摘要：為尋找新的靶點(diǎn)以加速解決由于抗生素濫用而引發(fā)的細(xì)菌耐藥問(wèn)題，通過(guò)利用pCA24N表達(dá)載體構(gòu)建大腸桿菌BW25113過(guò)表達(dá)乙?；D(zhuǎn)移酶WcaB菌株，在對(duì)數(shù)期進(jìn)行氨基糖苷類抗生素殺傷效果測(cè)試，并進(jìn)一步測(cè)定大腸桿菌BW25113過(guò)表達(dá)WcaB對(duì)氨基糖苷類抗生素的最小抑菌濃度（MIC）和生長(zhǎng)曲線。結(jié)果表明：WcaB過(guò)表達(dá)后會(huì)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，氨基糖苷類抗生素對(duì)WcaB過(guò)表達(dá)株的MIC沒(méi)有明顯變化，WcaB過(guò)表達(dá)使細(xì)菌在慶大霉素或卡那霉素處理下的存活率降低，證明WcaB過(guò)表達(dá)提高了大腸桿菌對(duì)氨基糖苷類抗生素的敏感性。研究結(jié)果顯示乙?；D(zhuǎn)移酶在增強(qiáng)抗生素對(duì)大腸桿菌產(chǎn)敏感性方面具有重要的作用，該酶有望成為大腸桿菌新的藥理靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：乙酰基轉(zhuǎn)移酶；氨基糖苷類抗生素；大腸桿菌

中圖分類號(hào)：S859.796文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：0253-2301（2024）09-0023-07

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.09.005

Effect on the Sensitivity of Escherichia coli Overexpressing WcaB to Aminoglycoside Antibiotics

YU Dan-dan，ZHANG Yu-dan，WENG Li-hong，GAO Yuan-yuan*

（Fujian University KeyLaboratory of Cellular Stress Response and Metabolic Regulation，College of Life Science，F(xiàn)ujian Normal University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350108，China）

Abstract：In order to find the new targets to accelerate the solution of bacterial resistance problem caused by the antibiotic abuse，Escherichia coli BW25113 overexpressing acetyltransferase WcaB strain was constructed by using the pCA24N expression vector，and the killing effect of aminoglycoside antibiotics was tested in the logarithmic phase.Then，the minimum inhibitory concentration（MIC）and growth curve of Escherichia coli BW25113 overexpressing WcaB to aminoglycoside antibiotics were further determined.The results showed that：the overexpression of WcaB would inhibit the bacterial growth，and the MIC of aminoglycoside antibyAvbpagogOzYAuRSiMm5Qw==iotics to WcaB overexpressing strain did not change significantly.The overexpression of WcaB reduced the survival rate of bacteria treated with gentamicin or kanamycin，indicating that the overexpression of WcaB increased the sensitivity of Escherichia coli to aminoglycoside antibiotics.The results showed that acetyltransferase played an important role in enhancing the sensitivity of antibiotics to Escherichia coli，and the enzyme was expected to become a new pharmacological target for Escherichia coli.

Key words：Acetyltransferase;Aminoglycosideantibiotics;Escherichia coli

抗生素的廣泛使用會(huì)出現(xiàn)很多問(wèn)題，在畜牧業(yè)中使用抗生素不科學(xué)、用量過(guò)大等不規(guī)范操作會(huì)引起細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性1，甚至導(dǎo)致超級(jí)細(xì)菌產(chǎn)生2，也會(huì)誘導(dǎo)動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生抗生素抗性基因3，進(jìn)而使抗生素治療畜禽的效果不佳。自1940年以來(lái)，氨基糖苷類抗生素主要用于治療廣泛的細(xì)菌感染[4。細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類抗生素的耐藥機(jī)制主要是通過(guò)氨基糖苷類修飾酶的化學(xué)修飾5、核糖體修飾6、外排泵的作用7等方式逃逸抗生素的殺菌作用。

面對(duì)大腸桿菌對(duì)氨基糖苷類抗生素產(chǎn)生耐藥性的問(wèn)題，研究人員通過(guò)聯(lián)合使用抗菌藥物防治策略解決這一問(wèn)題，如氨基糖苷類藥物和β-內(nèi)酰胺類藥物之間的協(xié)同作用已經(jīng)被證實(shí)有效8;通過(guò)使用-些抗生素佐劑輔助抗生素殺菌，或是通過(guò)熱休克等方法增強(qiáng)慶大霉素的殺菌作用9-11。為了解決耐藥問(wèn)題，研究者著力于新藥開(kāi)發(fā)，但是新藥開(kāi)發(fā)需要的時(shí)間長(zhǎng)12]，因而，找到新的藥物作用靶點(diǎn)成為解決耐藥問(wèn)題的關(guān)鍵。在探索新藥物作用靶點(diǎn)的過(guò)程中，大多數(shù)靶標(biāo)是細(xì)胞基本功能所需的酶，新靶點(diǎn)還未用于抗生素治療，因此具有避免當(dāng)前耐藥機(jī)制的優(yōu)勢(shì)[13]。

WcaB是一種乙?；D(zhuǎn)移酶，在細(xì)胞外多糖可樂(lè)定（CA）的生物合成過(guò)程中催化糖鏈中半乳糖基殘基的乙?；痆14]。有研究者針對(duì)傷寒沙門(mén)氏菌，預(yù)測(cè)了乙酰基轉(zhuǎn)移酶WcaB可作為潛在的藥物靶點(diǎn)[15。乙?；D(zhuǎn)移酶在細(xì)胞代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但WcaB在大腸桿菌中的相關(guān)研究較少，在耐藥性方面的研究還未有被報(bào)道。因此，本試驗(yàn)擬探討乙?；D(zhuǎn)移酶WcaB對(duì)大腸桿菌氨基糖苷類抗生素的影響，以評(píng)估乙?；D(zhuǎn)移酶WcaB在氨基糖苷類抗生素環(huán)境中對(duì)細(xì)菌存活率的影響，有望為解決大腸桿菌耐藥問(wèn)題提供新的藥物靶點(diǎn)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)菌株本試驗(yàn)選用菌株為實(shí)驗(yàn)室保藏的大腸桿菌BW25113菌株，構(gòu)建的過(guò)表達(dá)菌株選用的質(zhì)粒為pCA24N表達(dá)載體。

1.1.2試驗(yàn)試劑慶大霉素儲(chǔ)液濃度為25mg mL1、卡那霉素儲(chǔ)液濃度50 mg·mL-1，以上兩種抗生素需要用無(wú)菌超純水配制后用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌。氯霉素濃度為35 mg·mL-1，用分析乙醇配制后用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌。

SDS-PAGE試驗(yàn)試劑：無(wú)菌超純水、30%丙烯酰胺、1.5 mol-L1Tris-HCl（pH 8.8）、0.5 mol-L-Tris-HC1（pH 6.8）、10%SDS溶液、10%APS、TEMD、6×loading buffer、考馬斯亮藍(lán)R-250快染液、固定液、洗脫液、1×SDS電泳緩沖液。

LB液體培養(yǎng)基（1L）：氯化鈉10 g，酵母粉5g，蛋白胨10 g;0.01 mol-L1PBS緩沖液（1 L）：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na?HPO?1.42 g，KH?PO?0.27 g;MHB培養(yǎng)基（1L）：24 g MHB混合粉末（由北京索萊寶科技有限公司提供）;LB固體培養(yǎng)基（1L）需在LB液體培養(yǎng)基中加入15g瓊脂后高溫高壓滅菌，在培養(yǎng)基溫?zé)釙r(shí)倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，待凝固后備用，以上液體培養(yǎng)基均經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌。

1.2試驗(yàn)主要儀器

超低溫冰箱（-80℃）、普通冰箱、超凈工作臺(tái)、恒溫振蕩搖床（37℃）、恒溫培養(yǎng)箱（37℃）、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、掃描儀、通風(fēng)櫥、SDS-PAGE電泳儀、凝膠成像儀、振蕩渦旋儀、加熱制冷型金屬浴連接儀、高速離心機(jī)、垂直搖床和水平搖床等。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1 BW25113-pCA24N（wcaB）過(guò)表達(dá)菌株的構(gòu)建質(zhì)粒pCA24N（wcaB）的獲取：在本實(shí)驗(yàn)室-80℃超低溫冰箱保藏的ASKA文庫(kù)中選取AG1-pCA24N（wcaB）菌株，劃線于含有氯霉素（35μg·mL1）抗性的固體平板上過(guò)夜培養(yǎng)，次日挑取單克隆于含有氯霉素（35μg·mL1）的新鮮液體LB培養(yǎng)基中，在恒溫震蕩搖床中過(guò)夜培養(yǎng)12～16 h，并同時(shí)用已合成的上下游引物pCA24N-F（5'-ATACGGATCCGGCCCTGA-3'）和pCA24N-R（5'-GCTGCAGGTCGACCCTTA-3'）進(jìn)行菌落PCR，將PCR獲得的產(chǎn)物用1%瓊脂凝膠電泳分離后觀察wcaB基因長(zhǎng)度是否正確，將PCR結(jié)果中長(zhǎng)度正確的菌株送往生物公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI上E.coli K-12菌株的wcaB基因進(jìn)行比對(duì)。挑取測(cè)序成功的單克隆菌株過(guò)夜培養(yǎng)后用EasyPure Plasmid MiniPrep Kit試劑盒提取質(zhì)粒，用制備好的野生型大腸桿菌BW25113感受態(tài)利用化學(xué)轉(zhuǎn)化法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

過(guò)表達(dá)菌株BW25113-pCA24N（wcaB）的構(gòu)建：野生型大腸桿菌BW25113感受態(tài)細(xì)胞中加入1μL質(zhì)粒pCA24N（wcaB）或者空質(zhì)粒pCA24N，混勻后在冰上靜置30 min，在預(yù)熱完全的42℃金屬浴中熱激90 s，再放置冰上靜置2 min，靜置后加入1 mL LB培養(yǎng)基于37℃恒溫振蕩搖床中復(fù)蘇細(xì)胞1 h。復(fù)蘇后的菌液涂布在含有氯霉素（35μg·mL1）抗性的固體平板上，過(guò)夜培養(yǎng)后挑取大腸桿菌BW25113中攜帶pCA24N（wcaB）的單克隆菌株，用引物pCA24N-F和pCA24N-R通過(guò)PCR將條帶長(zhǎng)度正確的菌株送往生物公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，挑取測(cè)序成功的單克隆過(guò)表達(dá)菌株過(guò)夜培養(yǎng)后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2考馬斯亮藍(lán)染色法驗(yàn)證WcaB表達(dá)情況將保藏的BW25113-pCA24N、BW25113-pCA24N（wcaB）菌株接種于新鮮液體LB培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)12～16 h至平臺(tái)期后，以1：100的接菌比例轉(zhuǎn)接至含有35μgmL1氯霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床中以220 rmin-1、37℃培養(yǎng)至OD?oo≈0.5后，加入終濃度為1 mmol-L?1IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，繼續(xù)在恒溫?fù)u床中培養(yǎng)0.5 h，使菌株養(yǎng)至OD?o?≈0.8。取用IPTG（1 mmol-L1）誘導(dǎo)后的菌液800μL于干凈的1.5 mL EP管中，用13000 r·min1離心2 min，徹底去除上清中的培養(yǎng)基，在通風(fēng)櫥中向菌體沉淀加入40μL的10%SDS溶液和40μL的6×loading buffer，用移液槍充分混合均勻，將初步制備的蛋白樣品放置于99.9℃的金屬浴上煮沸15 min。通過(guò)上述步驟將獲得的蛋白樣品用15%的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離蛋白質(zhì)，電泳液為1×SDS電泳緩沖液。待電泳結(jié)束后，將膠切下后用固定液固定蛋白質(zhì)1 h，而后將膠轉(zhuǎn)移至考馬斯亮藍(lán)R250染色1 h，最后用洗脫液將深藍(lán)色的蛋白膠洗至有清晰的蛋白質(zhì)條帶出現(xiàn)。

1.3.3 WcaB過(guò)表達(dá)菌株進(jìn)行抗生素敏感性測(cè)試將保藏的BW25113-pCA24N、BW25113-pCA24N（wcaB）菌株預(yù)先活化。將活化好的菌液1：100轉(zhuǎn)接至含35μg·mL1氯霉素抗性的新鮮液體LB培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床中以220 r·min-1、37℃培養(yǎng)至OD6o?～0.5時(shí)加入終濃度為1 mmol-L?1的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，繼續(xù)放置在恒溫?fù)u床中培養(yǎng)0.5 h，使菌株養(yǎng)至OD?o?≈0.8。取誘導(dǎo)后的菌液100μL于干凈的1.5mL EP管中，13000 r·min1離心2 min，去上清，加入等體積100μL的0.01 mol-L1PBS緩沖液重懸菌體，將其作為未處理組的對(duì)照樣品備用。另取1 mL誘導(dǎo)至OD?00≈0.8的菌液于無(wú)菌玻璃搖菌管中，分別加入慶大霉素（終濃度為5μg mL1）、卡那霉素（終濃度為10μg·mL1）處理，繼續(xù)置于搖床中培養(yǎng)，分別在0.5、1、1.5、2 h時(shí)取100μL處理過(guò)的樣品于EP管中，離心去上清，用等體積100μL的0.01 mol-L1PBS緩沖液重懸菌體，將其作為實(shí)驗(yàn)組試驗(yàn)樣品，將以上試驗(yàn)樣品用PBS緩沖液按照10倍濃度梯度稀釋法稀釋后進(jìn)行細(xì)胞存活率點(diǎn)板，平板在37℃恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)12 h，次日觀察細(xì)菌存活情況，根據(jù)菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率。取3次平行試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行顯著性分析。

1.3.4 WcaB過(guò)表達(dá)菌株最小抑菌濃度（MIC）測(cè)試將活化好的BW25113-pCA24N、BW25113-pCA24N（wcaB）菌株按1：100轉(zhuǎn)接至含氯霉素的液體MHB培養(yǎng)基中，置于搖床中培養(yǎng)至OD600～0.5時(shí)加入濃度為1 mmol-L1的IPTG，繼續(xù)放置于搖床中誘導(dǎo)至OD?00～0.8。將抗生素用2倍稀釋法在MHB培養(yǎng)基中稀釋成相應(yīng)濃度（0、0.5、1、2、4、8、16、32、64μgmL1），在無(wú)菌96孔板上按照濃度梯度順序每孔加入200μL抗生素稀釋液，將誘導(dǎo)后的菌液稀釋5倍后，每個(gè)孔中加入2μL稀釋后的菌液即每孔菌量約為10?～10?CFU·mL-1，37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h。取出96孔板，用槍頭輕輕吹打混勻菌液，在肉眼條件下對(duì)光觀察，清澄透光的孔對(duì)應(yīng)的最低抗生素濃度為該菌體外培養(yǎng)的最低抑菌濃度（MIC）。

1.3.5 WcaB過(guò)表達(dá)菌株的生長(zhǎng)曲線測(cè)定將活化好的BW25113-pCA24N（emp）、BW25113-pCA24N（wcaB）菌株按1：100轉(zhuǎn)接至含氯霉素的LB培養(yǎng)基中，置于搖床中連續(xù)培養(yǎng)10h，培養(yǎng)前期每隔1h取1 mL菌液在紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)（OD?00）中測(cè)量細(xì)菌密度，培養(yǎng)后期是2 h取一次樣品，每組樣品做3次生物學(xué)平行試驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1 WcaB過(guò)表達(dá)菌株的測(cè)序驗(yàn)證

由圖1可知，從ASKA庫(kù)中經(jīng)過(guò)菌落PCR驗(yàn)證過(guò)表達(dá)菌株的基因長(zhǎng)度正確。由圖2可知，構(gòu)建的WcaB過(guò)表達(dá)菌株中的目的片段wcaB基因測(cè)序結(jié)果與NCBI上大腸桿菌K-12菌株wcaB基因一致。由圖3可知，考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果顯示BW 25113-pCA24N（wcaB）能夠表達(dá)目的蛋白WcaB。綜上結(jié)果表明WcaB過(guò)表達(dá)菌株可以成功表達(dá)。

2.2大腸桿菌過(guò)表達(dá)WcaB對(duì)氨基糖苷類抗生素的殺傷效果測(cè)試

2.2.1慶大霉素處理下BW25113-pCA24N（emp）、BW25113-pCA24N（wcaB）表型結(jié)果由圖4可知，BW25113-pCA24N（emp）、BW25113-pCA24N（wcaB）經(jīng)濃度為5μg·mL1的慶大霉素處理0、0.5、1、1.5、2 h后細(xì)胞存活數(shù)的情況。結(jié)果顯示：在沒(méi)有慶大霉素處理情況下，WcaB過(guò)表達(dá)株的細(xì)胞存活數(shù)與BW25113-pCA24N空質(zhì)粒株的生長(zhǎng)情況是沒(méi)有差異的。然而，經(jīng)過(guò)5μg·mL1的慶大霉素處理0.5 h后，WcaB過(guò)表達(dá)株細(xì)胞存活數(shù)少，與空質(zhì)粒株相比有4個(gè)數(shù)量級(jí)的顯著差異；處理1 h后，WcaB過(guò)表達(dá)株的細(xì)胞存活數(shù)較0.5h處理時(shí)又少了十倍，其細(xì)胞存活數(shù)比空質(zhì)粒株少5個(gè)數(shù)量級(jí)；而處理1.5h和2 h后，WcaB過(guò)表達(dá)株的細(xì)胞存活數(shù)比空質(zhì)粒株少3個(gè)數(shù)量級(jí)。這些結(jié)果證明，過(guò)表達(dá)WcaB可以顯著增強(qiáng)大腸桿菌對(duì)慶大霉素的敏感性。

2.2.2卡那霉素處理下BW25113-pCA24N（emp）、BW25113-pCA24N（wcaB）表型結(jié)果由圖5可知，BW25113-pCA24N（emp）、BW25113-pCA24N（wcaB）經(jīng)濃度為10μg mL?1的卡那霉素處理0、0.5、1、1.5、2 h后細(xì)胞存活數(shù)的情況。結(jié)果顯示：在沒(méi)有卡那霉素的處理?xiàng)l件下，WcaB過(guò)表達(dá)株的細(xì)胞存活數(shù)與BW25113-pCA24N空質(zhì)粒株的生長(zhǎng)情況是沒(méi)有差異。在10μg·mL1的卡那霉素處理0.5h后，WcaB過(guò)表達(dá)株的細(xì)胞存活數(shù)與空質(zhì)粒株相比有3個(gè)數(shù)量級(jí)的差異；處理1 h和1.5 h后，WcaB過(guò)表達(dá)株的細(xì)胞存活數(shù)較少，比空質(zhì)粒株少5個(gè)數(shù)量級(jí)；而處理2 h后，WcaB過(guò)表達(dá)株的細(xì)胞存活數(shù)比空質(zhì)粒株少4個(gè)數(shù)量級(jí)。這些結(jié)果證明，過(guò)表達(dá)WcaB可以明顯增強(qiáng)大腸桿菌對(duì)卡那霉素的敏感性。

2.3 WcaB過(guò)表達(dá)菌株MIC（最小抑菌濃度）的測(cè)定

由圖6可知，在慶大霉素處理?xiàng)l件下BW25113-pCA24N（emp）的MIC為1μgmL1，BW25113-pCA24N（wcaB）的MIC為0.5μg·mL-1，表明WcaB過(guò)表達(dá)菌株增強(qiáng)了大腸桿菌對(duì)慶大霉素的敏感性。在卡那霉素處理?xiàng)l件下BW25113-pCA24N、BW-25113-pCA24N（wcaB）的MIC都為2μgmL1，表明WcaB過(guò)表達(dá)菌株增強(qiáng)了大腸桿菌對(duì)卡那霉素的敏感性。

2.4 WcaB過(guò)表達(dá)菌株的生長(zhǎng)曲線測(cè)定

由圖7可知，WcaB過(guò)表達(dá)株在生長(zhǎng)了4h后基本停止生長(zhǎng)，而空質(zhì)粒株在生長(zhǎng)6h后才基本進(jìn)入平臺(tái)期。結(jié)果表明，WcaB過(guò)表達(dá)后會(huì)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，這可能導(dǎo)致了WcaB過(guò)表達(dá)株對(duì)慶大霉素更敏感。

3討論與結(jié)論

自抗生素被研究者發(fā)現(xiàn)至今，抗生素在治療人類疾病或畜禽生物疾病中都占據(jù)了重要地位。而在過(guò)去的幾十年里，世界各地的牲畜飼料中都添加了抗生素以預(yù)防疾病，為了避免抗微生物藥物耐藥性在農(nóng)業(yè)場(chǎng)所內(nèi)或通過(guò)動(dòng)植物源性食品向人類傳播[16，因此盡早找到新的藥物靶點(diǎn)是目前研究方向的重點(diǎn)之一。

本研究通過(guò)抗生素敏感性測(cè)試發(fā)現(xiàn)WcaB過(guò)表達(dá)后能提高大腸桿菌對(duì)氨基糖苷類抗生素的敏感性，通過(guò)MIC實(shí)驗(yàn)測(cè)定了WcaB過(guò)表達(dá)后MIC并未升高，反而對(duì)慶大霉素的MIC與對(duì)照組相比有下降，表明WcaB過(guò)表達(dá)菌株增強(qiáng)了大腸桿菌對(duì)慶大霉素的敏感性；通過(guò)生長(zhǎng)曲線測(cè)定發(fā)現(xiàn)WcaB過(guò)表達(dá)后會(huì)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，表明WcaB過(guò)表達(dá)株可能通過(guò)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)進(jìn)而提高大腸桿菌對(duì)氨基糖類抗生素的敏感性。有研究發(fā)現(xiàn)在37℃富含氧氣的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，wcaB基因不表達(dá)[17，這表明在自然環(huán)境下，WcaB不表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致大腸桿菌對(duì)氨基糖苷類抗生素在較短時(shí)間內(nèi)沒(méi)有顯著的殺菌效果。大腸桿菌過(guò)表達(dá)基因在解決抗生素耐藥方面也有相關(guān)研究，如PurB過(guò)表達(dá)能增強(qiáng)大腸桿菌對(duì)氨基糖苷類抗生素的耐受性18，外膜蛋白o(hù)mpC過(guò)表達(dá)會(huì)提高大腸桿菌對(duì)慶大霉素的敏感性[191，這些研究的新發(fā)現(xiàn)都有望成為解決抗生素耐藥的新靶點(diǎn)。結(jié)合本試驗(yàn)研究結(jié)果，認(rèn)為WcaB可以作為藥物靶點(diǎn)之一去激活其表達(dá)后輔助抗生素殺菌，進(jìn)而減少大腸桿菌對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥，但其是如何提高大腸桿菌對(duì)氨基糖苷類抗生素敏感性的機(jī)制需要下一步的深入研究。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）