摘要：尋找高效的抗生素佐劑并研究其增效殺菌機(jī)制是目前應(yīng)對(duì)細(xì)菌耐藥問(wèn)題的有效策略之一。為探究D-海藻糖（D-trehalose）增強(qiáng)氨基糖苷類(lèi)抗生素殺滅大腸桿菌的機(jī)制，以大腸桿菌BW25113為研究對(duì)象，測(cè)定D-trehalose聯(lián)合氨基糖苷類(lèi)抗生素作用前后的ATP、NADH含量以及質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)（PMF），分析菌體內(nèi)能量代謝和膜電位水平的變化，并通過(guò)抑菌圈實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)抗生素?cái)z取的影響。結(jié)果提示：D-trehalose聯(lián)合妥布霉素或慶大霉素雙處理后，D-trehalose能夠通過(guò)升高大腸桿菌PMF水平增加ATP合成，提高NADH水平，促進(jìn)抗生素?cái)z取，由此顯著增強(qiáng)抗生素的殺菌效果。研究結(jié)果為開(kāi)發(fā)D-海藻糖作為新型氨基糖苷類(lèi)抗生素佐劑提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌；D-海藻糖；妥布霉素；慶大霉素；質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)

中圖分類(lèi)號(hào)：S859.796文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：0253-2301（2024）09-0036-08

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.09.007

Study on the Mechanism ofD-trehalose Enhancing the Killing of Escherichia coli by Aminoglycoside Antibiotics

HUANG Wei-ya，ZHONG Jie-ya，LAI Ze-ying，CHEN Hui-jun，ZHAO Hang-yu，CHEN Ya-juan*

（Fujian University Key Laboratory of Cellular Stress Response and Metabolic Regulation/College of Life Science，F(xiàn)ujian Normal University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350108，China）

Abstract：Finding the efficient antibiotic adjuvants and studying their synergistic bactericidal mechanism is one of the effective strategies to deal with the problem of bacterial resistance.In order to explore the mechanism of D-trehalose enhancing the killing effect of Escherichia coli by the aminoglycoside antibiotics，by taking Escherichia coli BW25113 as the research object，the contents of ATP，NADH and proton motive force（PMF）were measured before and after the treatment of D-trehalose combined with the aminoglycoside antibiotics.The changes of energy metabolism and membrane potential in bacteria were analyzed，and the effect on the uptake of antibiotics was detected by using the inhibition zone experiment.The results showed that：after the double treatment with D-trehalose combined with tobramycin or gentamycin，D-trehalose could increase the synthesis of ATP，increase the level of NADH，and promote the uptake of antibiotics by increasing the PMF level of Escherichia coli，thus significantly enhancing the bactericidal effect of antibiotics.The results of this study provided a basis for the development of D-trehalose as a new-type aminoglycoside antibiotic adjuvant.

Key words：Escherichiacoli;D-trehalose;Tobramycin;Gentamycin;Proton motive force

自20世紀(jì)中葉首次發(fā)現(xiàn)抗生素可以作為飼料添加劑促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，畜牧養(yǎng)殖業(yè)開(kāi)啟了使用抗生素的時(shí)代。隨著抗生素在飼料及獸藥領(lǐng)域等方面的不當(dāng)使用以及濫用，抗生素耐藥性的產(chǎn)業(yè)減弱了原有抗生素的功效，耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)使得感染性疾病的治療變得困難2]。研究人員便提出尋找一些抗生素佐劑以提高傳統(tǒng)抗生素療效，如通過(guò)增加細(xì)菌對(duì)藥物攝取的方法來(lái)應(yīng)對(duì)細(xì)菌耐藥性3]。本課題組前期通過(guò)外源添加D-海藻糖（D-trehalose）與三大類(lèi)殺菌抗生素（氨基糖苷類(lèi)抗生素、氟喹諾酮類(lèi)抗生素及β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素）對(duì)大腸桿菌BW25113和金黃色葡萄球菌ATCC25923進(jìn)行殺滅測(cè)試4結(jié)果發(fā)現(xiàn)其協(xié)同氨基糖苷類(lèi)抗生素具有較好的殺菌效果，并且在不同的培養(yǎng)條件殺菌效果均顯著，是一種潛在的有效抗生素佐劑5。因此，本研究進(jìn)一步測(cè)試D-trehalose協(xié)同氨基糖苷類(lèi)抗生素殺滅臨床分離的耐藥大腸桿菌的殺菌效果，評(píng)估其作為有效抗生素佐劑在臨床治療中的潛在應(yīng)用價(jià)值。并且，為解析D-trehalose增效氨基糖苷類(lèi)抗生素的殺菌機(jī)制，對(duì)菌體內(nèi)能量代謝和膜電位變化情況，包括質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)（PMF）變化水平以及ATP、NADH含量進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)探究D-trehalose是否通過(guò)促進(jìn)細(xì)菌胞內(nèi)抗生素?cái)z取增強(qiáng)殺菌效果。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

8株臨床耐藥大腸桿菌株來(lái)自福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，試驗(yàn)菌株為大腸桿菌BW25113。

1.2儀器與試劑

1.2.1主要儀器37℃恒溫培養(yǎng)箱、光吸收全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀、37℃恒溫震蕩培養(yǎng)器。

1.2.2主要試劑ATP檢測(cè)試劑盒S0026、增強(qiáng)NAD/NADH檢測(cè)試劑盒（WST-8法），3，3'-二乙基氧雜羰花青碘（DiOC?（3））、妥布霉素（Tobramycin，Tob）、慶大霉素（Gentamycin，Genta）、羰基氰化物間氯苯腙（CCCP）。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1 D-trehalose協(xié)同Tob殺滅臨床耐藥大腸桿菌的處理方法使用LB液體培養(yǎng)基過(guò)夜活化8株臨床耐藥大腸桿菌，1：500轉(zhuǎn)接至新鮮LB中培養(yǎng)24 h。取9支試管，各加入500μL菌液，編號(hào)1～9，1～3號(hào)試管為空白對(duì)照組（未處理）;4～6號(hào)試管加入終濃度為50μg mL1Tob（Tob單處理），7～9號(hào)試管加入終濃度為50μgmL1Tob以及30 mmol-L-1的D-trehalose（Tob+D-trehalose雙處理），處理3h后，取經(jīng)不同試驗(yàn)條件處理的50μL平臺(tái)期的菌液用PBS洗滌2遍后重懸。隨后將菌懸液用PBS緩沖液依次進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)?μL稀釋完的菌液滴于固體LB平板上。自然風(fēng)干后于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，計(jì)算菌落數(shù)。8株臨床耐藥大腸桿菌具體耐藥信息列于表1。

1.3.2菌株活化、處理及洗滌方法將存于-80℃的菌株大腸桿菌BW25113于37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜活化。以1：500的比例接種于20 mL新鮮的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h達(dá)到平臺(tái)期，所選用的氨基糖苷類(lèi)抗生素為T(mén)ob、Genta。

取6根試管分別加入500μL平臺(tái)期大腸桿菌，1號(hào)管為空白對(duì)照組（未處理），2號(hào)管加入終濃度為30 mmol-L1的D-trehalose（D-trehalose單處理），3號(hào)管加入終濃度為50μg·mL1Tob（Tob單處理），4號(hào)管加入終濃度為50μg·mL1Tob和30 mmol-L?1的D-trehalose（Tob+D-trehalose雙處理），5號(hào)管加入終濃度為30μg·mL1Genta（Genta單處理），6號(hào)管加入30μg mL-1Genta和30mmol-L1的D-trehalose（Genta+D-trehalose雙處理）。分別處理1.5 h后，用PBS洗滌2遍離心去上清后重懸。

（1）大腸桿菌胞內(nèi)質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)水平測(cè)定按照1.3.2的方法制作平臺(tái)期大腸桿菌不同處理下的菌液，取100μL處理后的菌液加1 mL PBS，加入終濃度為30μmol-L1的熒光染料DiOC?（3），37℃下孵育30min后，流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。DiOC?（3）探針會(huì)在細(xì)菌體內(nèi)發(fā)生綠色熒光，膜電位的升高使得探針?lè)肿影l(fā)生自聚，其熒光便往紅色波段遷移，Ex/Em：482/497nmol-L1。若Red/Green（R/G）比值升高，則說(shuō)明質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)水平增加。

（2）大腸桿菌胞內(nèi)ATP水平測(cè)定按照1.3.2的方法制作平臺(tái)期大腸桿菌不同處理下的菌液，各加入100μL裂解液吹打混勻，于10000 r·min-1、4℃離心5min，取上清與檢測(cè)試劑混合后使用酶標(biāo)儀化學(xué)發(fā)光Luminescence（RLU）檢測(cè)其熒光值，熒光值越大，則ATP含量越多。同時(shí)按照0、0.1、1、5、10μmoL·L1ATP濃度梯度制備ATP標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，將樣品得出的熒光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中得出ATP含量。

（3）大腸桿菌胞內(nèi)NADH含量測(cè)定按照1.3.2的方法制作平臺(tái)期大腸桿菌不同處理下的菌液，加入200μL預(yù)冷的增強(qiáng)型NAD'/NADH提取液。于12 000 r·min-1，4℃離心8 min，取上清與乙醇脫氫酶工作液混合在酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)試其吸光度，同時(shí)制備不同濃度的NADH標(biāo)準(zhǔn)品用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，將樣品測(cè)得的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)后得出NAD*、NADH的含量。

1.3.3細(xì)菌對(duì)妥布霉素的攝取試驗(yàn)將培養(yǎng)至平臺(tái)期的大腸桿菌經(jīng)過(guò)不同Tob濃度（50、100、200μg mL1）與D-trehalose（30 mmol-L1）共同處理3h后離心去上清，用PBS洗滌2遍后加入2mg mL1溶菌酶充分裂解4 h，液氮凍融兩次，90℃加熱10 min，使細(xì)菌細(xì)胞完全裂解釋放攝入的抗生素，離心得到上清作為樣品備用。同時(shí)制備標(biāo)準(zhǔn)品，將未處理的菌液經(jīng)溶菌酶吹打混勻后加入終濃度為0、20、40、60、80、100μgmL-1的Tob，于37℃下充分裂解4 h后，液氮反復(fù)凍融兩次，90℃加熱10 min，離心得到上清作為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品。

制備含有BW25113菌株的方型培養(yǎng)皿，按照順序?qū)⑸锨妩c(diǎn)涂到方板上，與對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品相比，若攝入抗生素濃度越多，則點(diǎn)涂的位置抑菌圈越大，細(xì)菌不生長(zhǎng)的區(qū)域則越大。測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)品的抑菌圈直徑為橫坐標(biāo)，Tob濃度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。代入樣品的抑菌圈直徑，最后計(jì)算得出樣品中攝取的抗生素含量。

2結(jié)果與分析

2.1 D-trehalose協(xié)同Tob殺滅臨床耐藥大腸桿菌的效果分析

由圖1可知，Tob單處理組在殺滅8株耐藥大腸桿菌的效果上與未處理組相比無(wú)顯著差異。而Tob+D-trehalose雙處理組的殺菌效果與Tob單處理組相比顯著增強(qiáng)。其中，與Tob單處理相比，210215789、210305622、210117294、210117528這4株臨床大腸桿菌在D-trehalose+Tob雙處理下增強(qiáng)了4個(gè)數(shù)量級(jí)的殺菌效果，而210215749、210829790、210305607、210829776這4株增強(qiáng)了約3個(gè)數(shù)量級(jí)的殺菌效果。結(jié)果表明，D-trehalose能夠顯著增強(qiáng)Tob殺滅臨床耐藥大腸桿菌。

2.2大腸桿菌胞內(nèi)質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)變化情況

由圖2A可知，未處理組其R/G比值為0.68，在加入了D-trehalose后其R/G比值增加為1.26，說(shuō)明D-trehalose單處理下的大腸桿菌PMF顯著高于未處理組。

由圖2B和圖2C可知，Tob單處理下R/G比值為1.207，而Tob+D-trehalose雙處理后R/G值為1.444。Genta單處理時(shí)R/G值為1.295，加入了D-trehalose后其R/G值為1.747。

以上結(jié)果證實(shí)，外源添加D-trehalose促進(jìn)了大腸桿菌PMF的升高，從而提高了大腸桿菌對(duì)抗生素的攝取，增強(qiáng)了抗生素的殺菌效果。

2.3大腸桿菌胞內(nèi)ATP含量測(cè)定結(jié)果

由圖3B可知，與未處理組相比，外源添加D-trehalose后大腸桿菌產(chǎn)生ATP的含量顯著增加。而與Tob與Genta單處理組相比，D-trehalose聯(lián)合抗生素的雙處理組中大腸桿菌產(chǎn)生的ATP含量顯著升高，說(shuō)明外源添加D-trehalose可以顯著提高細(xì)菌的新陳代謝水平，從而提高抗生素的殺菌效率。

2.4大腸桿菌胞內(nèi)NADH含量測(cè)定結(jié)果

由圖4B可知，D-trehalose處理的細(xì)菌中NAD的濃度高于未處理組，Tob/Genta單處理組的NAD+含量低于未處理組，并且在添加了D-Trehalose后顯著上升。

由圖4C可知，D-trehalose處理的細(xì)菌中NADH的濃度高于未處理組，Tob/Genta單處理組的NADH含量低于未處理組，同樣在添加了D-trehalose后顯著上升。

由圖4D可知，D-trehalose處理組的NAD/NADH比值低于未處理組，Tob/Genta+D-trehalose雙處理組NAD/NADH含量低于Tob/Genta單處理組，說(shuō)明在D-trehalose作用下大腸桿菌產(chǎn)生NADH的濃度顯著大于NAD*，增強(qiáng)了細(xì)菌代謝活性，激活電子傳遞鏈，從而提高了抗生素殺菌效率。

2.5細(xì)菌對(duì)妥布霉素的攝取

由圖5A可知，D-trehalose協(xié)同Tob處理下的殺菌效果顯著高于Tob單處理組。由圖5B可知，在D-trehalose濃度不變的情況下，隨著Tob濃度增大，Tob+D-trehalose處理后的大腸桿菌體內(nèi)抗生素含量高于Tob單處理組，證明D-trehalose增加了大腸桿菌對(duì)Tob的攝取，并且效果顯著。由圖5C可知，較為顯著的抑菌圈200μg·mL1Tob處理下，抗生素進(jìn)入胞內(nèi)含量為20 ug mL1，而加入D-trehalose后Tob攝取量為40μg mL-1。由此可見(jiàn)，外源添加D-trehalose確實(shí)可以增強(qiáng)大腸桿菌對(duì)抗生素的攝取，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。

3討論

細(xì)菌耐藥性正成為全球公共衛(wèi)生和人類(lèi)健康面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，其影響波及農(nóng)業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和畜牧業(yè)等多個(gè)關(guān)鍵領(lǐng)域。深入理解細(xì)菌對(duì)抗生素的應(yīng)對(duì)機(jī)制?-101，對(duì)于開(kāi)發(fā)有效策略以殺滅耐藥菌株至關(guān)重要，而人體所需的代謝物作為抗生素佐劑在中樞代謝中發(fā)揮了重要作用。某些代謝物如葡萄糖、果糖12]、甘露醇13或丙酮酸14等，能夠促進(jìn)細(xì)菌糖酵解、增加NADH生成、激活電子傳遞鏈（electron transport chain，ETC）并提高細(xì)胞膜的質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)，從而促進(jìn)氨基糖苷類(lèi)抗生素如慶大霉素的攝取，增強(qiáng)其殺菌效果15。物理手段如熱休克16以及低離子休克17，通過(guò)依賴(lài)PMF的變化和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的聚集，也能增強(qiáng)氨基糖苷類(lèi)抗生素的攝取，進(jìn)而殺滅細(xì)菌。這些抗生素佐劑的發(fā)現(xiàn)及代謝機(jī)理研究，大大增加了抗生素的作用，減少耐藥性的產(chǎn)生，為新的抗生素的發(fā)現(xiàn)提供了一種替代和補(bǔ)充的策略。

本研究通過(guò)外源添加代謝物D-trehalose，發(fā)現(xiàn)其顯著增加了Tob對(duì)臨床分離耐藥大腸桿菌的殺傷效果。此外，D-trehalose促進(jìn)大腸桿菌PMF水平升高，增加ATP及NADH的產(chǎn)生并增強(qiáng)細(xì)菌代謝活性，激活電子傳遞鏈，從而提高細(xì)胞內(nèi)抗生素濃度并有效殺死細(xì)菌。這些結(jié)果不僅為D-trehalose作為一種安全高效的抗生素佐劑的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)，也為臨床應(yīng)對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素耐藥性問(wèn)題提供了新的視角。盡管如此，D-trehalose在體內(nèi)的實(shí)際效果，特別是在小鼠模型中的聯(lián)合作用，仍需進(jìn)一步的研究來(lái)驗(yàn)證[18]。未來(lái)的工作將集中于評(píng)估D-trehalose在不同生物體內(nèi)的效果，以及其與其他抗生素聯(lián)合使用的潛力，為抵抗耐藥細(xì)菌提供新思路。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）