摘要：【目的】發(fā)掘我國重要資源植物黑老虎（Kadsura coccinea）的葉綠體基因組高變異區(qū)域及SSR變異位點，為其遺傳多樣性及種質(zhì)資源評估奠定基礎?！痉椒ā揩@取5個黑老虎個體的葉綠體基因組，通過基因注釋，采用生物信息學方法開展核苷酸多態(tài)性、簡單重復序列（simple sequarce repeat，SSR）分析，并以2個五味子屬植物為外類群分析南五味子屬的系統(tǒng)發(fā)育關系?！窘Y果】黑老虎完整葉綠體基因組為典型的四分體環(huán)狀結構，長度為145 413～145 903 bp。其中，大單拷貝區(qū)的長度范圍為94 457～94 757 bp，小單拷貝區(qū)的長度為18 032～18 047 bp，重復區(qū)為16 431～16 552 bp。黑老虎葉綠體基因組編碼125個基因，蛋白編碼基因、tRNA基因、rRNA基因分別為82、35、8個；總G（鳥嘌呤）和C（胞嘧啶）的堿基數(shù)占總堿基數(shù)的比例（GC占比）為39.7%。采用滑動窗口法分析發(fā)現(xiàn)黑老虎葉綠體基因組上petN-psbM和trnS-GCU-trnG-UCC具有很高的核苷酸多態(tài)性（Pi gt; 0.03）。該物種葉綠體基因組上共有212個SSR位點，其中24個SSR位點在5個黑老虎個體間存在多態(tài)變異，具有應用前景。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，此次研究中黑老虎個體聚成一支，與同屬其他物種關系較遠?！窘Y論】本研究首次系統(tǒng)比較了多個黑老虎個體的葉綠體基因組，發(fā)掘出基因組內(nèi)的高變異區(qū)域及變異SSR位點，為其遺傳多樣性及種質(zhì)資源評估奠定了基礎。

關鍵詞：黑老虎；質(zhì)體基因組；遺傳多樣性；SSR位點；系統(tǒng)發(fā)育

中圖分類號：S718；Q754"""" 文獻標志碼：A開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

文章編號：1000-2006（2024）06-0071-08

Comparative chloroplast genomics of the important resource plant Kadsura coccinea

ZHAI Xuechang1， PENG Li1， YAN Haifei2*， ZHU Kefan3， ZHANG Shuyan2，4， ZHANG Caiyun5， LU Xiankai2

（1. Jiangxi Environmental Engineering Vocational College， Ganzhou 341000， China; 2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Applied Botany， South China Botanical Garden， Chinese Academy of Sciences， Guangzhou 510650， China;3. Xinfeng County Seed Farm of Jiangxi Province， Ganzhou 341624， China; 4. College of Life Sciences， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China; 5. Guangdong Food and Drug Vocational College， Guangzhou 510520， China）

Abstract： 【Objective】This study aims to investigate the chloroplast genomes and SSR loci of Kadsura coccinea， an important plant resource in China， to establish a basis for assessing its genetic diversity and germplasm resources. 【Method】The study"" obtained and analyzed the chloroplast genomes of five individuals of K. coccinea through genetical annotation， nucleotide polymorphism analysis， and SSR analysis using bioinformatics methods. Additionally， the phylogenetic"" analysis of Kadsura were reconstructed using two Schisandra spp. as outgroups. 【Result】The chloroplast genome of K. coccinea showed a typical quadripartite structure， with genome lengths ranging from 145 413 to 145 903 base pairs （bp）. The large single-copy region （LSC） spaned from 94 457 to 94 757 bp， while the small single-copy region （SSC） encompassed 18 032 to 18 047 bp." It encodes a total of 125 genes， including 82 protein-coding genes， 35 tRNA genes， and 8 rRNA genes. The genome had a total GC content of 39.7% and demonstrated substantial nucleotide polymorphisms （Pi gt; 0.03） in the intergenic regions of petN-psbM and trnS-GCU-trnG-UCC. A total of 212 single sequence repeat （SSR） loci were identified across the chloroplast genomes of this species. Mononucleotide repeats were the most prevalent， followed by trinucleotide repeats， and pentanucleotide repeats were the least frequent. Among these loci， 24 polymorphic SSR loci were found among five individuals of K. coccinea， indicating their potential utility in future. Phylogenetic analysis robustly clusters K. coccinea individuals into a distinct group， revealing no close relationship with other congeneric species. 【Conclusion】This study presents the first systematic comparison of chloroplast genomes among multiple K. coccinea individuals. Our findings identified highly variable regions and SSR loci that can be valuable for evaluating the genetic diversity and germplasm resource of this species.

Keywords：Kadsura coccinea; plastid genome; genetic diversity; SSR loci; phylogeny

黑老虎（Kadsura coccinea）隸屬于五味子科（Schisandraceae）南五味子屬（Kadsura）[1]，主要分布于我國長江以南，以及印度尼西亞、緬甸、越南、老撾和泰國等國家；生長于海拔400～1 900 m的山地疏林中[1-2]，具有藥用、食用、觀賞等多種價值，是重要的資源植物[3-5]，其果實富含多種氨基酸及微量元素，極具開發(fā)價值[6]。盡管黑老虎具有重要的應用價值和開發(fā)前景，但其種質(zhì)資源方面的研究仍較薄弱[7-8]。近年來，我國有關黑老虎的遺傳多樣性研究取得了一些進展。例如，鄒建文等[9]通過高通量測序開發(fā)了黑老虎的28對簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）引物，并使用其中的17個SSR位點分析了湖南省內(nèi)的11個黑老虎群體，發(fā)現(xiàn)了該物種群體內(nèi)遺傳變異小但群體間分化較大的特點，并建議對其加強就地和遷地保護[10]。Dong等[11]利用RAD-Seq對5個南五味子屬的107個個體進行了分析，發(fā)現(xiàn)黑老虎與其他近緣種間具有較明顯的遺傳分化，且與其他種間無基因流?？傊瑢诶匣⒌姆N質(zhì)及遺傳資源研究還不充分，不利于后續(xù)的資源保護及應用開發(fā)。

葉綠體基因組作為植物細胞內(nèi)三大基因組之一，具有高拷貝數(shù)、保守的基因組結構和基因數(shù)量、基本上不發(fā)生基因重組、具適中的核苷酸替換率等特點，是研究植物遺傳多樣性及系統(tǒng)發(fā)育的重要材料[12-13]。高通量測序技術及生物信息工具的快速發(fā)展和迭代更新，促進植物葉綠體基因組的發(fā)表量快速增加[14]。雖然黑老虎的葉綠體基因組已有報道[15-18]，但該物種在我國的分布區(qū)較廣，對其葉綠體基因組的變異范圍尚缺乏深入認識。此外，葉綠體基因組在絕大多數(shù)情況下都是母系遺傳，通過黑老虎葉綠體基因組的變異研究有望還原出黑老虎的種子流（種子遷移）過程，為今后該植物的種源鑒定提供依據(jù)。因此，本研究新獲取江西地區(qū)兩個黑老虎個體的葉綠體基因組，并與已發(fā)表的葉綠體基因組進行比較，以期找出我國黑老虎葉綠體基因組的高變異區(qū)域及SSR變異位點，為其后續(xù)的遺傳多樣性及種質(zhì)資源評估提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料采集、DNA提取和測序

供試用黑老虎采自江西省贛州市信豐縣崇仙鄉(xiāng)吐前（121°53′09″E，41°44′46″N），海拔267 m。為評估該地區(qū)的黑老虎群體內(nèi)是否存在葉綠體基因組遺傳變異，研究采集了兩個黑老虎個體。每個個體采集1片幼嫩葉片，經(jīng)蒸餾水清洗擦干后用變色硅膠干燥保藏，其憑證標本保存于中國科學院華南植物園標本館。使用CTAB法（cyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化銨法）[19]提取干燥葉片總DNA。使用Qubit熒光計和凝膠電泳評估總DNA的含量、純度及完整性。獲取的高質(zhì)量DNA交由深圳華大基因股份有限公司（武漢）開展基因組淺層測序（每個樣品獲得約2 Gbp的數(shù)據(jù)）。

此外，從GenBank下載6個南五味子屬物種的葉綠體基因組序列。其中，2個為已發(fā)表的黑老虎葉綠體基因組（來自福建的個體MN480469[18]和廣西的個體MT934443[17]）及來自云南的中泰南五味子（K. ananosma，NC_057265[16]）。另外3個為南五味子屬其他物種[異形南五味子（K. heteroclita），NC_057266[20]，NC_050348[21]；南五味子（K. longipedunculata），MW801021[22]]。從GenBank下載了華中五味子（Schisandra sphenanthera）和五味子（S. chinensis）的葉綠體基因組序列（GenBank序號分別為MK193856[23]和NC_034908[24]）作為系統(tǒng)發(fā)育分析的外類群。

1.2 葉綠體基因組組裝和注釋

使用GetOrganelle 1.7.7軟件[25]進行葉綠體基因組組裝。使用GeSeq注釋基因[26]。結合已發(fā)表的黑老虎葉綠體基因組序列，利用Geneious "2019 軟件[27]輔助檢查并進行必要的手動調(diào)整。采用OGDRAW 1.3.1[28]繪制基因組序列物理圖譜。

1.3 葉綠體基因組基本信息統(tǒng)計

利用Geneious 2019軟件統(tǒng)計8個南五味子屬樣品的葉綠體基因組序列總長度、重復區(qū)與單拷貝區(qū)的邊界等信息。通過Geneious軟件的MAFFT插件[29]分別對8個南五味子屬和5個黑老虎個體的葉綠體基因組序列進行比對，獲得比對文件。利用DnaSP 6軟件[30]，采用滑動窗口分析方法計算黑老虎葉綠體基因組的核苷酸多態(tài)性，其中窗口長度設置為500 bp，步長為200 bp。

1.4 葉綠體基因組簡單重復序列分析

為分析黑老虎的葉綠體SSR位點，利用在線軟件MISA[31]檢索了5個黑老虎個體的葉綠體基因組的單核苷酸（mononucleotide）SSR、二核苷酸（dinucleotide）SSR、三核苷酸（trinucleotide）SSR、四核苷酸（tetranucleotide）SSR、五核苷酸（pentanucleotide）SSR以及六核苷酸（hexanucleotide）SSR。最小重復參數(shù)設置分別為10、5、4、3、3、3；2個SSR間的最小距離設置為100 bp。使用Geneious 2019中的插件Phobos（http：//www.rub.de/ecoevo/cm/cm_phobos.htm）分析黑老虎不同個體間的變異SSR位點（polymorphic SSRs）。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

將8個南五味子屬物種的葉綠體基因組及2個外類群物種[五味子（NC_034908[24]）和華中五味子（MK193856[23]）]，提取所有樣品共有的79個蛋白編碼基因。以上序列通過MAFFT 7軟件[29]比對并組合成串聯(lián)矩陣。最大似然樹（Maximum likelihood tree， ML tree）采用RAxML 8.2.10軟件[32]構建。設置GTRGAMMA為核苷酸替代模型；重復自舉抽樣（bootstrap）1 000次計算分支支持率。

2 結果與分析

2.1 黑老虎葉綠體基因組結構和基因組成

由于中泰南五味子在《中國植物志（英文版）》[1]中被歸并到黑老虎中，并且本研究的系統(tǒng)發(fā)育結果也支持該分類修訂。因此，本研究中有關黑老虎不同葉綠體基因組的比較分析均包含中泰南五味子的樣品。黑老虎完整葉綠體基因組長度為145 413～145 903 bp，為典型的四分體環(huán)狀結構（圖1a）。

本研究新測序和組裝了2個南五味子屬黑老虎個體的葉綠體基因組，但2個基因組間不存在差異。為檢驗葉綠體基因組的組裝結果是否準確，將原始測序數(shù)據(jù)比對到組裝后的葉綠體基因組上，每個位點的測序深度平均為312.6次，說明這些葉綠體基因組序列是可靠的。將獲得的兩個黑老虎葉綠體基因組結合GenBank中6個已公開的南五味子屬葉綠體基因組序列[16-18， 20-22]進行比對分析。其中，大單拷貝區(qū)（large single copy， LSC）的長度范圍為94 457～94 757 bp，小單拷貝區(qū)（small single copy， SSC）的長度為18 032～18 047 bp，重復區(qū)（inverted repeat regions， IRs）長度為16 431～16 552 bp（表1）。黑老虎葉綠體基因組的總G（鳥嘌呤）和C（胞嘧啶）的堿基數(shù)占總堿基數(shù)的比例（GC占比）為39.7%（表1）。

黑老虎葉綠體基因組編碼125個基因，包含蛋白編碼基因82個，tRNA基因和rRNA基因分別為35和8個（表1）。按照基因的功能分為4類（表2），其中15個基因含有1個內(nèi)含子，分別是atpF、

petB、petD、ndhA、ndhB、rpoC1、rpl2、rps12、rps16、trnA-UGC、trnI-GAU、trnG-UCC、trnK-UUU、trnL-UAA、trnV-UAC。clpP和ycf3基因分別含有2個內(nèi)含子。此外，有13個基因各有2個拷貝，分別分布在反向重復區(qū)上。葉綠體基因組重復區(qū)的邊界分析表明，黑老虎5個葉綠體基因組（含中泰五味子）的重復區(qū)邊界均較穩(wěn)定（圖1b）。重復區(qū)IRa與大單拷貝區(qū)的交界落在ndhB-trnH-GUG的間隔區(qū)內(nèi)；與小單拷貝區(qū)的交界落在ycf1基因上。重復區(qū)IRb與大單拷貝區(qū)的交界落在trnL-CAA-ndhB的間隔區(qū)內(nèi)，與小單拷貝區(qū)的交界落在ndhF基因上。

2.2 葉綠體基因組變異分析

采用滑動窗口分析方法計算南五味子屬葉綠體基因組的核苷酸多態(tài)性，結果見圖2，發(fā)現(xiàn)該屬的核苷酸多態(tài)性（Pi）具有較大的變異范圍：0～0.094 3，平均值為0.006 9。最高的Pi值出現(xiàn)在trnS-GCU-trnG-UCC基因間隔區(qū)內(nèi)，為0.094 3。此外，psbI-trnG-UCC、trnG-UCC、petN-psbM均具有較高核苷酸多態(tài)性（Pi gt; 0.03）。本研究還對5個黑老虎的葉綠體基因組進行了核苷酸多態(tài)性（Pi）分析，發(fā)現(xiàn)petN-psbM和trnS-GCU-trnG-UCC具有很高的變異（Pi gt; 0.03），分別為：0.126 4和0.067 6。

2.3 葉綠體基因組SSR分析及系統(tǒng)發(fā)育分析

對5個黑老虎的葉綠體基因組簡單重復序列（SSR）進行分析表明，黑老虎的葉綠體基因組共有212個SSR位點。其中，江西的兩個黑老虎個體（HLH-1A和HLH-2A）分別有41個，福建的個體（MN480469）有42個，廣西的個體（MT934443）有43個，云南的個體（NC_057265）有45個。每個樣品的SSR種類的分布情況見圖3。

總體而言，單核苷酸重復序列最多，三堿基重復序列次之，五堿基重復序列最少（其中，廣西的個體缺失了五堿基重復序列）。通過比對所有黑老虎葉綠體基因組間的SSR位點，共發(fā)現(xiàn)了24個SSR位點存在變異。選取8個南五味子屬個體及2個外類群（五味子屬）的葉綠體基因組序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析。79個共有蛋白編碼基因構建的最大似然樹見圖4，其所有分支節(jié)點的支持率均為100%。8個南五味子屬的個體聚成一支，表明南五味子屬是一單系群。4個黑老虎個體與中泰南五味子聚成一支，其中新增測的2個樣品（來自江西贛州）聚在一起，再與來自福建的黑老虎個體聚成姐妹群，廣西個體（MT934443）在黑老虎分支的最基部（圖4）。

3 討 論

葉綠體是植物細胞中非常重要的細胞器，對植物生長發(fā)育至關重要[33-34]。黑老虎的葉綠體基因組具典型的四分體環(huán)狀結構，與絕大多數(shù)植物的葉綠體基因組結構一致[35]。此外，黑老虎葉綠體基因組的基因類型和數(shù)量也很穩(wěn)定。通過系統(tǒng)比較南五味子屬內(nèi)及黑老虎的葉綠體基因組，得到以下4個發(fā)現(xiàn)：

1）葉綠體基因組數(shù)據(jù)表明中泰南五味子應歸入黑老虎。南五味子屬分為離蕊南五味子亞屬（Kadsura subgen. Cosbaea）和南五味子亞屬（Kadsura subgen. Kadsura）[36]?！吨袊参镏荆ㄖ形陌妫返碾x蕊南五味子亞屬[37]包含中泰南五味子和黑老虎[30]。Smith[38]在1947年發(fā)表中泰南五味子的原文中承認該種與黑老虎形態(tài)上很相似，主要差別在于前者的葉片較薄、葉脈較密、雄蕊更多。然而，Saunders[36]對南五味子屬進行了分類修訂，發(fā)現(xiàn)中泰南五味子的形態(tài)均在黑老虎的形態(tài)變異范圍內(nèi)，因此在其1998年的專著中將中泰南五味子并入黑老虎。該觀點與《中國植物志（英文版）》[1]及其他研究者的觀點一致[39]。Liu等[40]的分子系統(tǒng)學研究雖包含中泰南五味子和黑老虎的樣品，并證明彼此聚成一支，但由于各只有1個樣品，故無法說明中泰南五味子與黑老虎間的依屬關系。本研究證明中泰南五味子[15]與其他黑老虎多個個體的葉綠體基因組聚成一支，并“混在”黑老虎的分支內(nèi)（圖4），有力支持了Saunders[36]的分類處理觀點。

2）黑老虎在南五味子屬內(nèi)具有比較獨特的系統(tǒng)位置。黑老虎具有獨特的雄蕊群特征，因此被認為是離蕊南五味子組（Sect. Cosbaea）或亞屬（Subg. Cosbaea）的唯一成員[36]。本研究的葉綠體基因組系統(tǒng)發(fā)育關系也證明黑老虎與其他南五味子屬類群分屬兩支，并與基于核基因ITS和葉綠體基因片段（如rbcL， matK， trnH-psbA）得到的系統(tǒng)發(fā)育關系一致[41-42]。此外，本研究通過葉綠體基因組比對，發(fā)現(xiàn)黑老虎具有獨特的IR邊界區(qū)的變異模式，與該屬其他種存在明顯區(qū)別，也顯示出黑老虎具獨特的系統(tǒng)地位。

3）黑老虎種下的葉綠體基因組具較高的遺傳變異。一般而言，葉綠體基因組具有適中的核苷酸替換速率，且其序列演化速率在編碼區(qū)和非編碼區(qū)間存在較大差異，因此被用在不同分類階元的系統(tǒng)發(fā)育研究中。例如：rbcL和atpB是早期分子系統(tǒng)學研究的主選基因片段[43-45]，而非編碼區(qū)（如trnL-trnF， trnH-psbA等）則因其較快的演化速率而被用于譜系地理學研究中。盡管已有大量高變異的葉綠體片段被開發(fā)出來[46-48]，但不同類群的葉綠體基因組仍存在結構變異，故發(fā)掘出特定類群的特有高變異區(qū)域具有重要意義。與以往的研究類似[15]，黑老虎葉綠體基因組的IR區(qū)域比大小單拷貝區(qū)保守。本研究進一步發(fā)現(xiàn)南五味子屬及黑老虎葉綠體基因組上的熱點變異出現(xiàn)在trnS-GCU-trnG-UCC和petN-psbM兩個基因間隔區(qū)，為黑老虎的系統(tǒng)發(fā)育及譜系地理學研究奠定了基礎。

4）SSR是遺傳多樣性、親緣關系、遺傳圖譜構建等方面研究的重要分子標記[49]。盡管葉綠體SSR（chloroplast SSRs或cpSSRs）在數(shù)量及變異率等方面均小于核基因SSR，但仍具有獨特優(yōu)勢。例如：葉綠體SSR缺乏重組，因而可用于譜系地理結構推斷[49-50]。黑老虎葉綠體基因組共有212個SSR位點，并首次發(fā)現(xiàn)24個SSR位點在5個黑老虎個體間存在變異，這為后續(xù)遺傳多樣性分析提供了重要資料。

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（責任編輯 王國棟）