關(guān)鍵詞 激光解吸；后電離；單光子電離；雙光子電離；軟電離

質(zhì)譜技術(shù)作為一種快速且高靈敏的分析技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)藥和材料等領(lǐng)域[1]。離子源是質(zhì)譜儀的核心部分，可分為硬電離源和軟電離源。硬電離源會施加較大的能量使樣品電離出眾多碎片離子，而軟電離源能以溫和的方式使樣品電離，得到完整的分子離子，并減少碎片離子。與激光解吸/電離質(zhì)譜（Laser desorption/ionization mass spectrometry， LDI-MS）[2]相比，激光解吸-激光后電離質(zhì)譜（Laser desorptionlaser post-ionization mass spectrometry， LDPI-MS）是一種離子化效率高的軟電離技術(shù)。

LDPI-MS 的技術(shù)核心是在離子源部分引入兩束激光，將解吸和電離的過程在時(shí)空上進(jìn)行分離。激光解吸產(chǎn)生的離子與中性物質(zhì)比約為10–5～10–3，電離效率低，使用LDPI-MS 則可充分利用未電離的中性物質(zhì)，理論上可將電離效率提升至接近100%[3]。此外，由于離子化過程發(fā)生在氣相中，采用光電離技術(shù)（Photoionization， PI）降低了基質(zhì)效應(yīng)和離子抑制效應(yīng)[4-5]。

光電離技術(shù)的電離效率主要取決于電離過程中吸收光子的數(shù)量，根據(jù)吸收光子的數(shù)量不同， PI 可分為單光子電離（Single photon ionization， SPI）和多光子電離（Multiphoton ionization， MPI）。對于MPI，吸收光子的總能量與待測物電離能之間的關(guān)系決定了電離過程中產(chǎn)生碎片離子的程度。1978 年， Antonov 等[6]首次提出將共振增強(qiáng)多光子電離（Resonance enhanced multiphoton ionization， REMPI）源與磁質(zhì)譜相結(jié)合用于苯甲醛等多環(huán)芳烴（Polyaromatic hydrocarbon， PAH）的高靈敏檢測。REMPI 通常具有高選擇性，當(dāng)激光波長與待測分子的共振能級相匹配時(shí)，待測分子更易被電離。用于REMPI 的激光波長通常為近紫外波段（如266、248 和193 nm 等），具有較高的單光子能量（如4.67、5.01 和6.44 eV 等）。如待測物吸收2 個(gè)光子即被電離，則該過程稱為共振增強(qiáng)雙光子電離（1+1 REMPI），如圖1A 所示，REMPI 過程產(chǎn)生的碎片化程度與激光波長和能量密切相關(guān)。若中性物質(zhì)吸收光子后無法達(dá)到穩(wěn)定的中間過渡態(tài)，仍繼續(xù)吸收光子被電離，則該過程稱為非共振增強(qiáng)多光子電離（Non-resonant multiphoton ionization， NRMPI），如圖1B所示。由于中間共振態(tài)的缺失， NRMPI 通常需要較高功率的激光能量才能達(dá)到與REMPI 接近的電離效率和探測靈敏度[7-8]，該過程伴隨著大量碎片離子的產(chǎn)生。

近年來，單光子能量為7.5～11.8 eV、波長在105～165 nm 范圍內(nèi)的真空紫外光（Vacuum ultraviolet，VUV）被廣泛用作電離源[9]。已有研究組將118 nm 的真空紫外光用作質(zhì)譜儀器的后電離源。其中，Hanley 研究組[10-12]使用118 nm 波長激光的后電離源，以亞單層的靈敏度對多種有機(jī)化合物進(jìn)行表面分析，并以微米級的空間分辨率對自制的純樣點(diǎn)陣和共培養(yǎng)生物膜進(jìn)行了質(zhì)譜成像。Bernstein 研究組[13]使用118 nm 激光作為電離激光，結(jié)合密度泛函等計(jì)算方法，對多種分子團(tuán)簇之間的反應(yīng)過程和機(jī)理進(jìn)行了研究。Zimmermann 研究組[14]使用118 nm 的后電離源對存在于環(huán)境氣溶膠中的多種有機(jī)物進(jìn)行了質(zhì)譜分析。Hu 研究組[15-16]也使用118 nm 的后電離激光實(shí)現(xiàn)了小鼠組織中吖啶黃、葉酸等藥物的定量分析及質(zhì)譜成像。由于大多數(shù)有機(jī)分子的電離能都小于10 eV[17]，而真空紫外光具有極高的單光子能量，因此物質(zhì)只需要吸收1 個(gè)光子即可實(shí)現(xiàn)離子化，從而發(fā)生SPI 過程，其原理如圖1C 所示。與MPI 過程相比，SPI 無需經(jīng)過REMPI 的中間共振激發(fā)態(tài)，也無需NRMPI 的高功率密度的激光能量，因此能以溫和的方式將大多數(shù)待測物質(zhì)電離，產(chǎn)生較少的碎片，更利于譜圖的分析。

在LDPI-MS 中，不同波長和能量的激光后電離的碎片斷裂方式有所不同，這將導(dǎo)致產(chǎn)生不同的特征性結(jié)構(gòu)碎片[18]。本研究選取3 類在醫(yī)藥領(lǐng)域均具有重要作用的化合物（吖啶類、吩噻嗪類和金屬卟啉類）[19-22]進(jìn)行分析，探究不同的后電離機(jī)理對物質(zhì)碎裂方式的影響。利用實(shí)驗(yàn)室自行搭建的激光解吸-激光后電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Laser desorption laser post-ionization time-of-flight mass spectrometry， LDPITOFMS），采用515 nm 的飛秒激光作為解吸源，分別使用波長為266和118 nm 的后電離激光對這3 類化合物進(jìn)行分析。通過對比266 和118 nm 激光后電離源的質(zhì)譜圖，驗(yàn)證了SPI 技術(shù)在物質(zhì)檢測方面的獨(dú)特優(yōu)勢，為表面分析和復(fù)雜樣品分析提供了一種可靠、有效的手段。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

吖啶橙（Acridine orange，分析純，上海麥克林生化科技股份有限公司）；吖啶黃素（Acriflavine，分析純，廈門森柯思科技有限公司）；原黃素（Proflavine，純度≥98%，上海玻爾化學(xué)試劑有限公司）；亞甲基藍(lán)（Methylene blue，純度≥98%，廈門輝耀興業(yè)科技有限公司）；甲苯胺藍(lán)O（Toluidine bule O，純度≥98%，上海麥克林生化科技股份有限公司）；卟啉鈷（Cobalt tetra-methoxyphenyl porphyrin， CoTMPP，純度為96%，北京百靈威科技有限公司）；四苯基卟啉鋅（Zinc meso-tetraphenyl porphyrin， ZnTPP，純度為96%， AlfaAesar 公司）。分析物的具體信息見表1。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

本研究在自行搭建的LDPI-TOFMS 上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其儀器結(jié)構(gòu)圖和離子源示意圖如圖2 所示。解吸激光器是一臺波長為1030 nm、脈寬為500 fs 的飛秒激光器（S-Pulse-HP，法國Amplitude Laser 公司）。出射的激光通過偏硼酸鋇晶體（β-BaB₂O₄，BBO，武漢中科宇晶光電科技有限公司）產(chǎn)生515 nm 的激光，濾除基頻光后，通過聚焦透鏡透過石英窗口聚焦于樣品表面，其入射角為45°，聚焦光斑直徑約200～300 μm。樣品由雙面石墨膠粘在自制的樣品臺上，樣品臺的移動(dòng)由一個(gè)二維的壓電陶瓷位移平臺（SMARTACT1720S，德國SmartAct GmbH 公司）與一個(gè)電動(dòng)升降臺（KHE06008，日本SURUGASEIKI 公司）控制。

后電離激光分別為266 nm的納秒激光和118 nm的納秒激光。其中， 266 nm波長的激光是由Nd： YAG納秒激光器（Minilite Ⅱ，美國Continuum 公司）產(chǎn)生，激光脈寬為5～7 ns， 頻率為10 Hz。該激光器輸出的266 nm 激光由一個(gè)平凸透鏡（f=100 mm）聚焦，使用的能量約為25 μJ，若繼續(xù)增加能量會導(dǎo)致離子的初始動(dòng)能分散增加，從而影響譜圖分辨率。118 nm 的激光是由另一臺納秒激光器（SGR500，北京鐳寶光電技術(shù)有限公司）輸出的355 nm 激光三倍頻產(chǎn)生的，激光脈寬為7～10 ns，頻率為10 Hz。355 nm 激光經(jīng)平凸透鏡（f=300 mm）在自制的氣體池中聚焦，氣體池中氣體氛圍為200 Torr（1 Torr=0.133 kPa）的Xe/Ar 混合氣體（1∶10）。在氣體池的出口與質(zhì)譜腔體之間，通過MgF₂ 透鏡（f=82.5 mm）法蘭進(jìn)行真空隔離。當(dāng)產(chǎn)生的118 nm 激光穿過MgF2 透鏡時(shí)，MgF₂ 透鏡的折射率為1.67，光束通過時(shí)會匯聚，在樣品表面上方1～2 mm 處聚焦。當(dāng)355 nm 激光穿過MgF₂ 透鏡時(shí)，MgF₂ 透鏡的折射率為1.39，導(dǎo)致該光束在樣品表面發(fā)散。根據(jù)355 nm 激光轉(zhuǎn)化為118 nm 激光的近似能量轉(zhuǎn)化效率（10^–6～10^–5），118 nm 激光的能量為10～100 nJ[23-24]。經(jīng)第二束激光電離后產(chǎn)生的離子隨后進(jìn)入加速區(qū)、Einzel 透鏡和無場飛行區(qū)，最后撞擊到探測器上，該探測器是由兩片微通道板（Microchannel plate， MCP，北方夜視科技研究院有限公司）與銅陽極組成。兩束激光之間的延遲時(shí)間由多通道脈沖發(fā)生器（TDG-7， Shandong Xunmiao Technology Co. Ltd.，Dezhou， China）控制，實(shí)驗(yàn)中設(shè)置約為100 ns。使用一臺帶寬200 MHz、采樣率2 Gs/s 的高速數(shù)字示波器（WaveSurfer 42Xs，美國Lecroy 公司）采集質(zhì)譜信號，每次實(shí)驗(yàn)采集100張質(zhì)譜圖后，由MATLAB 2022b和Origin 9.0軟件處理并得到總質(zhì)譜圖。

1.3 樣品制備

上述所有樣品均采用溶液配制，并制備成殘?jiān)∧び糜诤罄m(xù)分析。其中，吖啶橙、吖啶黃素、原黃素、亞甲基藍(lán)和甲苯胺藍(lán)O 等有機(jī)物使用乙醇-水（1∶1，V/V）的混合溶劑；金屬有機(jī)物難溶于一般的極性溶劑，因此卟啉鈷和四苯基卟啉鋅使用氯仿作為溶劑，分別配制成1×10^–2 mol/L 的儲備母液，然后再將各母液稀釋成1×10^–3 mol/L 的溶液，備用。移取2 μL 稀釋溶液滴于8 mm×8 mm 的潔凈硅片上，液滴置于室溫下自然干燥，待其完全揮發(fā)后形成殘?jiān)鼧悠?，即可通過換樣桿送入真空腔體內(nèi)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 266/118 nm LDPI-TOFMS用于吖啶類化合物的分析

吖啶類化合物是一類含氮的有機(jī)雜環(huán)化合物，具有較好的抗炎、抗菌以及抗腫瘤生物活性[25]。為了證明獲得的待測物信號來源于后電離，首先對原黃素的殘?jiān)鼧悠愤M(jìn)行LDPI 條件下的激光解吸實(shí)驗(yàn)（Laser desorption， LD）：開啟515 nm 的飛秒解吸激光，其單脈沖能量范圍為20～30 μJ， 通過調(diào)節(jié)解吸激光能量至恰好沒有明顯的分子離子峰信號，其譜線如圖3中曲線a 所示；開啟266/118 nm 的后電離激光，并對其能量進(jìn)行優(yōu)化，獲得較強(qiáng)的分子離子峰的信號。由圖3中曲線b 和c 可見，在不同波長的后電離激光作用下，原黃素均產(chǎn)生了較強(qiáng)的分子離子峰的信號（m/z=209，[M]⁺）。

將另外兩種吖啶類化合物（吖啶橙和吖啶黃素）的殘?jiān)鼧悠吠ㄟ^換樣桿送入真空腔體內(nèi)進(jìn)行分析，獲得的質(zhì)譜圖見圖4。如圖4A 和4B所示，吖啶橙在不同波長的后電離激光下都產(chǎn)生了較明顯的分子離子峰（m/z=265， [M]+），但在266 nm 波長激光的后電離下，會伴隨著碎片峰（m/z=250，[M-CH₃]⁺）的產(chǎn)生。如圖4C 和圖4D 所示，吖啶黃素也存在比較明顯的分子離子峰，同時(shí)伴隨著明顯的特征碎片峰（m/z=209，[M-Cl-CH₃]⁺；m/z=193，[M-Cl-CH₃-NH₂]⁺），但266 nm 波長激光作為后電離激光時(shí)，產(chǎn)生的碎片峰更多、強(qiáng)度更大，并且在m/z=177 處增加了碎片峰[M-Cl-CH₃-2NH₂]+。由上述結(jié)果可知，吖啶類化合物在118和266 nm 激光的后電離作用下均可產(chǎn)生明顯的分子離子峰或特征碎片峰，但118 nm 激光作為后電離激光時(shí)的譜圖更干凈，碎片峰更少。吖啶類化合物的電離能約為7.8～8.1 eV[26]；266 nm 激光的單光子能量為4.67 eV，其雙光子能量（9.34 eV）大于吖啶類化合物的電離能，故符合雙光子電離機(jī)制。另外，由于吖啶橙和吖啶黃素都屬于蒽的類似物，在紫外波段（200～300 nm）有較強(qiáng)的吸收[27-28]，因此使用266 nm 波長的激光可進(jìn)行1+1 REMPI，此時(shí)具有較高的電離效率。118 nm 波長激光的單光子能量為10.5 eV， 大于吖啶類化合物的電離能，物質(zhì)吸收一個(gè)光子即可電離，故符合SPI 機(jī)制，可實(shí)現(xiàn)高效的軟電離。

2.2 266/118 nm LDPI-TOFMS 用于吩噻嗪類化合物的分析

吩噻嗪類化合物是一種可用于治療焦慮等疾病的抗精神病藥物，具有抗菌、抗腫瘤和抗病毒等功能[29]。亞甲基藍(lán)和甲苯胺藍(lán)O都屬于吩噻嗪類化合物。圖5A 和5C 展示了118 nm 波長的后電離激光對物質(zhì)作用的譜圖，圖5B 和5D 為266 nm 波長的后電離激光作用于亞甲基藍(lán)和甲苯胺藍(lán)O的殘?jiān)鼧悠窌r(shí)的質(zhì)譜圖。在118 nm 后電離波長下，可以明顯看到亞甲基藍(lán)的母離子峰（m/z=285，[M-Cl]⁺）和甲苯胺藍(lán)O的母離子峰（m/z=271，[M-Cl]⁺），并伴隨著少量母離子與鈉、鉀離子形成的加和峰。由圖5B可見，在266 nm 的后電離激光波長下，亞甲基藍(lán)在m/z=285 處的主分子離子峰強(qiáng)度明顯低于m/z=269 處的碎片峰[M-Cl-CH₃]⁺，并且在m/z=254 和m/z=239 處出現(xiàn)了碎片峰[M-Cl-2CH₃]⁺和[M-Cl-3CH₃]⁺。如圖5D所示，甲苯胺藍(lán)O的主分子離子峰[M-Cl]⁺強(qiáng)度低于在m/z=256 處的碎片峰[M-Cl-CH₃]⁺，并且存在較多的碎片峰。由于硫元素的存在，吩噻嗪類化合物的電離能比吖啶類化合物的電離能通常高一些，約為7.8～8.4 eV[30-31]。266 nm 的雙光子能量大于吩噻嗪類的電離能，因而可發(fā)生雙光子電離過程。另外，由于亞甲基藍(lán)和甲苯胺藍(lán)O在250～300 nm 的波段也有較強(qiáng)的吸收，故可發(fā)生1+1 REMPI[32]。118 nm 的單光子能量大于吩噻嗪類化合物的電離能，故可發(fā)生SPI。從整體來看，對于吩噻嗪類化合物，與產(chǎn)生較多碎片的REMPI 電離過程相比，118 nm 激光下的SPI 可保護(hù)物質(zhì)的分子離子峰不被破壞，并且導(dǎo)致物質(zhì)碎片化的程度更?。辉?66 nm 激光波長下，物質(zhì)吸收的能量會導(dǎo)致碎片離子進(jìn)一步碎裂，其碎裂機(jī)制遵循“Ladder-Switching”模型[33]。

2.3 266/118 nm LDPI-TOFMS 用于金屬卟啉類化合物的分析

卟啉是一種天然的大分子雜環(huán)化合物，具有剛性大共軛結(jié)構(gòu)體系，在電化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)和光學(xué)等領(lǐng)域都發(fā)揮了重要作用[34]。圖6 展示了卟啉鈷（CoTMPP）和四苯基卟啉鋅（ZnTPP）的殘?jiān)鼧悠吩诓煌ㄩL的后電離作用下的質(zhì)譜圖。由圖6B 和6D可見，在266 nm 波長激光后電離的質(zhì)譜圖中都觀察到了分子離子峰（m/z=791， [M]⁺；m/z=678， [M]⁺），還有低質(zhì)量區(qū)的碎片離子峰，但其離子碎片化嚴(yán)重且復(fù)雜，很難將碎片峰進(jìn)行區(qū)分。然而，如圖6A 和6C 所示，當(dāng)118nm 激光作為后電離源時(shí)，都出現(xiàn)了明顯的分子離子峰的信號，并且在低質(zhì)量區(qū)無碎片產(chǎn)生，譜圖較干凈。顯然，不同物質(zhì)在不同波長的后電離激光作用下的碎裂機(jī)制不同，可能是因?yàn)樵跉庀嘀蠧oTMPP 和ZnTPP 在不同的后電離波長下具有不同的光解離行為（A 類機(jī)制和B 類機(jī)制）[35]。其中，A 類機(jī)制為分子吸收光子首先丟失苯基的解離過程，而B 類機(jī)制為分子吸收光子從而導(dǎo)致配位金屬原子首先從大環(huán)中裂解的解離過程。金屬卟啉類有機(jī)物的電離能較高，約為6.0～9.0 eV[36]，在118 nm 波長激光的作用下，物質(zhì)吸收一個(gè)光子即可電離，為SPI 過程。CoTMPP 和ZnTPP 在該軟電離條件下，產(chǎn)生完整的分子離子，但隨著激光功率密度的增加，分子離子繼續(xù)吸收光子會丟失1 個(gè)或2 個(gè)苯基，此時(shí)符合金屬卟啉類的A 類機(jī)制；在266 nm 波長激光的作用下，分子吸收2個(gè)光子進(jìn)行電離，為NRMPI 過程。此時(shí)， B 類機(jī)制逐漸增強(qiáng)，導(dǎo)致配位金屬原子從大環(huán)中裂解，繼而導(dǎo)致整個(gè)大共軛結(jié)構(gòu)碎裂，在低質(zhì)量區(qū)產(chǎn)生眾多復(fù)雜且難以解釋的碎片離子峰。

3 結(jié)論

本研究采用515nm 波長的飛秒激光作為解吸源，單光子能量高的118 nm 波長的納秒激光作為后電離源，成功對具有不同電離能的3類有機(jī)物進(jìn)行了質(zhì)譜分析，結(jié)果表明，118 nm 的單光子后電離技術(shù)普適性強(qiáng)，可用于多種分析領(lǐng)域。另外，采用266 nm 波長激光的多光子后電離源作為對比，結(jié)果表明，單光子后電離技術(shù)獲得的譜圖碎片少，特征離子峰明顯，譜圖易解析，說明此技術(shù)是一種“軟電離”分析技術(shù)，可用于復(fù)雜混合樣品的定性分析，結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜等技術(shù)有望為復(fù)雜有機(jī)物的結(jié)構(gòu)鑒定提供依據(jù)。通過引入具有高電離效率的118 nm 波長的單光子后電離技術(shù)，為表面分析和痕量分析提供了一種高靈敏度和高特異性的分析方法。本方法無需復(fù)雜的樣品制備過程且操作簡單，在材料科學(xué)、生物醫(yī)藥和環(huán)境檢測等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。