關(guān)鍵詞 微塑料；聚苯乙烯微球；半導(dǎo)體聚合物；余輝成像

微塑料是塑料碎片經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期紫外線暴露及物理磨損后形成的直徑小于5 mm 的塑料纖維、顆粒或碎片[1]，主要成分包括聚乙烯（PE）、聚丙烯（PP）、聚氯乙烯（PVC）、聚苯乙烯（PS）和聚對(duì)苯二甲酸類（PET）等，其造成的污染已與全球氣候變化、臭氧消耗和海洋酸化并列成為全球四大環(huán)境問(wèn)題之一[2-4]。研究表明，微塑料已經(jīng)通過(guò)大氣和生態(tài)循環(huán)進(jìn)入到食物鏈中，對(duì)食品造成污染，在海產(chǎn)品、瓶裝水、食用鹽以及果蔬類食品中均有檢出[5-7]。此外，在人類胎盤(pán)、大腦、心臟和糞便中也檢出了微塑料[8-9]。機(jī)體攝入微塑料后會(huì)對(duì)機(jī)體造成炎癥感染、代謝紊亂和氧化應(yīng)激等不利影響[10-11]。然而，微塑料對(duì)于人類健康的潛在影響仍不清楚，微塑料在生物體內(nèi)的分布、生存、形態(tài)及其發(fā)育的影響仍未得到充分評(píng)估。因此，構(gòu)建可以成像示蹤微塑料的探針對(duì)人體內(nèi)微塑料的可視化監(jiān)測(cè)具有重要意義。

目前報(bào)道的微塑料成像手段主要有PET/CT 成像[12]和熒光成像。微塑料在活體內(nèi)的成像示蹤多采用標(biāo)記法。Im 等[12]通過(guò)在微塑料氨基聚苯乙烯上修飾放射性金屬元素⁶⁴Cu，采用PET/CT 技術(shù)對(duì)活體內(nèi)的微塑料進(jìn)行成像示蹤；Delaney 等[13]在不同尺寸的微塑料聚苯乙烯上修飾放射性⁸⁹Zr，通過(guò)PET/CT 技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)活體內(nèi)微塑料的示蹤。但是， PET/CT 成像技術(shù)存在放射性污染，并且儀器復(fù)雜且昂貴。微塑料熒光成像中最常用的熒光探針是尼羅紅染料。Cole[14]將尼龍、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯和聚丙烯纖維嵌入水溶性冷凍劑后，使用低溫切片機(jī)進(jìn)行切片，得到特定長(zhǎng)度的微塑料纖維，采用尼羅紅進(jìn)行熒光標(biāo)記，應(yīng)用于活體成像。Ma 等[15]利用尼羅紅對(duì)纖維切片機(jī)和刀片切割的不同長(zhǎng)度的紡絲材料微米纖維進(jìn)行熒光標(biāo)記，并將其應(yīng)用于水生生物活體內(nèi)成像，為體內(nèi)過(guò)程觀察和毒理學(xué)評(píng)估提供了高效方便的示蹤劑。此外，一些熒光納米材料也被應(yīng)用于微塑料成像示蹤。例如， Xu 等[16]將聚L-乳酸（PLLA）和疏水性聚乳酸共混后摻入量子點(diǎn)（CuInS₂@ZnS QDs）制備聚乳酸薄膜用于斑馬魚(yú)體內(nèi)微塑料的熒光成像示蹤。

熒光成像的優(yōu)勢(shì)是無(wú)輻射污染、靈敏度高、儀器設(shè)備簡(jiǎn)單且價(jià)格低，已被廣泛用于生物成像[17]。但是，目前熒光成像所使用的熒光探針多存在局限性，例如，小分子熒光染料不穩(wěn)定，易發(fā)生光漂白；熒光探針需持續(xù)激發(fā)光照射，從而造成自發(fā)熒光背景以及生物組織損傷等問(wèn)題。長(zhǎng)余輝材料是在光激發(fā)停止后仍能持續(xù)發(fā)光的物質(zhì)，其發(fā)光壽命長(zhǎng)，允許激發(fā)和成像兩種操作分離，能夠消除傳統(tǒng)熒光成像技術(shù)中因持續(xù)激發(fā)光引起的自發(fā)熒光背景和組織損傷，得到高信噪比的余輝信號(hào)。因此，長(zhǎng)余輝材料在生物傳感和成像領(lǐng)域備受關(guān)注[18-22]。相比于摻雜金屬離子的無(wú)機(jī)長(zhǎng)余輝納米材料，半導(dǎo)體聚合物余輝納米材料不摻雜任何金屬離子，并且具有生物可降解性，對(duì)組織不會(huì)造成毒副作用，因此更有利于在活體內(nèi)應(yīng)用。Miao 等[ 23]利用納米沉淀法將半導(dǎo)體聚合物分子聚[2-甲氧基-5-（2-乙基己基氧基）-1，4-亞苯基]（MEHPPV）與產(chǎn)單線態(tài)氧的光敏劑2，3-萘菁硅二（三己基硅氧烷）（NCBS）經(jīng)兩親性共聚物聚合得到近紅外余輝納米粒子，用于小鼠活體淋巴結(jié)和腫瘤成像，其余輝成像信噪比是傳統(tǒng)熒光成像的127 倍。Xu 等[24]采用聚[（9，9-二辛基-2，7-二亞乙烯）-交替-共-{2-甲氧基-5-（2-乙基己氧基）-1，4-亞苯基}]（PF-MEHPPV）代替MEHPPV 作為余輝底物，摻雜的具有AIE 效應(yīng)的光敏劑與余輝基底PF-MEHPPV 之間發(fā)生有效能量轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步引發(fā)“自激發(fā)余輝效應(yīng)”，增強(qiáng)了余輝強(qiáng)度并延長(zhǎng)了余輝持續(xù)時(shí)間。該方法被應(yīng)用于活體腫瘤余輝成像。然而，目前尚未見(jiàn)將余輝發(fā)光信號(hào)標(biāo)記在微塑料上并應(yīng)用于活體內(nèi)可視化監(jiān)測(cè)的報(bào)道。

本研究以苯乙烯為反應(yīng)單體、聚乙烯吡咯烷酮為表面活性劑、過(guò)硫酸鈉為引發(fā)劑，摻入半導(dǎo)體聚合物分子PF-MEHPPV 和光敏劑NCBS，通過(guò)聚合反應(yīng)制備得到具有余輝發(fā)光信號(hào)的聚苯乙烯復(fù)合微球（PNPS）（圖1A）。PF-MEHPPV 充當(dāng)余輝基底， NCBS 既可產(chǎn)單線態(tài)氧氧化余輝基底，也是能量受體，接受氧化態(tài)的不穩(wěn)定中間體釋放出的光子，使材料的余輝發(fā)光轉(zhuǎn)移至近紅外區(qū)域，起到提高組織穿透深度的作用。將PNPS 應(yīng)用于小鼠活體內(nèi)余輝成像（圖1B），實(shí)現(xiàn)了對(duì)聚苯乙烯微球的成像示蹤。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

日立SU8100（Regulus 8100）型掃描電子顯微鏡（日本株式會(huì)社）；UV-3600PLUS 紫外-可見(jiàn)-近紅外分光光度計(jì)（日本島津公司）；ZEN 3700 納米激光粒度儀（英國(guó)馬爾文儀器公司）；F-7000 熒光分光光度計(jì)（日本日立公司）；BSA124S 電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；KQ3200DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Centrifuge 5810 R 高速離心機(jī)（德國(guó)艾本德公司）；DZK-K50B 真空干燥箱（合肥達(dá)斯卡特生物科技有限公司）；IVIS Lumina XRMS Series III 小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)（美國(guó)鉑金埃爾默公司）。

苯乙烯（St，gt;99.0%， TCI（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司）；聚乙烯吡咯烷酮（PVP， MW=10000，上海源葉生物科技有限公司）；聚（乙二醇）-block-聚（丙二醇）-block-聚（乙二醇）（PEG-b-PPG-b-PEG， Mn～12600，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；碘化鉀（KI， 99.5%，上海麥克林生化科技股份有限公司）；2，3-萘菁硅二（三己基硅氧烷）（NCBS， 97%，加拿大TRC 公司）；聚[（9，9-二（2-乙基己基）-9H-氟-烯-2，7-亞乙烯）-共-（1-甲氧基-4-（2-乙基己氧基）-2，5-亞苯基-亞乙烯基）]（PF-MEHPPV，上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司）；四氫呋喃（THF）、乙醇和Na2S2O8（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。堿性氧化鋁固相萃取柱（QTY∶20 EA/PK，杭州微米派科技有限公司）；灌胃針（8 號(hào)彎針，北京中科慧達(dá)科技有限公司）。模擬組織液（胃液SGF、唾液SSF 和腸液SIF，廣州創(chuàng)峰自動(dòng)化科技有限公司）。實(shí)驗(yàn)用水為超純水（杭州娃哈哈有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 純聚苯乙烯微球（PS）和余輝發(fā)光PNPS的合成

市售苯乙烯中含有阻凝劑，防止苯乙烯發(fā)生自聚，因此在實(shí)驗(yàn)前需對(duì)其進(jìn)行去除阻凝劑處理。將苯乙烯溶液加入到裝有堿性氧化鋁的固相萃取柱中洗滌3 次后， 保存在裝有干燥的無(wú)水氯化鈣的棕色試劑瓶中，在4 ℃儲(chǔ)存，備用。

參考文獻(xiàn)[25-28]的方法并進(jìn)行部分改進(jìn)合成PS 和PNPS。稱取1.0 g PVP 置于圓底燒瓶中，然后加入98 mL 超純水，在室溫下超聲5 min 后，磁力攪拌1 min，待PVP 完全分散后，將圓底燒瓶放入35 ℃油浴中，攪拌。體系密封除氧15 min（氮?dú)馇虺?，重?fù)3～5 次）后，將5 mL 苯乙烯溶液加入到體系中。將0.15 g 引發(fā)劑Na2S2O8 分散到2 mL 水中，超聲分散均勻后加入到上述體系中，邊攪拌邊升溫到80 ℃，反應(yīng)24 h。將反應(yīng)后的溶液以11000 r/min 離心20 min， 產(chǎn)物用超純水洗滌3 次，在45 ℃真空干燥24 h，得到PS。

將1.0 g PVP 和98 mL 超純水加入圓底燒瓶中，超聲至PVP 充分分散。將分散液置于35 ℃油浴中，攪拌。體系密封除氧15 min（氮?dú)馇虺?，重?fù)3～5 次）后，將1 mL PF-MEHPPV 的THF 溶液（5 mg/mL）與250 μL NCBS 的THF 溶液（1 mg/mL）混勻，立即加入到5 mL 苯乙烯溶液中，形成混合溶液后加入到圓底燒瓶中。將0.15 g 引發(fā)劑Na₂S₂O₈ 分散到2 mL 超純水中，超聲分散均勻后加入到上述體系中，邊攪拌邊升溫到80 ℃后，反應(yīng)24 h。將反應(yīng)后的溶液以11000 r/min 離心20 min， 產(chǎn)物用超純水洗滌3 次，45 ℃真空干燥24 h，得到黃色的固體粉末，即為摻雜PF-MEHPPV 和NCBS 的聚苯乙烯復(fù)合微球（PNPS）。

1.2.2 PF-MEHPPV NPs 和NCBS NPs的合成

參考文獻(xiàn)[23]的方法并進(jìn)行部分改進(jìn)合成NPs。將半導(dǎo)體聚合物PF-MEHPPV（0.2 mg/mL， 5 mL）和兩親性共聚物PEG-b-PPG-b-PEG（5 mg/mL， 20 mL）在THF 中充分混合，超聲處理后，將其快速注入到20 mL 超純水中，在氮?dú)鈿夥罩姓舭l(fā)（65 ℃）去除THF，用0.22 μm 過(guò)濾器除去產(chǎn)物溶液中較大的顆粒，過(guò)濾液用超濾離心管（截留分子量10 kDa）離心并使體積濃縮至1 mL， 再用超純水反復(fù)洗滌3 次，除去未反應(yīng)的單體，獲得PF-MEHPPV NPs。

將半導(dǎo)體聚合物PF-MEHPPV（0.2 mg/mL， 5 mL）和兩親性共聚物PEG-b-PPG-b-PEG（5 mg/mL， 20 mL）在THF 中充分混合，加入光敏劑NCBS（0.05 μmoL），超聲處理。其余過(guò)程與制備PF-MEHPPV NPs 的過(guò)程相同，最終得到NCBS NPs。

1.2.3 PNPS 的余輝發(fā)光性能測(cè)試

將15 mg PNPS 粉末置于黑色96 孔板中均勻鋪平，用紅光LED 燈（（650±10） nm， 0.07 W/cm²）激發(fā)5 min 后，立即轉(zhuǎn)移到小動(dòng)物成像儀中，在激發(fā)濾光片設(shè)置為“Block”，發(fā)射濾光片分別設(shè)置為“Open”、“Em 570 nm”和“Em 790 nm”這3種模式下，在不同時(shí)間點(diǎn)采集余輝圖像，曝光時(shí)間設(shè)置為60 s， 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集圖像前均用紅光LED 燈激發(fā)5 min。

1.2.4 PNPS 的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

（1） 余輝穩(wěn)定性將5 mg PNPS 粉末分別分散于1 mL 超純水和1 mL 不同模擬組織液（SGF、SSF和SIF）中，制備4 組待測(cè)液。分別取200 μL 上述4 組待測(cè)液置于黑色96 孔板中，用紅光LED 燈（（650±10） nm， 0.07 W/cm²）激發(fā)5 min 后，立即轉(zhuǎn)移到小動(dòng)物成像儀中，在激發(fā)濾光片設(shè)置為“Block”、發(fā)射濾光片設(shè)置為“Open”的模式下，在不同時(shí)間點(diǎn)采集余輝圖像，曝光時(shí)間設(shè)置為60 s，每次采集圖像前均用LED 燈激發(fā)5 min。（2） NCBS 擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)將25 mg PNPS 粉末分別分散于5 mL 超純水和5 mL 模擬胃液中，以8000 r/min 離心，在不同時(shí)間點(diǎn)收集上清液，并以NCBS NPs 的水分散液作為對(duì)照，利用熒光分光光度計(jì)在狹縫5 nm、電壓500 V、激發(fā)波長(zhǎng)690 nm 的條件下掃描熒光發(fā)射光譜。（3） 過(guò)硫酸鈉殘留實(shí)驗(yàn)配制0.8 mol/L KI 標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別移取200 μL 一系列不同濃度的Na₂S₂O₈ 標(biāo)準(zhǔn)溶液（0～500 μg/mL）與200 μL KI 溶液混合，靜置30 min，作為顯色反應(yīng)的定量基準(zhǔn)對(duì)照組。將25 mg PNPS 粉末分別分散于5 mL 超純水和5 mL 模擬胃液中，分別以超純水和模擬胃液作為空白對(duì)照，吸取放置不同時(shí)間的200 μL分散液，與200 μL KI 標(biāo)準(zhǔn)溶液混合，靜置30 min，觀察顏色變化。

1.2.5 PNPS 的組織穿透能力測(cè)試

將15 mg PNPS 粉末置于黑色96 孔板中均勻鋪平，用紅光LED 燈（（650±10） nm， 0.07 W/cm²）激發(fā)5 min 后，將切好的不同厚度的豬肉組織置于孔板上方，并立即轉(zhuǎn)移到小動(dòng)物成像儀中，在激發(fā)濾光片設(shè)置為“Block”、發(fā)射濾光片設(shè)置為“Open”的模式下，激發(fā)停止0.25 min 后采集余輝圖像，曝光時(shí)間設(shè)置為60 s。

1.2.6 小鼠活體內(nèi)的PNPS 余輝成像實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)

小鼠選用5～6 周齡的BALB/c 雌性小鼠，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵循江南大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與護(hù)理的規(guī)定（倫理審核編號(hào)：JN.No20231007b0660120[445]）。將12 只小鼠隨機(jī)分為兩組，一組3 只，以PS 微球灌胃，作為對(duì)照組；另一組9 只，以PNPS 復(fù)合微球灌胃，作為實(shí)驗(yàn)組。分別稱取5 mg PS 和PNPS 粉末溶于1 mL 無(wú)菌水中，超聲分散5 min 后，用1 mL 注射器吸取200 μL 分散液，借助灌胃針（8號(hào)灌胃針，彎針）灌胃小鼠，用紅光LED 燈（（650±10） nm，0.07 W/cm²）照射小鼠5 min 后立即轉(zhuǎn)移到小動(dòng)物成像儀中進(jìn)行成像，在激發(fā)濾光片設(shè)置為“Block”、發(fā)射濾光片設(shè)置為“Open”的模式下，在紅光LED 燈激發(fā)停止0.25 min 后采集小鼠余輝圖像，曝光時(shí)間設(shè)置為60 s， 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集余輝圖像前均用紅光LED 燈照射5 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 PS和PNPS的表征

通過(guò)掃描電子顯微鏡以及納米激光粒度儀對(duì)制備得到的純PS 微球和PNPS 復(fù)合微球的形貌及電勢(shì)進(jìn)行表征。由圖2A 和2B 可見(jiàn)， PS 微球和PNPS 復(fù)合微球的形貌均為球形，并且較為均一，粒徑分別為（220±6.96） nm 和（235±15.06） nm（圖2C）。PS 微球和PNPS 復(fù)合微球具有相似的Zeta 電勢(shì)，分別為（?12.30±0.26） mV 和（?11.73±0.20） mV（圖2D）。以上結(jié)果表明，半導(dǎo)體聚合物PF-MEHPPV 和光敏劑NCBS 摻雜對(duì)PS 微球的粒徑和Zeta 電勢(shì)均無(wú)明顯的影響。

2.2 PF-MEHPPV NPs 和NCBS NPs 的光學(xué)性質(zhì)及能量轉(zhuǎn)移可行性

Jiang 等[22]報(bào)道了半導(dǎo)體聚合物納米粒子近紅外余輝發(fā)光的機(jī)理。基于該機(jī)理，對(duì)本研究的余輝發(fā)光機(jī)理進(jìn)行了分析（圖3A）。光敏劑NCBS 在光照激發(fā)下可以產(chǎn)生單線態(tài)氧（¹O₂），半導(dǎo)體聚合物PF-MEHPPV 中的碳碳雙鍵（C=C）被¹O₂ 氧化成PF-MEHPPV-環(huán)氧雜環(huán)（PF-MEHPPV-dioxetane）高能中間體，這種中間體極不穩(wěn)定，會(huì)很快降解并釋放出光子， PF-MEHPPV 釋放出的光波長(zhǎng)在可見(jiàn)光區(qū)（500～600 nm）， 可進(jìn)一步通過(guò)能量轉(zhuǎn)移激發(fā)光敏劑NCBS，從而將余輝發(fā)光轉(zhuǎn)移到近紅外區(qū)域（780 nm）。為考察本研究中PF-MEHPPV 和光敏劑NCBS 之間是否發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，對(duì)其進(jìn)行了熒光光譜和紫外-可見(jiàn)吸收光譜表征。由于PF-MEHPPV 和NCBS 分子不溶于水，因此將PF-MEHPPV 和NCBS 分別通過(guò)納米沉淀的方法制備得到PF-MEHPPV NPs 和NCBS NPs 的水分散液后，再進(jìn)行測(cè)試。在激發(fā)波長(zhǎng)為490 nm條件下， PF-MEHPPV NPs 在500～600 nm 范圍內(nèi)展示出一個(gè)寬的熒光發(fā)射峰（圖3B），而NCBS NPs 在521、690 和739 nm 下均有激發(fā)光譜峰（圖3C 曲線a），在最大激發(fā)波長(zhǎng)690 nm 下得到的發(fā)射光譜主要位于近紅外區(qū)域（750～850 nm）（圖3C 曲線b）。由紫外-可見(jiàn)吸收光譜（圖3D）可見(jiàn)， PF-MEHPPV NPs 的吸收峰主要在200～520 nm（圖3D 曲線a），而NCBS NPs 在200～450 nm 和650～800 nm 波段均有吸收（圖3D 曲線b）。因此， NCBS NPs可以吸收紫外和可見(jiàn)區(qū)域的光，也可以吸收近紅外光，而PF-MEHPPV NPs只能吸收紫外和可見(jiàn)區(qū)域的光。為了測(cè)試NCBS NPs 能否被PF-MEHPPV NPs 發(fā)出的光激發(fā)，將熒光光譜儀激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為521 nm 并對(duì)光敏劑NCBS NPs 進(jìn)行激發(fā)，可觀察到780 nm 處的熒光光譜峰，但熒光強(qiáng)度較弱（圖3E曲線a）。為測(cè)試紅光LED燈（（650±10） nm）能否激發(fā)光敏劑NCBS NPs，將熒光光譜儀激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為650 nm，得到了750～850 nm 范圍內(nèi)的熒光光譜峰，并且熒光強(qiáng)度較強(qiáng)（圖3E 曲線b）。上述結(jié)果表明， PF-MEHPPV NPs 的發(fā)光通過(guò)能量共振轉(zhuǎn)移激發(fā)NCBS NPs，從而發(fā)射近紅外區(qū)域的光具有可行性，而NCBS NPs可以用650 nm的光進(jìn)行有效激發(fā)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選用紅光LED燈（（650±10） nm）作為激發(fā)光源。

2.3 PNPS 復(fù)合微球的余輝性能研究

為了考察PNPS 復(fù)合微球的余輝性能，通過(guò)小動(dòng)物活體成像儀采集PNPS 復(fù)合微球的余輝成像。由圖4A 和4B 可見(jiàn)，在紅光LED 燈激發(fā)5 min 后， PNPS 在發(fā)射濾光片為“Open”模式下余輝持續(xù)發(fā)光時(shí)間可以達(dá)到96 h，在激發(fā)停止0.25 min 后余輝強(qiáng)度可達(dá)到1.641×10⁸ p/（s·c·m²·sr），表明其具有良好的余輝強(qiáng)度和持續(xù)發(fā)光時(shí)間。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證余輝發(fā)光能否轉(zhuǎn)移到近紅外區(qū)域，對(duì)PNPS 在相同預(yù)照射條件下不同發(fā)射波長(zhǎng)處的余輝發(fā)光成像進(jìn)行采集。如圖4C 和4D 所示，當(dāng)發(fā)射濾光片波長(zhǎng)設(shè)為570 nm 時(shí)，在激發(fā)停止0.25 min 后PNPS 的余輝強(qiáng)度為9.398×10⁷ p/（s·cm²·sr）；當(dāng)波長(zhǎng)設(shè)置為790 nm 時(shí)，激發(fā)停止0.25 min 后余輝強(qiáng)度為4.971×10⁷ p/（s·cm²·sr）。上述結(jié)果表明， PF-MEHPPV NPs 確實(shí)有部分發(fā)光轉(zhuǎn)移到了近紅外區(qū)域，其組織穿透能力得以提高。

2.4 PNPS 復(fù)合微球的穩(wěn)定性研究

考察了PNPS 復(fù)合微球的穩(wěn)定性。采集PNPS 復(fù)合微球分散到不同的模擬組織液（SSF、SGF 和SIF）以及水溶液中的余輝發(fā)光，如圖5 所示。在相同的紅光LED 燈照射下， 4 種分散液在放置不同時(shí)間點(diǎn)的余輝強(qiáng)度略有差別， PNPS 在胃液環(huán)境中的余輝強(qiáng)度并未受到酸性環(huán)境的不利影響，反而比其它3 種溶液的強(qiáng)度略高，這主要是因?yàn)镹CBS 染料分子的熒光行為受酸性環(huán)境的影響；4 種分散液的余輝強(qiáng)度隨著時(shí)間延長(zhǎng)而基本趨于穩(wěn)定，但稍有下降的趨勢(shì)，這主要與NCBS 染料分子的光漂白性質(zhì)有關(guān)。以上結(jié)果表明， PNPS 復(fù)合微球具有較好的余輝穩(wěn)定性，在不同模擬組織液中放置96 h 后，余輝強(qiáng)度仍能達(dá)到5×10⁶ p/（s·cm²·sr）以上。

為了進(jìn)一步考察NCBS 染料能否從PNPS 復(fù)合微球中擴(kuò)散，將PNPS 復(fù)合微球分別分散在模擬胃液和水溶液中，放置不同時(shí)間后，離心，測(cè)定上清液的熒光光譜，結(jié)果如圖6 所示，與染料NCBS 的熒光強(qiáng)度相比， PNPS 復(fù)合微球無(wú)論是在水溶液（圖6A）還是在模擬胃液（圖6B）中，隨著時(shí)間延長(zhǎng)， 離心后的上清液均未表現(xiàn)出明顯的NCBS 的特征發(fā)射峰，表明PNPS 在兩種溶液中放置96 h 后， 幾乎沒(méi)有NCBS 染料分子擴(kuò)散到溶液中，表明PNPS 具有較好的穩(wěn)定性。

在PNPS 復(fù)合微球合成過(guò)程中，使用過(guò)硫酸鈉作為引發(fā)劑。為了驗(yàn)證最終的PNPS 復(fù)合微球是否含有Na₂S₂O₈ 殘留，利用Na₂S₂O₈ 與KI 的顯色反應(yīng)進(jìn)行研究。保持KI 濃度不變，改變Na₂S₂O₈ 標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（0～500 μg/mL），反應(yīng)30 min， 作為顯色反應(yīng)的定量基準(zhǔn)對(duì)照組（圖6C），顏色越深，表明Na₂S₂O₈ 濃度越高。將PNPS 分散在水溶液（圖6D）和模擬胃液（圖6E）中，放置不同時(shí)間后的溶液與KI 標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行顯色反應(yīng)，與定量基準(zhǔn)對(duì)照組進(jìn)行比較，顏色均未發(fā)生明顯變化，表明PNPS分散液中幾乎不含有Na₂S₂O₈。

2.5 PNPS 復(fù)合微球的余輝發(fā)光組織穿透能力

將豬肉組織切割成不同厚度，放置在裝有15 mg PNPS 固體粉末（預(yù)照射5 min）的孔板中，進(jìn)行余輝圖像采集，進(jìn)一步考察PNPS 復(fù)合微球的余輝發(fā)光的組織穿透能力。如圖7 所示，當(dāng)豬肉組織厚度為0.5 cm 時(shí)，采集的余輝強(qiáng)度可以達(dá)到1.205×10⁷ p/（s?cm²?sr）；隨著豬肉組織厚度逐漸增大，余輝發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降，直至組織厚度增至1.8 cm 時(shí)，余輝強(qiáng)度為9.483×10⁵ p/（s?cm²?sr）；組織厚度繼續(xù)增至2.0 cm時(shí)，未采集到材料的余輝發(fā)光信號(hào)。上述結(jié)果表明，在此測(cè)試條件下， PNPS 的余輝穿透組織深度至少可達(dá)到1.8 cm， 將其應(yīng)用到活體成像中具有一定的可行性。

2.6 PNPS 復(fù)合微球在小鼠活體內(nèi)的余輝成像

為了考察PNPS 復(fù)合微球在小鼠活體內(nèi)的余輝成像效果，將純PS 微球和PNPS 復(fù)合微球粉末制備成分散液后灌胃小鼠，在紅光LED 燈的激發(fā)停止0.25 min 后采集余輝圖像，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集圖像前均用紅光LED 燈激發(fā)5 min。如圖8A 所示，對(duì)照組小鼠灌胃純PS 微球后，在24 h 內(nèi)均未表現(xiàn)出余輝信號(hào)，表明純PS 微球不具有余輝性能。對(duì)實(shí)驗(yàn)組小鼠灌胃相同質(zhì)量的PNPS 復(fù)合微球， 30 min 后采集余輝圖像，發(fā)現(xiàn)發(fā)光信號(hào)主要分布在小鼠胃部；隨著灌胃時(shí)間延長(zhǎng)至2 h，小鼠胃部的余輝強(qiáng)度減弱，且在4 h 后轉(zhuǎn)移到腸道部位；灌胃10 h 后，小鼠胃部的余輝強(qiáng)度較4 h 前明顯減弱，說(shuō)明PNPS 復(fù)合微球可以隨著時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸代謝；當(dāng)灌胃時(shí)間達(dá)到24 h 時(shí)，小鼠胃部仍能檢測(cè)到余輝信號(hào)；當(dāng)灌胃時(shí)間達(dá)到48 和72h時(shí)，小鼠全身未檢測(cè)到余輝信號(hào)。

將灌胃后的小鼠進(jìn)行解剖，對(duì)主要器官進(jìn)行成像，結(jié)果如圖8B 和8C 所示。對(duì)照組小鼠灌胃純PS 微球24 h 后所有器官均不發(fā)光，而灌入PNPS 復(fù)合微球24 h 的實(shí)驗(yàn)組小鼠的胃部及肺部均有余輝，胃部的余輝發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)更強(qiáng)，表明PNPS 復(fù)合微球在體內(nèi)的停留時(shí)間可以達(dá)到24 h，并且少量PNPS 復(fù)合微球會(huì)進(jìn)入肺部。解剖灌胃48 和72 h 的實(shí)驗(yàn)組小鼠，對(duì)其主要器官進(jìn)行成像，發(fā)現(xiàn)灌胃48 h 的小鼠胃部仍具有余輝信號(hào)，而灌胃72 h 后小鼠的器官均未檢出余輝信號(hào)。上述結(jié)果表明， PNPS 復(fù)合微球可以通過(guò)余輝發(fā)光信號(hào)追蹤到微球在小鼠體內(nèi)分布的時(shí)間達(dá)到24 h，對(duì)解剖后器官的成像示蹤可以達(dá)到48 h。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)共摻雜半導(dǎo)體聚合物PF-MEHPPV 和光敏劑NCBS，成功制備了余輝發(fā)光聚苯乙烯復(fù)合微球，并實(shí)現(xiàn)了共摻雜聚苯乙烯復(fù)合微球在小鼠活體內(nèi)的余輝成像。共摻雜對(duì)聚苯乙烯微球的粒徑和電勢(shì)無(wú)明顯影響，摻雜后的聚苯乙烯復(fù)合微球余輝發(fā)光持續(xù)時(shí)間可達(dá)96 h，具有較好的余輝發(fā)射強(qiáng)度和近紅外發(fā)光，組織穿透深度可達(dá)1.8 cm，并且在小鼠活體內(nèi)監(jiān)測(cè)到的余輝成像信號(hào)持續(xù)長(zhǎng)達(dá)24 h， 解剖器官的余輝成像信號(hào)可以持續(xù)到48 h。本研究為微塑料在生物活體內(nèi)的成像示蹤提供了新方法。