關鍵詞：沙棘；液質聯(lián)用技術；酚酸類成分；黃酮類成分；種質資源

沙棘Hippophaerhamnoides是胡頹子科沙棘屬落葉灌木或小喬木[1]。沙棘屬植物分為6種12亞種，中國有6種8亞種，是世界上天然沙棘種質資源最豐富的國家，也是人工種植沙棘面積最大的國家[2]。沙棘具有較高的生態(tài)、經(jīng)濟、社會價值，在我國西北地區(qū)被大面積推廣種植。沙棘葉片和果實含有豐富的生物活性成分，其酚酸類和黃酮類成分具有抗氧化[3]、抗癌細胞增殖[4]、抗糖尿病[5]等作用，已被廣泛應用于食品、藥品和保健品行業(yè)。

常用的酚酸類成分和黃酮類成分檢測方法有分光光度法、高效液相色譜法（HPLC）、高效液相色譜-串聯(lián)質譜法（HPLC-MS/MS）。分光光度法常被用于檢測總酚、總黃酮含量。戈素芬等[6]采用分光光度法測得遼西地區(qū)栽植的8個沙棘品種葉片中總酚含量為6.789～20.767mg/g，總黃酮含量為7.006～35.748mg/g；張東為等[7]采用分光光度法測得遼西地區(qū)18個優(yōu)良沙棘單株果實的總酚含量為5.07～10.74mg/g，總黃酮含量為1.59～11.07mg/g。HPLC法可被用來測定樣品酚酸類和黃酮類成分的組分及單一組分含量。Yan等[8]采用HPLC法測定了沙棘果實黃酮類成分蘆丁、槲皮素、異鼠李素和山柰酚含量；張欣等[9]采用HPLC法測定了中國沙棘、阜雜1號沙棘和雜優(yōu)54號沙棘葉中沒食子酸的含量。采用HPLC法測定單次，僅能對少數(shù)幾種酚酸類和黃酮成分進行定量，而高效液相色譜-串聯(lián)質譜法因具有分析速度快、靈敏度高、結構解析能力強等優(yōu)點正被廣泛應用于天然產(chǎn)物的定性定量分析。一些研究者采用高效液相色譜-串聯(lián)質譜法對沙棘葉片和果實中的黃酮類成分進行了研究。如蔡爽等[10]采用該方法對采自黑龍江的俄羅斯引進沙棘和雜交沙棘等52個沙棘品種葉片、果肉和種子的8種黃酮類成分進行了研究，結果發(fā)現(xiàn)沙棘不同部位黃酮類成分的組成和含量均存在明顯差異，主要黃酮類成分均為蘆丁、槲皮素和表沒食子兒茶素。

俄羅斯是擁有沙棘先進育種技術的國家，其選育的品種是許多國家引種的首選。我國“三北”地區(qū)急需經(jīng)濟性狀優(yōu)異的沙棘品種，2012年水利部沙棘開發(fā)管理中心引進俄羅斯第三代沙棘良種，分別栽植于“三北”地區(qū)不同氣候地理區(qū)，并從中優(yōu)選出了適應強且經(jīng)濟性狀優(yōu)良的沙棘品種。通過雜交育種可選育出許多優(yōu)良品種，服務于我國“三北”地區(qū)的沙棘資源建設和開發(fā)利用工作。但是當前針對篩選優(yōu)勢品種以實施定向育種及其開發(fā)利用的研究進展相對緩慢，鮮見相關報道。本研究中以在遼西地區(qū)表現(xiàn)優(yōu)良的6個俄羅斯第三代大果沙棘、3個表現(xiàn)優(yōu)良的雜交沙棘以及遼寧省旱地農(nóng)林研究所自主選育的中國沙棘和目前生產(chǎn)上主栽大果沙棘品種‘深秋紅’等11個沙棘品種為研究對象，采用HPLC-MS/MS法分析其葉片、果肉中10種酚酸類成分及8種黃酮類成分的含量，研究不同沙棘品種及不同器官間酚酸類成分和黃酮類成分組成及其含量的差異，以期為沙棘資源的定向育種和開發(fā)利用提供參考。

1材料與方法

1.1試驗地概況

試驗地位于遼寧省朝陽市南郊的遼寧省旱地農(nóng)林研究所試驗示范基地內?；氐貏萜教?，海拔184m，屬暖溫帶半濕潤半干旱氣候。年平均氣溫8.3℃，日照充足，晝夜溫差大，極端最低溫度為-34.4℃，極端最高溫度43.3℃，≥10℃的活動積溫為3445.6～3720.4℃，無霜期145～165d，平均年降水量450mm，蒸發(fā)量2000mm，年平均日照2752～2950h。土壤類型為褐土，土壤質地為砂壤土，土層厚度0.6m，土壤有機質含量為0.8%，pH7.8。

1.2供試材料

選擇基地內長勢良好的11個沙棘品種作為研究對象，包括6個俄羅斯引進第三代沙棘品種（‘201301’‘201302’‘201307’‘201308’‘201309’‘2013016’[11]），3個雜交沙棘品種（‘雜雌優(yōu)10號’‘QQHE19-01’‘QQHE19-06’），1個大果沙棘品種（‘深秋紅’），1個中國沙棘品種（中紅果），各沙棘品種的基本信息見表1。于2022年8—9月果實成熟期，分別在樣株樹冠上、中、下3個部位的東、南、西、北4個方向的內、外部采集葉片和果實，將樣品充分混合，置于-80℃冰箱冷凍保存。

試劑：水楊酸、對羥基苯甲酸、肉桂酸、原兒茶酸、丁香酸、對香豆酸、香草酸、沒食子酸、咖啡酸、阿魏酸、異鼠李素、沒食子兒茶素沒食子酸酯、蘆丁、表沒食子兒茶素、槲皮素、木犀草素、山柰酚、柚皮苷標準品的純度大于99.99%，均購自上海源葉生物科技有限公司；色譜甲醇、乙醇、石油醚購自天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.3樣品中酚酸類及黃酮類成分提取

參考蔡爽等[10]的方法提取樣品中的酚酸類及黃酮類成分。分別精確稱取研磨后的沙棘葉片、果實粉末各2g，加入5mL75%的乙醇，25℃條件下超聲輔助提?。?00W）10min，4℃條件下4500r/min離心15min，將殘渣采用相同方法提取2次，合并上清液。用石油醚萃取上清液3次，除色素。吸取0.5mL萃取液，用色譜甲醇稀釋10倍，取1.0mL稀釋液，使用微孔有機濾膜（孔徑0.22μm）過濾，備用。

1.4樣品中酚酸類及黃酮類成分分析

1.4.1HPLC-MS/MS分析

用DGU-20A液相色譜（日本島津公司）-API3200三重四極桿質譜儀（美國AB公司）進行HPLC-MS/MS分析。色譜條件：色譜柱（日本島津公司）為C18（2.1mm×50mm，1.9μm）；流速0.2mL/min，流動相A為超純水，流動相B為色譜甲醇，柱溫30℃，進樣量2μL，等梯度洗脫5min。質譜條件：電噴霧離子源（ESI），負離子電離模式；質量掃描范圍100～1000amu；干燥氣（N2）流速3L/min，溫度550℃；掃描方式為多重反應監(jiān)測。10種酚酸類及8種黃酮類成分質譜分析參數(shù)見表2。

1.4.2標準曲線繪制

精確稱取各標準品5.0mg，分別配制成質量濃度20、50、100、200、500、1000μg/L的混合標樣。以定量離子峰面積為縱坐標、標準品溶液質量濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.4.3樣品中酚酸類及黃酮類成分測定

按上述HPLC-MS/MS分析條件和方法對各樣品提取液進行測定，進樣量2μL，3次重復。以定量離子峰面積為指標，依據(jù)各酚酸類及黃酮類成分的標準曲線計算樣品中各成分的含量。酚酸類成分總含量為10種酚酸類成分含量之和，黃酮類成分總含量為8種黃酮類成分含量之和。

1.5數(shù)據(jù)處理

利用SPSS25.0軟件采用Duncan法進行差異顯著性分析，利用Origin9.1軟件繪圖。

2結果與分析

2.1酚酸類及黃酮類標準品色譜圖

將10種酚酸類標準品和8種黃酮類標準品溶液按照上述色譜和質譜條件進行HPLC-MS/MS分析，得到各標準品的質譜多反應監(jiān)測（MRM）色譜（圖1）。

2.2酚酸類及黃酮類標準品回歸曲線線性關系

10種酚酸和8種黃酮類標準品回歸曲線的線性關系良好，相關系數(shù)均大于0.99（表3）。

2.3沙棘葉片酚酸類和黃酮類成分

11個沙棘品種葉片均含有這18種成分（表4）。10種酚酸類物質含量存在顯著差異（P＜0.05），總含量為1032.466～3354.984μg/g，各品種按照酚酸類物質含量由高到低排序依次為‘中紅果’‘201309’‘201308’‘QQHE19-06’‘201316’‘201302’‘深秋紅’‘201301’‘QQHE19-01’‘雜雌優(yōu)10號’‘201307’。10種酚酸類成分的含量在不同品種沙棘葉片中差異較大（圖2），其中阿魏酸、香草酸、對香豆酸和沒食子酸是沙棘葉片的主要酚酸類成分，含量分別為255.574～648.996、227.217～877.757、250.038～457.189、87.722～1085.000μg/g，平均含量分別為396.763、362.470、333.154、279.448μg/g。肉桂酸、原兒茶酸、丁香酸、咖啡酸含量較低。各品種按照阿魏酸含量由高到低排序依次為‘中紅果’‘201309’‘201301’‘201316’‘201302’‘201308’‘QQHE19-01’‘201307’‘深秋紅’‘QQHE19-06’‘雜雌優(yōu)10號’。葉片中香草酸、對香豆酸和沒食子酸含量最高的品種同樣為‘中紅果’，含量分別為877.757、457.199、1085.000μg/g，特別是其沒食子酸的含量，是含量第2高的‘201309’的2.13倍，是含量最低的‘201302’的12.37倍。

11個沙棘品種葉片8種黃酮類物質總含量差異顯著（P＜0.05）（表4），為181.359～617.098μg/g，各品種按照黃酮類物質含量由高到低依次為‘中紅果’‘201309’‘201301’‘雜雌優(yōu)10號’‘深秋紅’‘201307’‘201302’‘201316’‘201308’‘QQHE19-06’‘QQHE19-01’。8種黃酮類成分在不同品種沙棘葉片中差異較大（圖2），其中蘆丁是沙棘葉片主要的黃酮類成分，含量為87.065～334.689μg/g，平均含量為191.321μg/g，顯著高于其他黃酮類成分，其含量在‘201309’品種葉片中最高（334.689μg/g），是含量最低品種‘QQHE19-01’的3.84倍。表沒食子兒茶素、槲皮素、山柰酚、異鼠李素含量次之，分別為8.454～137.515、16.353～92.338、6.081～71.410、2.646～40.143μg/g，平均含量分別為36.540、39.473、28.881、20.913μg/g；沒食子兒茶素沒食子酸酯、木犀草素和柚皮苷含量較低。表沒食子兒茶素含量較高的品種為‘201307’‘201301’‘中紅果’，含量分別為137.515、76.775、74.055μg/g；槲皮素含量較高的品種為‘中紅果’和‘深秋紅’，含量分別為92.338、52.199μg/g；山柰酚含量較高的品種為‘201302’和‘深秋紅’，含量分別為74.410、54.428μg/g；異鼠李素含量較高的品種為‘中紅果’‘201306’‘深秋紅’，含量分別為40.143、38.067、36.370μg/g。

基于酚酸類和黃酮類物質的高含量，‘中紅果’和‘201309’品種沙棘葉片在營養(yǎng)價值和藥用價值方面具有顯著優(yōu)勢，可被作為育種和栽培的重點對象。利用具有高含量的酚酸類和黃酮類物質的沙棘品種，可以開發(fā)出一系列具有抗氧化、抗炎、抗癌等功效的功能性食品和藥品，如沙棘提取物、沙棘茶、沙棘飲料等。

2.4沙棘果實酚酸類和黃酮類成分

在11個沙棘品種果實樣品中檢出部分酚酸類成分和8種黃酮類成分，且含量差異顯著（P＜0.05）（表4）。不同品種沙棘果實酚酸類成分總含量為25.002～98.009μg/g，各品種按照酚酸類成分含量由高到低排序依次為‘雜雌優(yōu)10號’‘201308’‘201302’‘QQHE19-01’‘201301’‘201316’‘深秋紅’‘QQHE19-06’‘中紅果’‘201309’‘201307’。‘雜雌優(yōu)10號’果實酚酸類成分總含量最高（98.009μg/g），其次是‘201308’（77.503μg/g）；‘201307’酚酸類成分總含量最低（25.002μg/g），僅為‘雜雌優(yōu)10號’的25.51%。原兒茶酸、丁香酸、對香豆酸、沒食子酸、咖啡酸5種酚酸類成分均在11個沙棘品種果實中被檢測出，而其余5種酚酸類成分僅存在于部分品種果實中，大多數(shù)品種果實中未檢出水楊酸、對羥基苯甲酸、肉桂酸和香草酸。10種酚酸類成分在不同品種沙棘果實中含量差異較大（圖2），其中對香豆酸是沙棘果實主要酚酸類成分，含量14.629～64.327μg/g，平均含量為29.585μg/g，顯著高于其他酚酸類成分?！s雌優(yōu)10號’所含酚酸類成分種類最多，共檢測出9種，顯示出其成分的豐富性。

11個沙棘品種果實中8種黃酮類成分總含量差異顯著（P＜0.05）（表4），果實總黃酮含量為54.219～351.622μg/g，各品種按照黃酮類成分含量由高到低排序依次為‘201301’‘201308’‘QQHE19-01’‘中紅果’‘201307’‘QQHE19-06’‘201316’‘雜雌優(yōu)10號’‘201309’‘201302’‘深秋紅’?！?01301’果實中總黃酮含量最高（351.622μg/g），其次是‘201308’（189.981μg/g）、‘QQHE19-01’（149.689μg/g）、‘中紅果’（113.679μg/g）和‘201307’（102.916μg/g）；‘深秋紅’果實總黃酮含量最低（54.219μg/g），僅為‘201301’的15.42%。8種黃酮類成分在不同品種沙棘果實中含量差異較大（圖2），其中蘆丁是沙棘果實主要黃酮類成分，含量為18.281～317.341μg/g，平均含量81.200μg/g，顯著高于其他黃酮類成分；異鼠李素、表沒食子兒茶素、槲皮素、沒食子兒茶素沒食子酸酯含量次之，分別為2.303～26.401、5.867～32.671、4.328～16.076、7.420～8.001μg/g，平均含量分別為9.644、13.914、7.140、7.640μg/g。各品種按照蘆丁含量由高到低排序依次為‘201301’‘201308’‘QQHE19-01’‘201307’‘201316’‘201309’‘QQHE19-06’‘201302’‘雜雌優(yōu)10號’‘中紅果’‘深秋紅’?！?01301’含量最高，為‘深秋紅’的17.36倍。

‘雜雌優(yōu)10號’和‘201301’具有高含量的酚酸類和黃酮類成分，可針對其特性開發(fā)功能性食品或保健品，如沙棘果粉、沙棘果汁、沙棘提取物膠囊等，滿足消費者對健康產(chǎn)品的需求。二者可作為推廣種植的沙棘品種。

3討論與結論

沙棘不同器官酚酸類和黃酮類成分的組分及其含量受品種、栽培地點和氣候條件等影響。丁金等[12]采用HPLC法測定采自青海地區(qū)中國沙棘葉片酚酸類成分，結果發(fā)現(xiàn)阿魏酸、對香豆酸、沒食子酸含量分別為4～105、85～237、32～110μg/g，其含量低于本研究結果；張欣等[9]測得的山西省野生中國沙棘葉片沒食子酸含量為2363.3μg/g，其含量高于本研究結果。蔡爽等[10]研究的沙棘和雜交沙棘等52個品種中，涉及本研究中采用的‘201301’‘201307’‘201308’‘201309’‘201316’這5個品種，均源自俄羅斯引進品種，但栽培地點不同，前者采樣地點為黑龍江綏化地區(qū)。本研究中這5個品種沙棘葉片中沒食子兒茶素沒食子酸酯、蘆丁、表沒食子兒茶素、木犀草素、柚皮苷含量高于蔡爽等[10]的研究結果，而槲皮素含量顯著低于后者的研究結果，說明遼寧朝陽地區(qū)的栽培條件更有利于沙棘葉片蘆丁和表沒食子兒茶素等黃酮類成分的積累，而黑龍江綏化地區(qū)的栽培條件更有利于沙棘葉片槲皮素的積累。本研究中11個沙棘品種果實主要酚酸類成分為對香豆酸，其含量顯著高于其他酚酸類成分，其次為咖啡酸和沒食子酸。Arimboor等[13]對印度沙棘果實9種酚酸類成分進行了研究，結果發(fā)現(xiàn)沙棘果實游離酚酸含量分別為沒食子酸88μg/g、水楊酸46μg/g、原兒茶酸33μg/g、阿魏酸13μg/g、對香豆酸11μg/g、對羥基苯甲酸8μg/g、肉桂酸7μg/g、香草酸5μg/g、咖啡酸3μg/g，其中對香豆酸、咖啡酸含量低于本研究結果，香草酸、肉桂酸含量在本研究結果范圍內，其余5種酚酸含量均高于本研究結果。

本研究中11個沙棘品種葉片中主要酚酸類成分為阿魏酸、香草酸、對香豆酸和沒食子酸，主要黃酮類成分為蘆丁。這些成分具有抗真菌[5]、抗氧化[14]、降低阿爾茨海默病發(fā)病風險[15]、調節(jié)糖脂代謝[16]、治療動脈粥樣硬化[17]、增強免疫力[18]、抗癌細胞增殖[19]等多種生物學功能。在實際生產(chǎn)過程中，可依據(jù)不同器官中主要酚酸類和黃酮類成分及其功能的差異，有針對性地進行沙棘食品、藥品和保健品的開發(fā)。沙棘果實中酚酸類成分因品種而異，如‘雜雌優(yōu)10號’含9種酚酸，‘201307’僅含5種。這主要是由沙棘品種遺傳特性和代謝途徑不同導致。本研究結果揭示了酚酸類和黃酮類成分在沙棘不同器官的分布與含量，為給沙棘資源的高效利用提供參考，未來研究中將綜合考慮研究生長周期、環(huán)境因子等因素對酚酸類和黃酮類成分分布與含量的影響。

酚酸類成分和黃酮類成分是沙棘葉片和果實的主要活性成分，本研究中采用優(yōu)化的HPLC-MS/MS法檢測出11個沙棘品種葉片和果實中酚酸類及黃酮類成分及其含量。就品種來看，‘中紅果’和‘201309’葉片中的酚酸類及黃酮類含量較高，‘雜雌優(yōu)10號’和‘201308’果實中酚酸類含量較高，‘201301’和‘201308’果實中黃酮類含量高，可進行定向培育和示范推廣。沙棘葉片是酚酸類和黃酮類成分的主要富集部位，其含量顯著高于果實。因此，在開發(fā)和利用酚酸及黃酮資源時，應優(yōu)先考慮將沙棘葉片作為提取原料。沙棘葉片主要酚酸類成分為阿魏酸、香草酸、對香豆酸和沒食子酸，果實中主要酚酸類成分為對香豆酸，葉片和果實主要黃酮類成分均為蘆丁，在后續(xù)試驗中可針對這些成分進行深入研究。