摘 要 MORF4L2是一種轉(zhuǎn)錄因子，通過形成NuA4組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶復合物來參與異染色質(zhì)組裝和組蛋白修飾，對細胞生長、增殖和凋亡起重要作用。為了探究馬鹿（Cervus elaphus）鹿茸中MORF4L2所發(fā)揮的功能，使用qPCR技術檢測鹿茸不同組織中MORF4L2 基因的表達水平，采用PCR克隆馬鹿MORF4L2 基因的CDS序列，通過多物種比對MORF4L2 基因mRNA序列進行相似性分析并構建系統(tǒng)進化樹，利用生物信息學方法預測分析MORF4L2 編碼蛋白的結(jié)構與理化性質(zhì)。結(jié)果顯示：MORF4L2 在馬鹿鹿茸的前軟骨層中表達量最高；馬鹿MORF4L2 的mRNA序列較為保守，與加拿大馬鹿（C. canadensis）中MORF4L2 的相似性最高；馬鹿MORF4L2 基因CDS區(qū)全長為864 bp，編碼287個氨基酸，理論等電點為9. 73，為堿性蛋白；預測發(fā)現(xiàn)馬鹿MORF4L2蛋白不存在信號肽，有30個潛在磷酸化位點；蛋白質(zhì)結(jié)構主要由無規(guī)則卷曲和α-螺旋構成，主要定位在細胞核中。研究結(jié)果可為MORF4L2 在馬鹿鹿茸生長發(fā)育過程中所起的作用提供重要基礎數(shù)據(jù)。

關鍵詞：馬鹿；MORF4L2；組織表達；基因克隆；生物信息學

中圖分類號：Q785；S825

文獻標志碼：A

文章編號：2310 - 1490（2024）- 04 - 0774 - 07

DOI：10.12375/ysdwxb.20240410

死亡因子4樣2（mortality factor 4 like 2，MORF4L2/MRGX）是一種轉(zhuǎn)錄因子，其所在的蛋白質(zhì)家族有7個成員，分別是多個不同輔抑制因子復合物的組成部分［1］。MORF4L2 的表達具有組織特異性，在卵巢、大腦等器官中表達較多，且表達量與細胞周期相關［2］。MORF4L2 是NuA4 組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶復合物的組分，參與異染色質(zhì)組裝和組蛋白修飾，該復合體主要通過核小體組蛋白H4和H2A的乙酰化參與選定基因的轉(zhuǎn)錄激活，能夠激活癌基因和原癌基因介導的生長誘導，另一方面激活抑癌基因介導的生長停滯和復制性衰老，從而提高細胞DNA修復和抑制凋亡的水平［3?5］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在食管癌細胞中，MORF4L2 表達量與死亡風險呈正相關［6］；在腫瘤干細胞藥物治療中，存活的腫瘤干細胞展現(xiàn)出更強的耐藥性，同時伴隨MORF4L2 的表達量顯著增高［4］。這些研究提示了MORF4L2在維持細胞的生長增殖過程中起重要作用。

鹿茸是目前哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的唯一可完全再生的器官，為研究哺乳動物骨骼發(fā)育和器官再生提供了模型［7］。處于快速生長期的鹿茸細胞，其增殖速率甚至超過癌變組織，同時鹿茸細胞的凋亡率也較高，從而能夠防止腫瘤的發(fā)生［8］。因此研究鹿茸的生長發(fā)育機制能夠為預防和治療癌癥提供新見解。MORF4L2作為轉(zhuǎn)錄因子，能夠激活或抑制許多基因的表達，并參與DNA修復和調(diào)控細胞凋亡，不僅與鹿茸的生長發(fā)育機制有關，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展也有重要作用，但目前鮮有研究馬鹿（Cervus elaphus）MORF4L2蛋白的結(jié)構和功能的文獻資料。本研究使用實時熒光定量PCR（real time fluorogenic quanti?tative PCR，qPCR）技術檢測馬鹿鹿茸各組織中MORF4L2 的表達水平，克隆了馬鹿MORF4L2 基因的CDS 區(qū)序列，并通過生物信息學軟件分析MORF4L2的蛋白結(jié)構和理化性質(zhì)等特征，為研究該基因在鹿茸生長發(fā)育中所發(fā)揮的作用提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 鹿茸組織采集與保存

在秦皇島野生動物園采集健康雄性馬鹿二杠茸時期的鹿茸作為快速生長期樣品。取鹿茸頂端約5 cm部分，將鹿茸頂端縱向切開，分離出茸皮層、間充質(zhì)層、前軟骨層和軟骨層4 種組織，將組織切成0. 5 cm3的組織塊后置于-80 ℃保存?zhèn)溆茫?］。

1. 2 引物設計與合成

使用NCBI 中BLAST 功能比對多個物種MORF4L2 基因的CDS 區(qū)，發(fā)現(xiàn)該基因CDS 區(qū)較保守。根據(jù)NCBI中馬鹿MORF4L2 基因序列和GAPDH基因序列，利用Primer3和Oligo 7軟件設計CDS區(qū)克隆引物和qPCR引物（表1），引物均由北京睿博興科生物技術有限公司合成。

1. 3 馬鹿總RNA 提取和cDNA 合成

使用RNA提取試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）分別提取馬鹿鹿茸的茸皮層、間充質(zhì)層、前軟骨層和軟骨層的總RNA，提取完成后用NanoDrop One分光光度計（美國賽默飛有限公司）鑒定RNA的濃度與質(zhì)量。使用合格的RNA樣品作為模板，用cDNA 合成試劑盒（Hifair Ⅲ 1st StrandcDNA Synthesis SuperMix for qPCR，上海翌圣生物科技有限公司）將4種組織的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃保存。

1. 4 MORF4L2 基因在馬鹿鹿茸各組織中的mRNA 相對表達量測定

分別用4 種組織的cDNA 作為模板，以GAPDH基因做內(nèi)參對照，利用qPCR（熒光定量PCR儀型號CFX96，美國Bio-Rad 公司）測定鹿茸各組織中MORF4L2 基因的mRNA表達水平。qPCR擴增體系（單個孔總體系為10. 0 μL）：模板1. 0 μL，上、下游引物各0. 4 μL，ddH2O 3. 2 μL，2 × SYBR Green qPCRMaster Mix（Selleckchem 公司）5. 0 μL。使用軟件Bio-Rad CFX Manager 3. 0 中的快速路徑CFX_RT_qPCR+Melt作為擴增程序。每個樣品做3孔重復。

1. 5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

以馬鹿鹿茸軟骨層中MORF4L2 基因的mRNA表達值作為對照組，使用2-ΔΔCt方法計算鹿茸各組織中MORF4L2 基因的mRNA相對表達量，利用Graph?Pad Prism 8. 0. 2軟件進行數(shù)據(jù)分析并作圖，采用t 檢驗進行兩兩比較，P lt; 0. 05則表示差異顯著。

1. 6 馬鹿MORF4L2 基因CDS 區(qū)的克隆與測序

按照2 × Rapid Taq Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）說明書配置PCR體系，以軟骨層組織總RNA 合成的cDNA 為模板擴增MORF4L2 基因的CDS 序列（PCR 儀型號SEDI-G，威泰克有限公司）。PCR體系（總體積20 μL）包括ddH2O 6 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 模板2 μL，2 × Rapid TaqMaster Mix 10 μL。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（電泳儀型號PowerPac HV，美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)型號KETA GL，威泰克有限公司），DL5000 DNA marker（寶生物工程（大連）有限公司），在紫外分析儀（型號WD-9403F，北京六一儀器廠）中切下目的條帶所在的凝膠塊，根據(jù)DNA純化試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）說明書回收凝膠中的目的條帶。使用pMD-19T載體試劑盒（寶生物工程（大連）有限公司）將回收條帶與pMD-19T載體連接，體系：ddH2O 2 μL，膠回收產(chǎn)物2 μL，pMD-19T載體1 μL，SolutionⅠ5 μL，16 ℃反應30 min。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α 感受態(tài)細胞（上海唯地生物技術有限公司）中，涂布在含氨芐的LB 培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)后，挑取單個菌落搖菌培養(yǎng)后進行菌液PCR鑒定，經(jīng)驗證的菌液送至北京睿博興科生物技術有限公司測序。

1. 7 生物信息學分析工具

從NCBI 數(shù)據(jù)庫中獲得多個物種MORF4L2 的mRNA序列，包括馬鹿、家犬（Canis lupus familiaris）、綿羊（Ovis aries）、黃牛（Bos taurus）、水牛（Bubalusbubalis）、馬（Equus caballus）、野豬（Sus scrofa）、人（Homo sapiens）、小家鼠（Mus musculus）和加拿大馬鹿（Cervus canadensis），利用DNAStar 中的MegAlign軟件進行相似性分析，用軟件MEGA11 構建MORF4L2 基因系統(tǒng)進化樹。

利用在線工具ProtParam（https：//web. expasy.org/protparam/）分析MORF4L2 蛋白的理化性質(zhì)，利用在線工具ProtScale（https：//web. expasy. org/protscale/）分析MORF4L2 蛋白的疏水性，使用在線軟件NetPhos-3. 1（https：//services. healthtech. dtu. dk/service. php？NetPhos-3. 1）預測MORF4L2蛋白的磷酸化位點，使用在線軟件SignalP-4. 1（https：//ser?vices. healthtech. dtu. dk/service. php？ SignalP-4. 1）預測MORF4L2 蛋白信號肽，利用在線工具WoLFPSORT（https：//wolfpsort. hgc. jp/）對MORF4L2 蛋白進行亞細胞定位分析，使用在線軟件SWISS-MODEL（https：//swissmodel. expasy. org/）構建MORF4L2蛋白的三級結(jié)構，利用在線工具PRABI-GERLAND（https：//npsa-prabi. ibcp. fr/cgi-bin/npsa_automat. pl？page=/NPSA/npsa_seccons. html）分析MORF4L2蛋白的二級結(jié)構［9］。

2 結(jié)果與分析

2. 1 MORF4L2 基因在馬鹿鹿茸各組織中的相對表達量

檢測馬鹿鹿茸4 種組織中MORF4L2 基因的mRNA 表達水平，使用GraphPad Prism 8. 0. 2 分析qPCR數(shù)據(jù)結(jié)果，結(jié)果顯示：MORF4L2 基因在間充質(zhì)層和茸皮層中表達量較低，在軟骨層和茸皮層中表達量略高于間充質(zhì)層，但不顯著（P gt; 0. 05），而在鹿茸前軟骨層中表達量最高，顯著高于軟骨層、茸皮層和間充質(zhì)層中的表達量（P lt; 0. 05；圖1）。

2. 2 馬鹿MORF4L2 基因CDS 區(qū)克隆

以馬鹿鹿茸軟骨層cDNA為模板擴增MORF4L2基因CDS區(qū)，PCR完成后通過電泳獲得864 bp的特異性條帶（圖2），與預期一致。條帶回收后與pMD-19T載體連接并轉(zhuǎn)化，經(jīng)測序并比對后，成功克隆了馬鹿MORF4L2 基因CDS區(qū)，在第273位堿基與NCBI網(wǎng)站預測不同，應將堿基T更新為堿基C，編碼氨基酸序列一致。

2. 3 生物信息學分析

2. 3. 1 相似性分析及系統(tǒng)進化樹構建

在NCBI 數(shù)據(jù)庫中收集10 個物種的MORF4L2基因序列，使用MegAlign軟件進行序列比對并做相似性分析，結(jié)果顯示馬鹿與加拿大馬鹿MORF4L2 基因的mRNA序列相似性最高，為99. 9%；與小家鼠相似性較低，為84. 7%（圖3）。使用MEGA 11軟件，先通過ClustalW方法比對這10個物種的基因序列，再使用最小進化法（minimum evolution method）構建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示馬鹿與加拿大馬鹿之間的遺傳距離最近，與小家鼠最遠（圖4），和序列相似性分析結(jié)果一致。

2. 3. 2 馬鹿MORF4L2蛋白的組成、結(jié)構和理化性質(zhì)

馬鹿MORF4L2 基因CDS區(qū)全長為864 bp，編碼287個氨基酸。蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示：馬鹿MORF4L2蛋白的分子式為C1423H2275N415O424S8，相對分子質(zhì)量為32 237. 72，原子總數(shù)為4 545，理論等電點為9. 73，為堿性蛋白；MORF4L2蛋白的氨基酸組成如表2所示，其中賴氨酸（Lys）占比最高，半胱氨酸（Cys）占比最低，帶正電的殘基總數(shù)（Arg + Lys）為48個，帶負電的殘基總數(shù)（Asp + Glu）為32 個；馬鹿MORF4L2蛋白N端第1個氨基酸為甲硫氨酸（Met），體外半衰期為30 h，預測不穩(wěn)定指數(shù)為44. 97，為不穩(wěn)定蛋白；脂溶系數(shù)為67. 70，平均親水性為-0. 812，為親水性蛋白。

蛋白質(zhì)的疏水性分析結(jié)果見圖5A，馬鹿MORF4L2 蛋白第76 位賴氨酰胺分值最低（-3. 589），其殘基親水性最強；第251 位亮氨酸（Leu）分值最高（2. 033），其殘基疏水性最強，表明馬鹿MORF4L2 蛋白為親水性蛋白。使用在線軟件SignalP-4. 1預測信號肽，結(jié)果表明MORF4L2蛋白中不存在信號肽（圖5B）。潛在磷酸化位點預測結(jié)果顯示，馬鹿MORF4L2蛋白中共存在30個潛在磷酸化位點，包括15 個絲氨酸（Ser）位點、10 個蘇氨酸（Thr）位點和5 個酪氨酸（Tyr）位點（圖5C）。馬鹿MORF4L2蛋白的亞細胞定位預測結(jié)果為細胞核27、細胞核和細胞質(zhì)15. 5、細胞質(zhì)2和胞外1，綜合來看，MORF4L2蛋白主要定位在細胞核中。使用在線軟件SWISS-MODEL構建蛋白的三級結(jié)構，模型顯示馬鹿MORF4L2 蛋白以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主（圖5D）。分析馬鹿MORF4L2 蛋白的二級結(jié)構發(fā)現(xiàn)，MORF4L2蛋白主要由無規(guī)則卷曲、α-螺旋、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角組成，分別占48. 43%、44. 95%、3. 83% 和2. 79%（圖5E）。

3 討論

本研究利用qPCR 檢測馬鹿鹿茸不同組織中MORF4L2 的表達量，發(fā)現(xiàn)MORF4L2 在前軟骨層中表達量最高，在軟骨層中表達量較高。前軟骨層作為間充質(zhì)層和軟骨層的過渡區(qū)域，由快速增殖的狀態(tài)向分化狀態(tài)轉(zhuǎn)變［10］，推測MORF4L2通過與其互作蛋白組成NuA4組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶復合物調(diào)控相關基因的表達，調(diào)控細胞周期，維持細胞增殖與分化的平衡，同時能夠與TERRA協(xié)作維護端粒長度及穩(wěn)定性［11］。在之前的相關研究中，通過RNA-seq 發(fā)現(xiàn)MORF4L2 在馴鹿（Rangifer tarandus）鹿茸的間充質(zhì)組織中高表達，作者認為MORF4L2與復制性衰老、細胞凋亡和DNA修復緊密聯(lián)系，這可能與鹿茸快速生長相關［12］。此外，在牛胚胎細胞中，MORF4L2 的轉(zhuǎn)錄水平會隨應激程度的變化而有所不同，提示MORF4L2與代謝組模式和凋亡激活相關聯(lián)［13］。

為進一步研究馬鹿MORF4L2基因特征，筆者克隆了其CDS序列，該序列全長為864 bp，編碼287個氨基酸。通過序列相似性分析并構建進化樹，可以觀察到MORF4L2 基因在進化過程中較為保守。經(jīng)過生物信息學軟件預測和分析，得到馬鹿MORF4L2編碼蛋白的相對分子量為32 237. 72，理論等電點為9. 73，不穩(wěn)定指數(shù)為44. 97，平均親水性為-0. 812，是不穩(wěn)定的堿性親水蛋白。MORF4L2蛋白有潛在磷酸位點30個，不存在信號肽，亞細胞定位主要在細胞核中，這與其作為NuA4組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶復合物發(fā)揮的功能相關。

MORF4L2所在的蛋白質(zhì)家族有7個成員，其中MORF4、MORF4L2 和MRG15 具有高度相似的編碼序列［2］。MORF4是細胞增殖的抑制劑，而MORF4L2則會根據(jù)不同的細胞類型展現(xiàn)出不同的功能，可能激活或者抑制基因啟動子，MORF4L2通過螺旋-環(huán)-螺旋和亮氨酸拉鏈區(qū)域與RB1蛋白互作，在EJ細胞中抑制B-myb 啟動子，而在Hela細胞中，激活B-myb啟動子，調(diào)控細胞周期和增殖水平［14］。在馬鹿鹿茸前軟骨層中，MORF4L2 的表達量最高，這可能是前軟骨層細胞需要擺脫間充質(zhì)層細胞的高度增殖狀態(tài)而轉(zhuǎn)變?yōu)榉只癄顟B(tài)的軟骨細胞，需要MORF4L2調(diào)控增殖與分化相關基因的表達水平，以保證鹿茸的正常生長發(fā)育，但具體機制仍需進一步探索。

綜上，本研究為深入研究馬鹿MORF4L2基因在鹿茸生長發(fā)育中所發(fā)揮的作用提供重要研究基礎數(shù)據(jù)。

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基金項目：國家自然科學基金面上項目（31671283）