解析不同發(fā)育階段LCs 的形態(tài)特征與睪酮合成水平之間的相關(guān)性?！痉椒ā渴褂霉忡R和改良后的透射電鏡技術(shù)觀察不同月齡奶山羊LCs 的形態(tài)、分布規(guī)律及超微結(jié)構(gòu)特征；采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測睪酮合成關(guān)鍵酶3β-羥基類固醇脫氫酶的表達(dá)和分布；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測血清中促黃體生成素（luteinizing hormone，LH） 和睪酮含量的變化；采用熒光定量PCR 和免疫印跡技術(shù)分析LCs 成熟和睪酮合成關(guān)鍵基因/蛋白表達(dá)的規(guī)律?！窘Y(jié)果】與幼齡期相比，初情期和成年期的LCs 逐漸變大、呈不規(guī)則多邊形，且逐漸向間質(zhì)中央移動(dòng)。初情期和成年期的LCs 胞質(zhì)內(nèi)含有大量脂滴，且脂滴與線粒體、光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器密切接觸。隨著性成熟，血清中的LH 和睪酮含量顯著或極顯著增加，睪丸組織中與睪酮合成相關(guān)的基因表達(dá)水平顯著或極顯著上調(diào)?！窘Y(jié)論】關(guān)中奶山羊LCs 的睪酮合成能力與其發(fā)育成熟過程密切相關(guān)，初情期和成年期的LCs 胞質(zhì)內(nèi)存在大量脂滴且與線粒體直接接觸，這為形態(tài)學(xué)方法研究脂滴參與睪酮的合成提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 奶山羊；形態(tài)學(xué)方法；睪丸間質(zhì)細(xì)胞；睪酮；脂滴

中圖分類號(hào)： S827.941 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)： 1004–390X （2024） 05?0031?09

奶山羊（Capra hircus） 作為重要的經(jīng)濟(jì)草食家畜，具有飼養(yǎng)成本低、占地面積小、適應(yīng)能力強(qiáng)等特點(diǎn)，是中國農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展的支柱產(chǎn)業(yè)之一[1]。種公羊的精液質(zhì)量是影響繁殖率的重要因素，睪酮合成能力的強(qiáng)弱則直接決定精液品質(zhì)[2]。睪酮是睪丸間質(zhì)細(xì)胞（Leydig cells，LCs） 產(chǎn)生的一種類固醇激素，與家畜繁殖活動(dòng)密切相關(guān)。雄性奶山羊繁殖季的血漿睪酮水平顯著高于非繁殖季，且交配行為與睪酮水平顯著相關(guān)[3]。睪酮可促進(jìn)精子發(fā)生，提高精子數(shù)量和活力，改善精液質(zhì)量[4]。

LCs 合成睪酮受下丘腦—垂體—睪丸軸（hypothalamus-pituitary-testis，HPT） 調(diào)控，垂體分泌的促黃體生成素（luteinizing hormone，LH） 與LH受體（LH receptor，LHR） 結(jié)合，促進(jìn)睪酮合成[5]。嚙齒類動(dòng)物中，LCs 發(fā)育分為4 個(gè)不同階段：睪丸間質(zhì)干細(xì)胞（stem Leydig cells，SLCs）、睪丸間質(zhì)祖細(xì)胞（progenitor Leydig cells，PLCs）、未成熟睪丸間質(zhì)細(xì)胞（immature Leydig cells，ILCs） 和成熟睪丸間質(zhì)細(xì)胞（adult Leydig cells，ALCs）[6]。其中，SLCs 和PLCs 不具備睪酮合成能力，ILCs主要產(chǎn)生雄烯二酮，ALCs 則主要合成睪酮[7]。與嚙齒類動(dòng)物不同，初情期前家畜的HPT 軸未被激活，LCs 發(fā)育處于靜息期[8]，此時(shí)LCs 具有低水平的睪酮合成能力[9]；初情期，HPT 軸被激活，釋放LH， ILCs 轉(zhuǎn)變?yōu)锳LCs， 促進(jìn)睪酮的合成[10]。但是，目前鮮有奶山羊不同發(fā)育階段LCs 的形態(tài)變化特征及睪酮合成規(guī)律的研究報(bào)道。

本研究以關(guān)中奶山羊?yàn)樵囼?yàn)對象，采用多種形態(tài)學(xué)技術(shù)分析不同發(fā)育階段奶山羊LCs 的生物學(xué)特性，進(jìn)一步檢測睪酮合成關(guān)鍵酶的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。研究結(jié)果可為揭示奶山羊睪酮合成的分子機(jī)制奠定形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，也可為進(jìn)一步完善哺乳動(dòng)物精子發(fā)生調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

蘇木精— 伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE） 染色試劑盒（索萊寶，G1120）；油紅O 染色試劑盒（Sigma，O0625）；3β-羥基類固醇脫氫酶（hydroxysteroid dehydrogenase，HSD） 兔多克隆抗體（愛博泰克，A1823）；StAR 兔多克隆抗體（Affinit，DF6192）；Cyp11a1 兔多克隆抗體（愛博泰克，A1713）；17β-HSD 兔多克隆抗體（Affinit，DF7790）；GAPDH 兔多克隆抗體（Affinit，AF7021）；山羊LH和山羊睪酮酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA） 試劑盒（上海酶聯(lián)生物）； RIPA 裂解液（Thermo Scientific）； 增強(qiáng)型ECL 化學(xué)發(fā)光液（Millipore）；HRP 標(biāo)記的羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗和二喹啉甲酸（bicinchoninicacid，BCA） 蛋白濃度檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與樣品采集

選取2～3 月齡（幼齡期）、6～8 月齡（初情期）和18～24 月齡（成年期） 的健康雄性關(guān)中奶山羊各5 只用于研究。供試動(dòng)物由西北農(nóng)林科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為：SYXK（陜）2022-03。頸靜脈采集血液樣品后，4 ℃ 靜置30 min，隨后3 000 r/min 離心15 min，收集血清樣品并分裝凍存，用于后續(xù)試驗(yàn)。奶山羊進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室麻醉，手術(shù)切開陰囊壁，摘取兩側(cè)睪丸樣品，迅速放入盛有25～35 ℃ 的滅菌PBS 緩沖液中洗滌2～3 次。取一側(cè)部分樣品用于透射電鏡制樣，剩余樣品液氮凍存。另一側(cè)部分樣品迅速用最佳切割溫度（optimal cutting temperature，OCT） 包埋劑包埋，用于制備冰凍切片，再進(jìn)行油紅O 染色；剩余睪丸組織樣品以4% 多聚甲醛固定液固定，用于制備石蠟切片，再進(jìn)行HE 染色。動(dòng)物試驗(yàn)通過西北農(nóng)林科技大學(xué)生物安全委員會(huì)的審核，許可證號(hào)為：DY2023033。

1.3 睪丸組織的HE 染色

將睪丸樣品切割成小塊組織，以4% 多聚甲醛固定24 h。樣品上行梯度乙醇脫水→二甲苯透明→石蠟包埋→切片機(jī)切取5 μm 切片；組織切片下行梯度乙醇脫蠟→HE 染色→中性樹膠封片。使用光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。

1.4 油紅O 染色

將睪丸組織冰凍切片置于室溫晾干，以冷丙酮固定10 min，PBS 洗滌3 次。油紅O 染色液（V油紅O 原液∶V去離子水=3∶2） 室溫染色15 min，然后用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，再用甘油明膠封片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測

將睪丸組織石蠟切片脫蠟，先用3% H2O2 室溫孵育10 min，然后用檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原熱修復(fù)，再用5% BSA 室溫孵育30 min。3β-HSD一抗（LCs 特異性標(biāo)記Marker） 4 ℃ 孵育過夜，PBS 洗滌5 次；二抗室溫孵育40 min，DAB 顯色5 min，蘇木精復(fù)染，上行梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。使用顯微鏡觀察并拍照。

1.6 奶山羊睪丸組織透射電鏡制樣

脂滴為脂溶性細(xì)胞器，常規(guī)透射電鏡制樣過程中，梯度乙醇脫水環(huán)節(jié)容易造成脂滴形態(tài)結(jié)構(gòu)損壞，導(dǎo)致LCs 超微結(jié)構(gòu)特征改變，因此，本研究對透視電鏡制樣方法進(jìn)行改良，具體操作為：將切成1 mm3 的睪丸組織樣品用強(qiáng)滲透能力的2.5% 戊二醛—4% 多聚甲醛混合緩沖固定液固定1.5～3.0 h，再用經(jīng)過預(yù)冷的2.5% 戊二醛—PBS緩沖液固定過夜；次日用PBS 洗滌5 次，再用1% 鋨酸室溫固定2 h，上行梯度乙醇脫水，丙酮置換，Epon 812 包埋。先半薄切片，甲苯胺藍(lán)染色定位后進(jìn)行超薄切片（50 nm），采用醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，置于透射電子顯微鏡下觀察LCs 的超微結(jié)構(gòu)特征并拍照。

1.7 ELISA 檢測血清中LH 和睪酮的含量

按ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行，每孔加入待測血清樣品50 μL，重復(fù)5 次。使用酶標(biāo)儀檢測波長450 nm 下的吸光度值（OD 值）。

1.8 睪丸組織RNA 提取及熒光定量PCR （qPCR）檢測

采用Trizol 法提取睪丸組織總RNA，使用核酸分析儀（NanoDrop 2000） 檢測RNA 的純度和濃度；隨后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用Absolute qPCRSYBR Green Mix Kit 試劑盒進(jìn)行qPCR 檢測。檢測對象包括：膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因、睪酮合成相關(guān)基因、LCs 成熟關(guān)鍵基因以及內(nèi)參基因（GAPDH），共計(jì)16 個(gè)（表1）。每個(gè)核酸樣品重復(fù)5 次，以2?ΔΔCt 值表示基因相對表達(dá)量。

1.9 蛋白免疫印跡（Western-blot） 檢測

采用RIPA 裂解法提取睪丸組織總蛋白，使用BCA 法檢測蛋白濃度；經(jīng)SDS-PAGE 電泳后，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用5% 脫脂奶粉孵育30 min，漂洗后置于待檢測抗體溶液中，4 ℃ 孵育過夜；用TBST 緩沖液洗滌3 次，加入增強(qiáng)型ECL 發(fā)光液后置于凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行檢測，采用Quantity One 軟件分析。

1.10 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 16.0 和GraphPad Prism 9.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和制圖，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示；數(shù)據(jù)采用Tukey 試驗(yàn)多重比較法分析組間差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)育階段奶山羊LCs 的分布特點(diǎn)

奶山羊LCs 分布于曲細(xì)精管（seminiferous tubules，ST） 之間，呈圓形或橢圓形，胞體較大，胞核位于細(xì)胞中央（圖1）。幼齡期奶山羊睪丸生精上皮主要由精原細(xì)胞和支持細(xì)胞組成，LCs 分布于ST 之間（圖1a 和1d）。初情期和成年期的睪丸生精上皮由各級(jí)生精細(xì)胞和支持細(xì)胞構(gòu)成，LCs成群分布并逐漸向間質(zhì)中央移動(dòng)；初情期可觀察到變態(tài)發(fā)育的精子細(xì)胞（圖1b 和1e），成年期的ST 管腔內(nèi)可見精子（圖1c 和1d）。性成熟后，睪丸生精上皮的長度和ST 直徑極顯著增加（圖1g和1h）。

不同發(fā)育階段LCs 中睪酮合成關(guān)鍵酶3β-HSD 的免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果（圖2） 顯示：幼齡期LCs 中的3β-HSD 呈弱陽性表達(dá)（圖2a 和2d）；初情期和成年期呈強(qiáng)陽性表達(dá)（圖2j），且陽性反應(yīng)主要分布于胞核周圍的胞質(zhì)中（圖2b～c 和2e～f）。油紅O 染色發(fā)現(xiàn)：幼齡期LCs 胞質(zhì)中的脂滴較少（圖2g），而初情期和成年期的脂滴含量極顯著增加（圖2h～i 和2k）。

2.2 不同發(fā)育階段奶山羊LCs 的超微結(jié)構(gòu)特征

透射電鏡觀察結(jié)果如圖3 所示。幼齡期LCs呈卵圓形，胞核大而圓，位于細(xì)胞中央，胞質(zhì)內(nèi)分布線粒體、光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，偶見小脂滴位于細(xì)胞邊緣（圖3a）；高倍鏡下觀察到細(xì)胞核雙層膜結(jié)構(gòu)，線粒體分散在光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間（圖3d）；體積較大，嵴結(jié)構(gòu)明顯減少，嵴與嵴之間空隙較大，線粒體與光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)間分布著大量呈簇狀排列的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)（直徑約10 nm）（圖3g）。初情期和成年期的LCs 變大，呈不規(guī)則多邊形，細(xì)胞核呈橢圓形位于細(xì)胞中央（圖3b～c）；細(xì)胞核中異染色質(zhì)明顯較幼齡期多，胞質(zhì)內(nèi)分布發(fā)達(dá)的光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、小脂滴等與類固醇合成相關(guān)的細(xì)胞器（圖3e～f）；高倍鏡下觀察到線粒體嵴數(shù)量發(fā)達(dá)，且線粒體與脂滴、光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器發(fā)生直接的物理性接觸（圖3h～i）。隨著性成熟，LCs胞質(zhì)內(nèi)與類固醇合成有關(guān)的細(xì)胞器數(shù)量極顯著增加（圖3j～l），細(xì)胞器間的直接接觸為快速合成雄激素睪酮奠定了形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。

2.3 不同發(fā)育階段奶山羊LCs 合成雄激素睪酮的水平

ELISA 檢測結(jié)果（圖4a） 顯示：幼齡期血清中LH 和睪酮的含量處于極低水平，初情期和成年期LH 和睪酮的含量顯著或極顯著升高。qPCR檢測結(jié)果（圖4b） 顯示：膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)鍵基因StAR 和TSPO，LCs 成熟相關(guān)基因NR3C4、Insl3和 17β-HSD-3， 以及睪酮合成關(guān)鍵酶基因 Cyp11a1、Cyp17a1、3β-HSD 和17β-HSD-1 的水平在初情期和成年期均顯著或極顯著高于幼齡期。Westernblot檢測睪酮合成關(guān)鍵酶的蛋白水平，結(jié)果與基因表達(dá)水平一致（圖4c～d）。這些結(jié)果表明：奶山羊LCs 合成雄激素睪酮能力與其成熟過程密切相關(guān)。

3 討論

睪酮屬于LCs 合成分泌的類固醇激素，作為動(dòng)物體內(nèi)重要的性激素，在性器官的發(fā)育成熟、精子發(fā)生、維持雄性第二性征等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[11]。LCs 合成睪酮受HPT 軸精確調(diào)控，其睪酮的合成能力與發(fā)育成熟過程密切相關(guān)[12]。

哺乳動(dòng)物L(fēng)Cs 分為2 種類型：胎兒型LCs 和出生后成熟LCs。在嚙齒類動(dòng)物中，SLCs 分化發(fā)育為ALCs 需要經(jīng)歷PLCs 和ILCs 兩個(gè)過渡階段[13]。在該過程中，HPT 軸協(xié)同血小板衍生生長因子、胰島素生長因子I、腫瘤壞死因子、白介素等細(xì)胞因子調(diào)控LCs 的增殖、分化和成熟[14]，其中以HPT 軸分泌的促性腺激素釋放激素（gonadotrophinreleasing hormone，GnRH）、促性腺激素抑制激素（gonadotrophin inhibiting hormone，GnIH） 和LH起主要調(diào)控作用[15]。對于家畜而言，性成熟前HPT軸未被激活，LCs 長期處于靜息狀態(tài)，此時(shí)的LCs稱為幼齡期LCs[16]；在初情期，隨著HPT 軸被激活并釋放大量的LH，進(jìn)而激活cAMP-PKA 信號(hào)通路，促進(jìn)雄激素睪酮合成[17]，此時(shí)的LCs 稱為成熟期LCs，胞質(zhì)內(nèi)除類固醇合成關(guān)鍵基因表達(dá)水平增強(qiáng)外，與類固醇合成有關(guān)的細(xì)胞器也出現(xiàn)顯著的變化[18]。本研究利用多種形態(tài)學(xué)方法觀察不同發(fā)育階段奶山羊LCs 的結(jié)構(gòu)特征，結(jié)果表明：初情期和成年期的LCs 逐漸變大，呈不規(guī)則多邊形，且LCs 逐漸向間質(zhì)中央移動(dòng)；LCs 胞質(zhì)內(nèi)含有大量脂滴，且脂滴與線粒體、光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器密切接觸，這些與類固醇合成相關(guān)的細(xì)胞器大量出現(xiàn)，為LCs 快速合成雄激素睪酮奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。進(jìn)一步通過ELISA、qPCR 和Western-blot 檢測發(fā)現(xiàn)：成熟期奶山羊LCs 中雄激素睪酮合成關(guān)鍵酶的表達(dá)水平顯著高于幼齡期，且血清中LH 和睪酮的含量也顯著高于幼齡期。ISRAEL等[9]研究表明：LCs 內(nèi)存在一系列高度特異性的甾體酶系，它們按照一定的規(guī)律分布于線粒體、光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，在HPT 軸的調(diào)控下適時(shí)分泌睪酮，維持動(dòng)物機(jī)體發(fā)育和生殖需求。這些研究結(jié)果提示：LCs 合成雄激素的能力與其發(fā)育過程密切相關(guān)。

類固醇激素的合成始于游離膽固醇，而膽固醇可在細(xì)胞內(nèi)以膽固醇酯的形式儲(chǔ)存于細(xì)胞器脂滴中[19]。有學(xué)者在人類、獼猴以及嚙齒類動(dòng)物的腎上腺上皮細(xì)胞脂滴中檢測到大量與類固醇激素合成相關(guān)的酶及線粒體蛋白[20]。脂滴是一種儲(chǔ)存中性酯的多功能細(xì)胞器，普遍存在于各種動(dòng)物的各類細(xì)胞中。在脂肪組織中，脂滴主要以甘油三酯的形式存在，其水解后釋放的游離脂肪酸經(jīng)線粒體β-氧化作用產(chǎn)生ATP，供給細(xì)胞能量[21]；而在類固醇激素合成的細(xì)胞中，脂滴主要以若干體積較小的方式存在，其主要作用是釋放游離膽固醇，用于類固醇激素的合成[22]。

本研究通過油紅O 染色和改良后的透射電鏡方法觀察發(fā)現(xiàn)：幼齡期LCs 內(nèi)脂滴的含量極少；而初情期和成年期LCs 內(nèi)脂滴的含量極顯著增加。值得注意的是，LCs 內(nèi)脂滴與線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器發(fā)生直接物理性接觸，這為高效合成睪酮提供了形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。此外，透射電鏡下還觀察到類固醇合成的細(xì)胞器周圍分布大量的細(xì)胞骨架，其可能參與睪酮的合成。還有研究表明：特異性的敲除Vimentin 可顯著抑制小鼠類固醇激素的合成[23-24]。綜上所述，哺乳動(dòng)物L(fēng)Cs 合成睪酮的能力與胞內(nèi)膽固醇的來源密切相關(guān)。

4 結(jié)論

奶山羊睪酮的合成與LCs 的成熟過程密切相關(guān)，LCs 中的脂滴具有參與睪酮合成的形態(tài)學(xué)依據(jù)。研究結(jié)果為揭示奶山羊睪酮合成的分子機(jī)制奠定了形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步完善哺乳動(dòng)物精子發(fā)生調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了參考。

[ 參考文獻(xiàn) ]

[1]趙啟南， 金海， 孟子琪， 等. 關(guān)于我國奶山羊產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的思考[J]. 中國畜牧雜志， 2021， 57（6）： 261. DOI：10.19556/j.0258-7033.20210309-09.

[2]SHIRAISHI K， OKA S， MATSUYAMA H. Testiculartestosterone and estradiol concentrations and aromataseexpression in men with nonobstructive azoospermia[J].The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism，2021， 106（4）： e1803. DOI： 10.1210/clinem/dgaa860.

[3]徐暢， 張姹， 譚成全， 等. α-酮戊二酸/酮戊二酸受體1系統(tǒng)對雄性動(dòng)物睪酮分泌和精子生成的影響[J]. 動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)， 2022， 34（5）： 3286. DOI： 10.3969/j.issn.1006-267x.2022.05.054.

[4]SMITH L B， WILLIAM H W. The regulation of spermatogenesisby androgens[J]. Seminars in Cell and DevelopmentalBiology， 2014， 30： 2. DOI： 10.1016/j.semcdb.2014.02.012.

[5]侯曉鴻， 郝衛(wèi)東. 丘腦—垂體—性腺軸調(diào)節(jié)睪酮合成的研究進(jìn)展[J]. 癌變·畸變·突變， 2018， 30（6）： 483. DOI：10.3969/j.issn.1004-616x.2018.06.013.

[6]CHEN H L， GE R S， ZIRKIN B R. Leydig cells： fromstem cells to aging[J]. Molecular and Cellular Endocrinology，2009， 306（1/2）： 9. DOI： 10.1016/j.mce.2009.01.023.

[7]LI X H， ZHU Q Q， WEN Z N， et al. Androgen andluteinizing hormone stimulate the function of rat immatureLeydig cells through different transcription signals[J].Frontiers in Endocrinology， 2021， 12： 599149. DOI： 10.3389/fendo.2021.599149.

[8]SVECHNIKOV K， IZZO G， LANDREH L， et al. Endocrinedisruptors and Leydig cell function[J]. Journal of Biomedicineand Biotechnology， 2010， 2010（5）： 684504.DOI： 10.1155/2010/684504.

[9]ISRAEL J， CABELGUEN J， MASSON G L， et al. Neonataltestosterone suppresses a neuroendocrine pulse generatorrequired for reproduction[J]. Nature Communications，2014， 5（1）： 3285. DOI： 10.1038/ncomms4285.

[10]VERHAGEN I， RAMASWAMY S， TEERDS K J， et al.Time course and role of luteinizing hormone and folliclestimulatinghormone in the expansion of the Leydig cellpopulation at the time of puberty in the rhesus monkey（Macaca mulatta）[J]. Andrology， 2014， 2（6）： 924. DOI：10.1111/andr.275.

[11]ZITZMANN M. Testosterone， mood， behaviour and qualityof life[J]. Andrology， 2020， 8（6）： 1598. DOI： 10.1111/andr.12867.

[12]GROSSMANN M， WITTERT G A. Dysregulation of thehypothalamic-pituitary-testicular axis due to energy deficit[J]. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism，2021， 106（12）： e4861. DOI： 10.1210/clinem/dgab517.

[13]BHATTACHARYA I， DEY S. Emerging concepts onLeydig cell development in fetal and adult testis[J]. Frontiersin Endocrinology， 2023， 13： 1086276. DOI： 10.3389/fendo.2022.1086276.

[14]CHEN H L， WANG Y Y， GE R S， et al. Leydig cell stemcells： identification， proliferation and differentiation[J].Molecular and Cellular Endocrinology， 2017， 445（16）：65. DOI： 10.1016/j.mce.2016.10.010.

[15]湯亞茹， 陽美霞， 賈金美， 等. GnIH過表達(dá)載體構(gòu)建及其對小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的作用研究[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2021， 52（10）： 2969. DOI： 10.11843/j.issn.0366-6964.2021.010.028.

[16]HAIDER S G. Cell biology of Leydig cells in the testis[J]. International Review of Cytology， 2004， 233： 181.DOI： 10.1016/S0074-7696（04）33005-6.

[17]HO H J， SHIRAKAWA H， YOSHIDA R， et al. Geranylgeraniolenhances testosterone production via the cAMP/protein kinase A pathway in testis-derived I-10 tumorcells[J]. Bioscience， Biotechnology， and Biochemistry，2016， 80（4）： 791. DOI： 10.1080/09168451.2015.1123612.

[18]SVECHNIKOV K， LANDREH L， WEISSER J， et al.Origin， development and regulation of human Leydigcells[J]. Hormone Research in Paediatrics， 2010， 73（2）：93. DOI： 10.1159/000277141.

[19]SHEN W J， AZHAR S， KRAEMER F B. Lipid dropletsand steroidogenic cells[J]. Experimental Cell Research，2016， 340（2）： 209. DOI： 10.1016/j.yexcr.2015.11.024.

[20]YU J H， ZHANG L Q， LI Y H， et al. The adrenal lipiddroplet is a new site for steroid hormone metabolism[J].Proteomics， 2018， 18（23）： e1800136. DOI： 10.1002/pmic.201800136.

[21]ZHOU L K， YU M， ARSHAD M， et al. Coordinationamong lipid droplets， peroxisomes， and mitochondria regulatesenergy expenditure through the CIDE-ATGL-PPARαpathway in adipocytes[J]. Diabetes， 2018， 67（10）：1935. DOI： 10.2337/db17-1452.

[22]KRAEMER F B， KHOR V K， SHEN W J， et al. Cholesterolester droplets and steroidogenesis[J]. Molecular andCellular Endocrinology， 2013， 371（1/2）： 15. DOI： 10.1016/j.mce.2012.10.012.

[23]楊書紅， 唐維成， 王世宣. 細(xì)胞骨架調(diào)控卵巢激素合成機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 中國婦幼保健， 2019， 34（16）： 3869.DOI： 10.7620/zgfybj.j.issn.1001-4411.2019.16.72.

[24]SHEN W J， ZAIDI S K， PATEL S， et al. Ablation of vimentinresults in defective steroidogenesis[J]. Endocrinology，2012， 153（7）： 3249. DOI： 10.1210/en.2012-1048.

責(zé)任編輯：何謦成

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32372969，32002242）。