摘要：目的 丁香活性組分（active fraction from clove，AFC）具有明顯的抗結(jié)腸癌活性，前期研究已制備AFC-PEG-PLGA納米粒，本研究進(jìn)一步系統(tǒng)評價AFC-PEG-PLGA納米粒的體外、體內(nèi)抗結(jié)腸癌活性。方法 常規(guī)培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、SW620、HCT8和LOVO，以CCK-8試劑檢測結(jié)腸癌細(xì)胞增殖抑制率及IC50值，篩選AFC-PEG-PLGA納米粒敏感的結(jié)腸癌細(xì)胞；建立裸鼠HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞移植瘤模型，隨機(jī)分為陰性對照組（0.9% NS）、陽性對照組（5-氟尿嘧啶，5-Fu，30.0 mg/kg）及PEG-PLGA空納米粒對照組、AFC（100 mg/kg）、AFC-PEG-PLGA納米粒（100 mg/kg）治療組。每周連續(xù)給藥5 d后停藥2 d，給藥4周，每2～3 d測量瘤徑和體重1次，計算腫瘤體積（tumor volume，TV）、相對腫瘤體積（relative tumor volume，RTV）和相對腫瘤增殖率（T/C%）。實(shí)驗結(jié)束后處死動物，剝?nèi)×鼋M織，稱瘤重，檢測AFC-PEG-PLGA納米粒對移植瘤生長的影響。結(jié)果 體外實(shí)驗結(jié)果表明，AFC-PEG-PLGA納米粒對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、SW620、HCT8和LOVO的IC50為（99.58±5.48）、（145.66±6.96）、（162.62±6.58）、（229.24±9.25） μg/mL，活性最強(qiáng)的是HCT116細(xì)胞，活性略強(qiáng)于AFC。體內(nèi)實(shí)驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)5-Fu、AFC與AFC-PEG-PLGA納米粒治療后，裸鼠TV、RTV、T/C/%及裸鼠瘤重均明顯下降，其中T/C/%分別為37.54%、57.39%和43.04%，AFC-PEG-PLGA納米粒作用強(qiáng)于AFC，與陰性對照組比較，Plt;0.01。結(jié)論 AFC-PEG-PLGA納米粒具有較強(qiáng)的體外、體內(nèi)抗結(jié)腸癌活性，以HCT116作用最強(qiáng)，活性強(qiáng)于AFC。

關(guān)鍵詞：丁香活性組分；PEG-PLGA；納米粒；結(jié)腸癌；HCT116

中圖分類號：R979.1；R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Study on the anti-colon cancer activity of the active fraction from clove

PEG-PLGA nanoparticles

Abstract Objective Active fraction from clove （AFC） has significant anti-colon cancer activity. Previous studies had prepared AFC-PEG-PLGA nanoparticles， and this study explored the anti-colon cancer activity of AFC-PEG-PLGA nanoparticles in vitro and in vivo. Methods Human colon cancer cells （HCT116， SW620， HCT8 and LOVO） were routinely cultivated; colon cancer cell proliferation inhibition rate and IC50 value using the CCK-8 reagent were detected; and colon cancer cells sensitive to AFC-PEG-PLGA nanoparticles were also screened. The nude mouse model of transplanted HCT116 colon cancer cells was established and randomly divided into a negative control group （0.9% NS）， a positive control group （fluorouracil， 5-Fu， 30.0 mg/kg）， a PEG-PLGA empty nanoparticle control group， an AFC （100 mg/kg）， and an AFC-PEG-PLGA nanoparticles （100 mg/kg） treatment group. After continuous administration for 5 days per week， the drug was stopped for 2 days， and the drug was administered for 4 weeks. Tumor diameter and body weight were measured every 2～3 days， and tumor volume （TV）， relative tumor volume （RTV）， and relative tumor proliferation rate （T/C%） were calculated. After the experiment， the animals were euthanized， tumor tissue was removed， tumor weight was measured， and the effect of AFC-PEG-PLGA nanoparticles on the growth of transplanted tumors was tested. Results In vitro experimental results showed that the IC50 of AFC-PEG-PLGA nanoparticles on colon cancer cells HCT116， SW620， HCT8， and LOVO were （99.58±5.48）， （145.66±6.96）， （162.62±6.58）， （229.24±9.25） μg/mL， respectively. The strongest activity was observed in HCT116 cells， which were slightly stronger than AFC. In vivo experimental results showed that after treatment with 5-Fu， AFC， and AFC-PEG-PLGA nanoparticles， the TV， RTV， T/C/%， and tumor weight of nude mice were significantly reduced， with T/C/% being 37.54%， 57.39%， and 43.04%， respectively. Conclusion The AFC-PEG-PLGA nanoparticles have strong anti-colon cancer activity in vitro and in vivo， with HCT116 having the strongest effect and stronger activity than AFC.

Key words Active fraction from clove; PEG-PLGA; Nanoparticles; Colon cancer; HCT116

根據(jù)全球結(jié)腸癌（colorectal cancer，CRC）研究報告，2020年全球已有193萬人確診CRC，94萬人死于CRC，是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤[1-3]。丁香是一種傳統(tǒng)的香料和中藥，丁香活性組分（active fraction from clove，AFC）是通過乙醇、丙酮和色譜分離得到的具有顯著細(xì)胞毒性的丁香提取物，主要含有兩種有效成分：丁香酚（eugenol）32.32%和齊墩果酸（oleanolic acid）23.60%。前期研究表明，這兩種成分對結(jié)腸癌、胰腺癌等腫瘤細(xì)胞具有顯著的抑制作用[4-6]。但由于AFC在體內(nèi)消除快、半衰期短，其生物利用度值不高，限制了其臨床應(yīng)用。

由于納米技術(shù)的進(jìn)步，納米材料已經(jīng)成為醫(yī)療、檢測和生物醫(yī)學(xué)圖像等應(yīng)用領(lǐng)域的重要研究對象。其中聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA），不僅具有良好的生物降解性和生物相容性，而且可以通過改變共聚單體的配比調(diào)節(jié)其降解速率，因此，在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用獲得了美國食品與藥物管理局（FDA）與歐洲藥品局（EMA）的許可[7-8]，也是當(dāng)前制備納米藥物最常用的聚合物載體。近年來，聚乙二醇（PEG）作為一種親水組分被廣泛應(yīng)用于高分子載體研究，其有著優(yōu)異的生物相容性和免疫原性。研究者們采用嵌段或接枝的方式，將疏水（PLGA）與親水（PEG）構(gòu)成PEG-PLGA嵌段共聚物[9]，從而進(jìn)一步提高聚合物載體的性能，PEG-PLGA共聚物可顯著改善藥品的水溶性、穩(wěn)定性和免疫原性，從而進(jìn)一步提高治療效果[10-11]。

AFC具有明顯的抗結(jié)腸癌活性，前期研究采用復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備了載AFC-PEG-PLGA納米粒，本研究進(jìn)一步采用多株結(jié)腸癌細(xì)胞，體外評價AFC納米粒對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用，篩選活性強(qiáng)的結(jié)腸癌細(xì)胞。同時建立裸鼠結(jié)腸癌移植性腫瘤模型，體內(nèi)評價AFC-PEG-PLGA納米粒的抗結(jié)腸癌活性，旨在為AFC-PEG-PLGA納米粒在結(jié)腸癌治療中的應(yīng)用提供科學(xué)的實(shí)驗依據(jù)，也為尋找安全有效抗腫瘤新劑型藥物提供新的思路。

1 實(shí)驗材料

1.1 細(xì)胞株

人結(jié)腸癌細(xì)胞（HCT116、SW620、HCT8、LOVO），分別購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞資源中心或武漢大學(xué)保藏中心（簡稱CCTCC）。細(xì)胞均采用RPMI1640+10%FBS培養(yǎng)基本實(shí)驗室常規(guī)培養(yǎng)、傳代、凍存。

1.2 藥物與試劑

AFC：為棕褐色粉末（批號20200514，其中含丁香酚32.32%和齊墩果酸23.60%），由首都醫(yī)科大學(xué)林秀坤教授提供，本實(shí)驗室4 ℃保存，臨用時用生理鹽水超聲助溶。AFC-PEG-PLGA納米粒的制備工藝如下：利用復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備AFC-PEG-PLGA納米粒，將一定含量的AFC溶解液用作內(nèi)水相，將適量PEG-PLGA溶解于二氯甲烷中，以組成有機(jī)相。將兩種物質(zhì)混合后，使用較大功率渦旋（3000 r/min） 60 s，制成AFC溶解液初乳（W/O）。然后，將制得的初乳迅速注入4.0 mL適量濃度PVA（W/V）的外水相中，并使用冰浴超聲（150 W，90 s），生成AFC復(fù)乳（W/O/W）。將復(fù)乳加入10.0 mL PVA水溶解液中，在室溫下進(jìn)行磁力攪動，使二氯甲烷充分揮發(fā)，即可得到納米粒膠體溶解液。5-氟尿嘧啶注射液（5-FU，10 mL： 0.25 g，批號：20221008），購自悅康藥業(yè)集團(tuán)有限公司。 RPMI1640培養(yǎng)基，購自美國Gibco公司；胎牛血清，購自杭州四季青公司；Cell counting kit-8 （CCK8），購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 實(shí)驗動物

6周齡SPF級BALB/c-nu免疫缺陷雌性裸鼠，購自重慶瀚東實(shí)驗動物服務(wù)公司。實(shí)驗動物合格證號：SCXK（渝）2020-17。西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物福利倫理審查批件號：20230830-015。

2 實(shí)驗方法

2.1 AFC-PEG-PLGA納米粒體外抗結(jié)腸癌活性評價

將10 mg AFC-PEG-PLGA納米粒及AFC分別加入2 mL無血清培養(yǎng)基中，經(jīng)過輕度超聲處理至溶解，配置成5 mg/mL儲存液，然后用濾器過篩，最后分裝，儲存于4 ℃以保證其穩(wěn)定性。將儲備液用1640培養(yǎng)基稀釋，制成5個濃度，分別為4000、2000、1000、500和250 μg/mL，4 ℃?zhèn)溆?。將處在指?shù)增生期的人結(jié)腸癌HCT116、SW620、HCT8、LOVO細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×104個/mL，接種于96孔板。在96孔板中，每孔加藥10 μL，使其終濃度分別為400、200、100、50和25 μg/mL，陰性對照組加入等量各細(xì)胞對應(yīng)的無血清培養(yǎng)基，每個濃度4個復(fù)孔。繼續(xù)培育48 h，每孔加CCK-8試劑10 μL。孵育1 h后用多功能酶標(biāo)儀檢測培養(yǎng)板每孔的吸光度A450（450 nm）。根據(jù)A450按下列公式計算增殖抑制率（%），然后用IC50（半數(shù)抑制濃度）計算軟件根據(jù)增殖抑制率計算IC50。

2.2 AFC-PEG-PLGA納米粒體內(nèi)抗結(jié)腸癌活性研究

當(dāng)培養(yǎng)的HCT116細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，經(jīng)PBS漂洗、胰酶消化后，離心采集細(xì)胞，并對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。將單細(xì)胞懸液的密度調(diào)整至2×107個/mL，然后將其暫時放置于冰箱中以備后續(xù)使用。SPF級Bal/c雄性裸鼠2只，在SPF級環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)數(shù)周。在裸鼠適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境后，使用一次性滅菌注射器從已配置好的單細(xì)胞懸液中抽取0.1 mL（細(xì)胞濃度為2×107個/mL），對裸鼠的腋窩背部皮膚進(jìn)行酒精消毒后，采用皮下注射接種HCT116細(xì)胞懸液進(jìn)行造模實(shí)驗。事先制備好的細(xì)胞懸液應(yīng)置于冰上保存，且在1 h內(nèi)注射完畢，避免細(xì)胞活性降低，影響成瘤率。接種瘤細(xì)胞后繼續(xù)飼養(yǎng)、觀察裸鼠。當(dāng)細(xì)胞形成腫瘤并且腫瘤體積達(dá)到大約200 mm3時，將裸鼠處死，取出腫瘤體，用生理鹽水沖洗干凈，然后用手術(shù)剪將腫瘤剪碎成大小均勻（約1.5 mm3）的組織塊。用套筒針將同等體積的瘤體接種于30只裸鼠腋窩后側(cè)皮下，使用火棉膠止血，建立人結(jié)腸癌HCT116移植瘤Bal/c裸鼠模型。選擇體內(nèi)已形成瘤塊且瘤徑約≥100 mm3的裸鼠，隨機(jī)分為陰性對照組（0.9% NS）、陽性對照組（5-氟尿嘧啶，5-Fu，30.0 mg/kg）及PEG-PLGA空納米粒對照組、AFC（100 mg/kg）[4]、AFC-PEG-PLGA納米粒（含AFC 100 mg/kg）治療組，每組6只。腹腔注射給藥，持續(xù)28 d。給藥期間每2～3 d觀察、測量并記錄瘤徑及裸鼠體重3次，并統(tǒng)計TV、RTV及T/C% 3個指標(biāo)。實(shí)驗結(jié)束后處死動物，剖取腫瘤并稱重，分析瘤重。按下列公式計算：

①腫瘤體積（TV）= 1/2×a×b2，a：腫瘤長度；b：腫瘤寬度；

②相對腫瘤體積（RTV） = Vt/V0，V0：各組給藥前瘤體積，Vt：各組每次實(shí)測瘤體積；

③相對腫瘤增殖率T/C/%= TRTV/ CRTV×100%，TRTV：治療組RTV，CRTV：陰性對照組RTV。治療效果評價標(biāo)準(zhǔn)[12]：無效：T/C/%gt;60%；有效：T/C/%≤60，且統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示Plt;0.05。

2.3 統(tǒng)計分析

上述實(shí)驗方法經(jīng)過3次重復(fù)實(shí)驗，使用SPSS17.0統(tǒng)計應(yīng)用軟件和GraphPad軟件系統(tǒng)對試驗資料加以分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）的方式表達(dá)。為了更好地對比多組間的差別，使用了One-Way ANOVA單因素方差分析或秩和檢驗，Plt;0.05時認(rèn)為差異有著統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實(shí)驗結(jié)果

3.1 AFC-PEG-PLGA納米粒體外抗結(jié)腸癌活性評價

CCK8法檢測結(jié)果表明，在48 h內(nèi)不同劑量的AFC-PEG-PLGA納米粒（終濃度25～400 μg/mL）對人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、SW620、HCT8和LOVO的半數(shù)抑制濃度IC50分別為（99.58±5.48）、（145.66±6.96）、（162.62±6.58）、（229.24±9.25） μg/mL，活性最強(qiáng)的是HCT116細(xì)胞，活性均強(qiáng)于AFC，結(jié)果見圖1和表1。

3.2 AFC-PEG-PLGA納米粒體內(nèi)抗結(jié)腸癌活性研究

與PEG-PLGA空納米粒對照組不同，經(jīng)過AFC 和AFC-PEG-PLGA納米粒治療后，裸鼠人結(jié)腸HCT116移植瘤的腫瘤體積TV、相對腫瘤體積RTV和相對腫瘤增殖率T/C%顯著減少，與陰性對照組比較，Plt;0.01，結(jié)果見圖2～3。最佳治療時間為治療第26天，PEG-PLGA空納米粒對照組、AFC、AFC-PEG-PLGA納米粒T/C%分別為95.76%、57.39%和43.08%，揭示AFC-PEG-PLGA納米粒明顯抑制裸鼠人結(jié)腸癌HCT116移植瘤的生長，作用強(qiáng)于AFC，結(jié)果見表2。實(shí)驗結(jié)束后，剖取各組裸鼠移植性腫瘤，經(jīng)AFC與AFC-PEG-PLGA納米粒治療后，各治療組裸鼠瘤重均下降，且AFC-PEG-PLGA納米粒作用強(qiáng)于AFC，與陰性對照組比較，Plt;0.01；PEG-PLGA 空納米粒對照組對瘤重?zé)o影響，與陰性對照組比較，Pgt;0.01，結(jié)果見圖4～5。

4 討論

結(jié)腸癌在我國的發(fā)病率日益增加，但目前手術(shù)與放療的傳統(tǒng)治療方法毒副作用較大，許多抗結(jié)腸癌藥物研究正處在基礎(chǔ)研究階段，且受到靶向性和體內(nèi)半衰期短等限制[13-14]，而納米技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)緩釋和靶向傳遞到癌癥部位，從而大大提高了抗結(jié)腸癌藥物的有效性。丁香（clove）是一種雌性同體植物，屬于桃金娘科（Eugenia caryophyllata Thunb.），其花蕾與果實(shí)均可用藥[15-16]。《藥性論》中提到的丁香，具有久遠(yuǎn)的藥用和食物發(fā)展史，被我國列為首批藥食兩用名錄，有著巨大的發(fā)展?jié)摿褪袌鰞r值[17-18]。AFC對結(jié)腸癌、胰腺癌等腫瘤細(xì)胞具有顯著的抑制作用，但由于AFC在體內(nèi)消除快、半衰期短，其生物利用度值不高，限制了其臨床應(yīng)用。

納米材料因為其良好的生物相容性和生物降解性能，在國外已經(jīng)成為醫(yī)療、檢測和生物醫(yī)學(xué)圖像等應(yīng)用領(lǐng)域的重要研究對象[19]，但在國內(nèi)仍缺少對納米材料的深入研究，其中PLGA已獲得了FDA與EMA的認(rèn)可。由聚乙二醇修飾的聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PEG-PLGA）[20-21]是一種復(fù)雜的嵌段聚合物，其表層平滑、尺寸勻稱、分散性良好，掃描電鏡圖片表明，它具有球形殼狀。為了拉長藥物在機(jī)體的循環(huán)時期以及減少被巨噬細(xì)胞吞噬的概率，所以利用PEG具有的空間位阻作用，與在血液循環(huán)中疏水PLGA端聚和鑲嵌，使得PEG-PLGA包封的藥物具有良好的半衰期和生物利用度。

前期研究發(fā)現(xiàn)，AFC對多株人腫瘤細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒作用，且對結(jié)腸癌細(xì)胞活性最強(qiáng)，但將AFC制備成載AFC-PEG-PLGA納米粒后，其體外抗結(jié)腸活性又如何呢？本研究選擇了4株人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、SW620、HCT8及LOVO，體外采用CCK8試驗評價其抗結(jié)腸癌活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AFC-PEG-PLGA納米粒（終濃度25～400 μg/mL）對人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、SW620、HCT8和LOVO的半數(shù)抑制濃度IC50分別為（99.58±5.48）、（145.66±6.96）、（162.62±6.58）、（229.24±9.25） μg/mL，因此HCT116細(xì)胞是AFC-PEG-PLGA納米粒體外最敏感的人結(jié)腸癌細(xì)胞活性，且活性均強(qiáng)于AFC，說明AFC-PEG-PLGA納米粒具有較強(qiáng)的體外抗結(jié)腸癌活性，說明納米粒更容易促進(jìn)AFC進(jìn)入結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)，但尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

建立移植性腫瘤動物模型是一種理想的體內(nèi)抗腫瘤活性評價途徑，廣泛應(yīng)用于抗腫瘤藥物的活性篩選以及新藥藥理學(xué)研究[22-24]。目前，最常用的是裸鼠移植瘤模型，其接種方法主要有以下幾種：裸鼠腋下皮下接種、腹腔接種以及原位移植等，由于腋下皮下接種操作簡單且創(chuàng)傷性小，腫瘤表淺而易于觀察等諸多優(yōu)點(diǎn)，因此，腋下皮下接種是當(dāng)前最常用的接種方法[25]。本研究首先建立裸鼠HCT-116細(xì)胞移植瘤模型，然后腹腔注射PEG-PLGA空納米粒、AFC、AFC-PEG-PLGA納米粒，實(shí)驗結(jié)果表明AFC-PEG-PLGA納米粒明顯抑制裸鼠人結(jié)腸癌HCT116移植瘤的生長，TV、RTV、T/C%及裸鼠瘤重明顯下降，最佳治療時間為治療第26天，PEG-PLGA空納米粒、AFC、AFC-PEG-PLGA納米粒T/C%分別為95.76%、57.39%和43.08%?？鼓[瘤藥效學(xué)指導(dǎo)原則中療效評價標(biāo)準(zhǔn)：T/C（%）gt;60%為無效，T/C（%）≤60，并經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理Plt;0.05為有效。AFC-PEG-PLGA 納米粒T/C%小于60%，且作用強(qiáng)于AFC，說明PEG-PLGA納米粒明顯增強(qiáng)了AFC的治療作用。本研究為AFC納米粒在臨床抗結(jié)腸癌治療中的應(yīng)用提供了科學(xué)的實(shí)驗依據(jù)，也為從中藥提取物中尋找安全有效的抗結(jié)腸癌新劑型提供了新思路。但AFC 納米粒的制備工藝有待進(jìn)一步優(yōu)化，是否對其他腫瘤也有一定的活性尚不清楚，以及安全性等問題均值得深入研究。

參 考 文 獻(xiàn)

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