摘要：目的 探討電針對對氯苯丙氨酸（4-chloro-DL-phenylalanine，PCPA）致失眠大鼠乳脂球表皮生長因子 VIII（Milk fat globule-epidermal growth factor VIII，MFG-E8）的影響。方法 50只SD大鼠（雌雄各半）隨機抽取10只作為空白組，除空白組外，剩余40只均腹腔注射PCPA建立失眠模型，經造模、篩選隨機分為模型組、電針組、艾司唑侖組，每組10只，觀察大鼠一般情況變化，戊巴比妥鈉睡眠試驗觀察大鼠睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時間，經電針、艾司唑侖藥物干預7d后，酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測大鼠血清中MFG-E8含量，Western blot法檢測下丘腦組織中MFG-E8蛋白表達。結果 經PCPA造模干預的失眠模型大鼠，戊巴比妥鈉睡眠實驗顯示，睡眠潛伏期延長（P<0.01），睡眠持續(xù)時間縮短（P<0.05）；與空白組比，模型組大鼠血清MFG-E8水平降低（P<0.05），下丘腦中MFG-E8蛋白相對表達量下降（P<0.01）；經電針、艾司唑侖藥物干預后，失眠大鼠晝夜節(jié)律明顯改善，體質量明顯升高（P<0.05），血清中MFG-E8水平升高（P<0.01）；下丘腦中MFG-E8蛋白相對表達增高（P<0.01）；電針組與艾司唑侖組之間MFG-E8含量無明顯統(tǒng)計學差異（P>0.05）。結論 電針對PCPA致失眠大鼠睡眠障礙具有改善作用，揭示電針可上調MFG-E8的表達，其可能機制與MFG-E8調控小膠質細胞，逆轉M1表型極化，降低致炎因子水平有關。

關鍵詞：失眠；炎癥；電針；MFG-E8；小膠質細胞

中圖分類號：R246 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2024）11-0069-06

Exploration of the Effect of Electroacupuncture on MFG-E8 in PCPA-Induced Insomnia Rats Based on the Pivot Theory

TAN Tian1， ZHANG Meng1， WU Yuan1， LIU Lian2， SHI Xue-hui2

（1. The Second Clinical College of Traditional Chinese Medicine， Hunan University of Traditional Chinese Medicine， Changsha 410005， China; 2. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Traditional Chinese Medicine， Changsha 410005， China）

【Abstract】Objective： To study the effect of electroacupuncture on milk fat globule-epidermal growth factor VIII（MFG-E8） in rats with insomnia induced by 4-chloro-DL-phenylalanine（PCPA）. Methods： Fifty SD rats（equally divided by gender） were randomly selected， with 10 rats serving as the blank group. The remaining 40 rats were administered PCPA via intraperitoneal injection to establish an insomnia model. After modeling， the rats were randomly divided into the model group， electroacupuncture group， and estazolam group， 10 rats each group. The general conditions of the rats were observed， and the pentobarbital sodium sleep test was used to measure sleep latency and sleep duration. After 7 days of intervention with electroacupuncture or estazolam， MFG-E8 levels in the serum of the rats were measured by using ELISA， and the relative expression of MFG-E8 protein in the hypothalamus was detected by Western blot. Results： In the PCPA-induced insomnia model rats， the pentobarbital sodium sleep test showed prolonged sleep latency（P<0.01） and shortened sleep duration（P<0.05）. Compared with that of the blank group， the serum MFG-E8 levels in the model group were reduced（P<0.05）， and the relative expression of MFG-E8 protein in the hypothalamus decreased（P<0.01）. After intervention with electroacupuncture and estazolam， the circadian rhythm of insomnia rats significantly improved， and body weight increased（P<0.05）. MFG-E8 levels in the serum increased（P<0.01）， and the relative expression of MFG-E8 protein in the hypothalamus also increased（P<0.01）. No significant statistical difference in MFG-E8 levels was observed between the electroacupuncture and estazolam groups（P>0.05）. Conclusion： Electroacupuncture improves sleep disorders in PCPA-induced insomnia rats， suggesting that electroacupuncture may upregulate the expression of MFG-E8. The underlying mechanism might be related to MFG-E8s regulation of microglial cells， reversal of M1 phenotype polarization and reduction of pro-inflammatory cytokine levels.

【Key words】Insomnia; Inflammation; Electroacupuncture; MFG-E8; Microglial Cells

失眠以睡眠難以啟動或難以維持為主要特點，并伴有焦慮易怒、疲勞、記憶障礙等癥狀^［1］，嚴重影響人們的生活質量，長期睡眠不足會造成體內慢性炎癥，增加心肌損傷、動脈粥樣硬化、患糖尿病、阿爾茨海默病等疾病的風險^［2-3］，對神經免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、精神等多個方面的健康造成威脅。目前失眠的發(fā)病機制迄今尚未完全闡明。慢性炎癥、神經遞質異常改變與失眠、抑郁、阿爾茲海默癥和帕金森病等多種神經系統(tǒng)疾病密切相關^［4-5］，影響神經-內分泌-免疫系統(tǒng)調節(jié)。小膠質細胞過度活化后誘導的神經炎癥可導致突觸變性、神經細胞死亡和認知功能障礙^［6］。基于小膠質細胞角度，其介導的炎癥與失眠的發(fā)生發(fā)展聯(lián)系密切，小膠質細胞兩種表型M1、M2在機體受到刺激時分泌炎癥因子，發(fā)揮著致炎與抗炎的作用共同調節(jié)機體內環(huán)境，失去平衡時，持續(xù)神經炎癥進展進而誘發(fā)失眠，當機體處于失眠狀態(tài)時又會加速致炎因子的釋放。同時，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)PCPA致失眠大鼠小膠質細胞明顯活化，血清及下丘腦的腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）表達明顯增加，結合現(xiàn)有研究提示，失眠使得機體內促炎與抗炎的平衡被打破，再次驗證失眠與小膠質細胞介導的炎癥息息相關。

乳脂球表皮生長因子 VIII（MFG-E8）是一種分泌性糖蛋白，具有廣泛的細胞功能，包括吞噬凋亡細胞、抗炎、組織再生和體內平衡。它可以由多種細胞類型如小膠質細胞、巨噬細胞、星形膠質細胞和神經干細胞等分泌，在預防神經元性疾病中起著關鍵作用^［7-9］；有研究顯示，MFG-E8可通過各種途徑如上調 PI3K-Akt 通路（抑制炎癥損傷起保護作用）^［10］并下調 NF-KB 信號通路（炎癥反應的重要參與者）^［11］，逆轉小膠質細胞 M1表型極化，以及提升小膠質細胞的吞噬速率等，調節(jié)小膠質細胞的功能、調控炎癥因子水平。神經炎癥在失眠的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色，通過MFG-E8干預小膠質細胞功能從而減少神經炎癥可成為治療失眠有前景的策略。

針灸作為一種非藥物治療手段，其不良反應少，療效可靠，不存在藥物依賴和戒斷反應。已有研究證實，針刺治療能夠顯著改善失眠患者入睡困難、易醒、焦慮、抑郁癥狀^［12］。同時證實電針可通過調節(jié)相關炎癥信號通路，如NF-KB信號通路等調控炎癥因子水平來減輕神經炎癥改善睡眠^［13］。失眠屬中醫(yī)之“不寐”，關鍵病機在于“陰陽失交”，陰陽的出入運動又與三陰三陽開闔樞密切相關?；跇袡C理論，調節(jié)少陽、少陰之樞機是解決陰陽失交的關鍵之法。再者，名醫(yī)臨證經驗證實^［14］以調樞安神為切入點，以少陰、少陽經穴及督脈腧穴為主，選取神門、三陰交、百會、本神四穴臨床上治療失眠及改善其伴隨癥狀療效顯著。

本研究采用對氯苯丙氨酸（PCPA）建立失眠大鼠模型，選用電針刺激神門、三陰交、百會、本神穴位，觀察大鼠一般行為學變化和血清、下丘腦的MFG-E8表達，探究電針對失眠模型大鼠MFG-E8的影響，探索MFG-E8與小膠質細胞炎癥之間的聯(lián)系，現(xiàn)報道如下：

1 材料

1.1 實驗動物 購入SPF級健康大鼠50只（雌雄各半），體質量（170±10）g，由湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SYXK（湘）2019-0009。本實驗通過湖南中醫(yī)藥大學動物研究倫理委員會批準，批準編號：LLBH-202211080001。

1.2 實驗藥物 對氯苯丙氨酸（PCPA）（HY-B1368 美國MCE公司）、戊巴比妥鈉（P3761 美國西格瑪奧德里奇公司）、艾司唑侖片（規(guī)格1mg/粒，華中藥業(yè)）。

1.3 主要實驗試劑與儀器 阿拉伯膠水溶液、NaHCO3溶液、水合氯醛溶液均購于北京雷根生物技術有限公司（批號分別為IH0262、CC0141、R00635）、PH精密試紙（H821220上海麥克林生化科技有限公司）、超聲機（F-010S 深圳福洋科技有限公司）、針灸針（0.25×25MM 蘇州針灸用品有限公司）、電子針療儀（SDZ-V型 蘇州醫(yī)療用品廠有限公司），乳脂球表皮生長因子-8（milk fat globule-epidermal growth factor-8，MFG-E8）酶聯(lián)免疫吸附測定（Elisa）試劑盒，購于江蘇菲亞生物科技有限公司（批號：2401R28）。

2 方法

2.1 動物分組及造模方法 選取50只大鼠于湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心實驗室內動物房飼養(yǎng)，溫度24℃～26℃，濕度40%～60%，配有獨立通風系統(tǒng)。動物運抵飼養(yǎng)房后，適應性喂養(yǎng) 7d后隨機分為空白組（10只）和模型組（40只），篩選出造模成功后的30只大鼠與空白組10只進行實驗，本研究最終采用實驗大鼠共40只，分為空白組、模型組、電針組、艾司唑侖組4組。造模方法^［15］：模型組大鼠每天上午8點腹腔注射PCPA（500 mg/kg·d，1 mL/100 g）混懸液，以制備失眠模型，每日1次，連續(xù)2 d。造模成功的大鼠表現(xiàn)為晝夜節(jié)律消失、白天活動增多、對聲響異常敏感、躁動、攻擊性及興奮性增加等行為^［16］，同時予以戊巴比妥鈉睡眠試驗再次驗證。

2.2 動物行為學觀察 觀察大鼠一般情況變化，包括晝夜節(jié)律、體質量變化、精神狀況、活動性、皮毛情況等。

2.3 戊巴比妥鈉睡眠試驗^［17］ 第1次腹腔注射 36h 后，正常組和造模組大鼠均腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg，1%濃度），當大鼠剛入睡時，將大鼠放墊塊上，腹部朝上，定義翻正反射消失持續(xù)1min為進入睡眠，翻正反射恢復為覺醒，記錄每只大鼠從給藥開始到翻正反射消失的時長作為睡眠潛伏期，從翻正反射消失到恢復的時間為睡眠持續(xù)時間，比較正常組和造模組在以上兩個指標的差異。

2.4 干預方法及取材 造模成功后稱重，第2 d開始干預，電針組刺激大鼠的神門、三陰交、百會、本神穴位，20 min/次；其中，百會、本神穴平刺，神門、三陰交直刺，針刺得氣后，電針儀連接同側神門、三陰交，共 2組，選用連續(xù)波、頻率為2Hz，電流強度以局部皮膚肌肉輕微顫動為度；艾司唑侖組（0.2 mg/kg）溶液灌胃，所有治療均1次/d，持續(xù)7d。模型組制備模型成功后正常喂養(yǎng)至取材，空白組不做治療。所有治療結束后，將大鼠稱重后麻醉，取腹主動脈血，室溫自然凝固10-20 min，3000 r/min離心10 min，收集上清液；取完腹主動脈血之后，斷頭取腦，參照大鼠大腦立體定位圖，剝離下丘腦結構，在生理鹽水中輕輕漂洗后，置于無菌凍存管中，血清和腦組織保存于-80°C冰箱。

2.5 酶聯(lián)免疫法檢測血清中MFG-E8 采用ELISA法測定血清中MFG-E8含量，取腹主動脈血上清液于EP管中，嚴格遵照試劑盒操作指南，在酶標儀上讀取450nm波長吸光度值并記錄。

2.6 Western blot法檢測下丘腦組織中MFG-E8蛋白表達 取下丘腦組織，冰上研磨，加入細胞裂解液，超聲組織破碎儀提取蛋白，10 min 后，12000r/min 離心 15min，取上清液，采用 Western blot 技術檢測MFG-E8表達情況。

2.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0和GraphPad Prism 9軟件分析處理數(shù)據(jù)及作圖，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進行統(tǒng)計處理，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 大鼠一般情況變化 空白組大鼠表現(xiàn)為正常晝夜活動模式，精神良好，毛發(fā)白皙且有光澤；與空白組對比，失眠模型組出現(xiàn)白天活動變多，易激惹，毛發(fā)發(fā)黃失去光澤，興奮性及攻擊性增強，同時體質量顯著降低；與失眠模型組比較，電針組和艾司唑侖組大鼠上述情況均得到不同程度改善，見表1。

造模前后，與空白組比較，其余各組大鼠體質量均不同程度下降（P<0.05），造模組間大鼠體質量變化差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；治療前后比較，各組大鼠體質量均有增長，與空白組比較，失眠模型組大鼠體質量增長較緩（P<0.05），與失眠模型組比較，電針組大鼠體質量明顯增長（P<0.05），艾司唑侖組大鼠體質量有所增長，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表2。

3.2 造模期各組大鼠睡眠實驗 戊巴比妥鈉睡眠實驗：與空白組對比，模型組大鼠睡眠潛伏期延長（P<0.01），睡眠持續(xù)時間縮短（P<0.05），見表3。結合大鼠一般情況及體質量變化，進一步驗證失眠模型造模成功。

3.3 電針對失眠大鼠血清MFG-E8的影響 與空白組對比，模型組大鼠血清MFG-E8水平顯著降低（P<0.05）；與模型組比較，電針、艾司唑侖組大鼠血清中MFG-E8水平升高（P<0.01）；與電針組比較，艾司唑侖組大鼠血清中MFG-E8水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表4、圖1。

3.4 電針對失眠大鼠下丘腦組織MFG-E8的影響 Western blot檢測結果顯示，與空白組比較，失眠模型組大鼠下丘腦中MFG-E8蛋白相對表達量顯著下降（P<0.01）；與失眠模型組大鼠比較，電針組與艾司唑侖組大鼠下丘腦中MFG-E8蛋白相對表達量均增高（P<0.01）；電針組與艾司唑侖組之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見圖2。

4 討論

失眠屬中醫(yī)之“不寐”，關鍵病機在于“陰陽失交”，針灸治療失眠療效顯著且安全性較高。《素問·陰陽離合論篇》中提到：“太陽為開，陽明為闔，少陽為樞”，“太陰為開，厥陰為闔，少陰為樞”^［18］，“樞”包含陰陽兩個方面，少陽樞機為陽樞，少陰樞機為陰樞，樞機功能失常，人體陰陽失和則出現(xiàn)失眠?；诖耍瑯修D陰陽之氣、調樞安神是治療失眠的關鍵，在臨床實踐上，名醫(yī)經驗^［14］及導師臨證經驗應用神門、三陰交、百會、本神等治療失眠療效顯著。在文獻報道中顯示，電針治療百會、神門、三陰交等穴可調節(jié)失眠患者炎癥因子及睡眠因子^［19-20］，能夠明顯改善失眠患者入睡困難、易醒、焦慮、抑郁等伴隨癥狀。

本次實驗顯示，空白組大鼠表現(xiàn)為正常晝夜活動模式，精神良好，毛發(fā)白皙且有光澤；失眠模型組出現(xiàn)白天活動變多，易激惹，毛發(fā)發(fā)黃失去光澤，興奮性及攻擊性增強，同時體質量顯著下降；戊巴比妥鈉睡眠實驗顯示，失眠模型組大鼠睡眠潛伏期延長，睡眠持續(xù)時間縮短，提示實驗大鼠經PCPA造模成功，出現(xiàn)明顯睡眠障礙。經電針及藥物干預后，大鼠的一般狀況明顯改善，體重穩(wěn)步增長，躁動減少，睡眠障礙得到明顯改善，表示以調樞安神為切入點，選取神門、三陰交、百會、本神進行電針刺激可明顯改善失眠。

失眠的病因復雜，其發(fā)病機制多涉及神經-內分泌-免疫系統(tǒng)。近年來越來越多研究者將睡眠與覺醒機制的研究放在小膠質細胞上，小膠質細胞作為中樞神經系統(tǒng)內固有免疫細胞，可參與免疫調節(jié)和信號轉導等來影響包括睡眠在內的生理結果和病理狀態(tài)。Wadhwa等^［21］研究發(fā)現(xiàn)48 h 的睡眠剝奪小鼠海馬內小膠質細胞特異性表達Iba-1增多，TNF-α、IL-6 和 IL-1β等炎癥因子的濃度顯著升高。白細胞介素（IL）和TNF-α的水平變化在睡眠調節(jié)中起重要作用^［22］；臨床研究顯示在失眠患者體內通常可檢測到水平明顯升高的炎性反應因子^［23］，隨著炎癥因子的堆積，非快速眼動（NREM）和快速眼動期（REM）睡眠均減少，可進一步導致失眠發(fā)生。由此可見，失眠的發(fā)生發(fā)展與小膠質細胞炎癥密切相關。同時，有研究顯示^［24］，艾司唑侖屬苯二氮·類藥物的一種，可參與到與氧化應激、神經炎癥相關的神經退行性疾病中。羅佳佳^［25］在應用加味酸棗仁湯對阿爾茨海默病大鼠學習記憶的影響及機制研究中，選取艾司唑侖作為西藥對照組，結果顯示艾司唑侖組同樣對大鼠腦區(qū)及血清中炎癥因子如IL-1β、TNF-α有下調作用。課題組前期研究同樣發(fā)現(xiàn)經電針與艾司唑侖藥物干預后的失眠模型大鼠，炎癥因子IL-6、TNF-α水平均有不同程度下降，實驗選用艾司唑侖作為藥物對照，揭示電針同艾司唑侖藥物比，兩者均對失眠具有明顯改善效應，其作用機制涉及神經-內分泌-免疫系統(tǒng)，由此可用來探究中樞神經系統(tǒng)小膠質細胞功能與炎性因子之間的關系。

根據(jù)分泌的細胞炎癥因子的不同，活化的小膠質細胞分為M1型和 M2型，M1型主要分泌一系列促炎因子，包括TNF-α、IL-6、IL-1β、一氧化氮合酶（iNOS）等，誘導白細胞遷移，推進炎癥進程；M2型主要分泌抗炎因子，如轉化生長因子-β（TGF-β）、精氨酸酶1（Arg1）和IL-10等，發(fā)揮促進神經再生修復、吞噬壞死組織碎片的重要作用^［26］。文獻報道，慢性睡眠剝奪會使小膠質細胞過度激活^［27］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在PCPA致失眠大鼠體內，小膠質細胞明顯活化，致炎因子IL-6、TNF-α表達顯著升高；結合本次研究顯示，失眠模型大鼠MFG-E8水平及蛋白相對表達量下降，提示處于失眠狀態(tài)的機體內保護性因子受到影響而減少，失眠大鼠體內致炎因子水平升高，激活的小膠質細胞以M1表型為主，小膠質細胞吞噬功能及機體抗炎癥能力下降。

MFG-E8具有多種生物學功能，可刺激巨噬細胞增強吞噬功能、有效清除凋亡細胞及碎片、避免毒性物質積累從而維持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)、對小膠質細胞功能進行調節(jié)等；有研究^［28］發(fā)現(xiàn)將重組 MFG-E8（rmMFG-E8）注入被氧糖剝奪后的小膠質細胞后，可逆轉細胞凋亡從而促進小膠質細胞向M2極化，起到抗炎作用并促進組織修復。同時，MFG-E8 作為調節(jié)小膠質細胞的重要信號分子，在調控小膠質細胞的吞噬功能中發(fā)揮重要作用，MFG-E8表達增強可顯著提升其吞噬速率^［29］。對于一些會持續(xù)激活小膠質細胞的中樞神經系統(tǒng)疾病，MFG-E8 可以平衡小膠質細胞極化過程，調節(jié)炎癥反應^［30］。本次研究顯示，與失眠模型組大鼠比較，電針組與艾司唑侖組大鼠血清及下丘腦區(qū)域中MFG-E8水平顯著升高，提示電針與艾司唑侖藥物可增加Mfk1dK9E74nwDI6jNgL470A==FG-E8水平，影響小膠質細胞功能從而降低炎癥水平，一方面驗證了小膠質細胞炎癥與失眠的緊密聯(lián)系，另一方面，這也是電針治療失眠的干預機制之一，通過調控小膠質細胞功能，逆轉小膠質細胞M1表型極化，減少致炎因子的釋放，從而減輕神經炎癥以改善失眠。邵敬芝等^［31］在體外實驗研究發(fā)現(xiàn)TNF-α和白細胞介素（IL）在小膠質細胞中的表達隨著 MFG-E8 的增加或減少而減少或增加，其整體結果趨勢與本次實驗大致一致。

綜上所述，電針對PCPA致失眠大鼠睡眠障礙具有改善作用，可上調MFG-E8表達，其可能機制與調控小膠質細胞極化功能，逆轉M1型極化相關，降低致炎因子水平，減輕神經炎癥，為針灸治療失眠尋找治療靶點提供了科學的實驗依據(jù)。但電針影響MFG-E8調控小膠質細胞極化及炎癥因子的具體通路尚未闡明，MFG-E8的更多生物學功能有待探aROLfHzteEQ3x3j57C2HIw==索，未來研究可利用MFG-E8 對小膠質細胞的調節(jié)作用，挖掘其在神經保護等方面的潛力，探尋MFG-E8 成為治療更多疾病的新靶點。

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（收稿日期：2024-06-26）