摘要：【目的】對(duì)鐵十字秋海棠（Begonia masoniana）R2R3-MYB基因家族進(jìn)行鑒定分析，并檢測(cè)R2R3-MYB基因家族成員在鐵十字秋海棠葉片不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期中葉斑區(qū)和非葉斑區(qū)的表達(dá)模式，為鐵十字秋海棠葉斑分子調(diào)控機(jī)制和葉色改良及新品種培育提供理論參考?！痉椒ā恳澡F十字秋海棠3個(gè)關(guān)鍵生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的葉片為試驗(yàn)材料，參考擬南芥R2R3-MYB家族蛋白序列，利用生物信息學(xué)方法從鐵十字秋海棠基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定出R2R3-MYB基因家族成員，并對(duì)其理化性質(zhì)、染色體定位、系統(tǒng)發(fā)育、基因結(jié)構(gòu)、保守基序及啟動(dòng)子順式作用元件等進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)7個(gè)BmaMYBs基因在鐵十字秋海棠3個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育期中葉斑區(qū)和非葉斑區(qū)的表達(dá)模式?！窘Y(jié)果】從鐵十字秋海棠基因組中鑒定出110個(gè)R2R3-MYB基因家族成員，該基因家族成員的氨基酸數(shù)量為128～870個(gè)，分子量為14660.85～97435.93 Da，理論等電點(diǎn)（pI）為4.92～10.10，成員之間差異較大，大部分為不穩(wěn)定的疏水性蛋白，均定位在細(xì)胞核。110個(gè)R2R3-MYB家族基因在15條染色體上均有分布，部分基因在同一染色體上集中分布，形成基因簇；BmaMYBs含有0～10個(gè)內(nèi)含子；約94%的成員含有Motif 1、Motif 2和Motif 3基序；R2R3-MYB基因家族成員啟動(dòng)子均含有大量光響應(yīng)元件；BmaMYB10、BmaMYB18、BmaMYB38、BmaMYB53、BmaMYB97、BmaMYB99和BmaMYB109基因在葉片發(fā)育過(guò)程中葉斑區(qū)與非葉斑區(qū)均有表達(dá)，葉斑區(qū)BmaMYB53基因的相對(duì)表達(dá)量較非葉斑區(qū)高達(dá)19.41～131.99倍?！窘Y(jié)論】在鐵十字秋海棠基因組中鑒定出110個(gè)R2R3-MYB基因家族成員，葉斑區(qū)與非葉斑區(qū)BmaMYB53基因的相對(duì)表達(dá)量差異最大，推測(cè)該基因是調(diào)控鐵十字秋海棠葉斑形成的關(guān)鍵基因。

關(guān)鍵詞：鐵十字秋海棠；R2R3-MYB基因家族；花青苷；葉斑

中圖分類號(hào)：S682.36文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：2095-1191（2024）09-2665-14

Identification and expression analysis of R2R3-MYB gene family in Begonia masoniana

LIU Ya-zhi，DENG Hui-min，PENG Jia-hui，YU Yi-xun，LIU Juan-xu*

（College of Horticulture，South China Agricultural University，Guangzhou，Guangdong 510642，China）

Abstract：【Objective】Identification and analysis of the R2R3-MYB gene family in Begonia masoniana was con-ducted，and the expression patterns of the R2R3-MYB gene family members in different growth stages of leaf spots and non-leaf spot regions was detected，providing theoretical reference for understanding the molecular regulatory mecha-nisms underlying leaf spot formation in B.masoniana，as well as for leaf color improvement and new variety breeding.【Method】Using leaves from 3 key growth and development periods of B.masoniana as experimental materials，with Ara-bidopsis thaliana R2R3-MYB family proteins as reference sequences，members of the R2R3-MYB gene family from the B.masoniana genome database were identified using bioinformatics methods.Then predicted and analyzed their physico-chemical properties，chromosomal localization，phylogenetic relationships，gene structures，conserved motifs and pro-motercis-acting elements.Additionally，examined the expression patterns of 7 BmaMYBs genes in the leaf spot region and non-leaf spot region during 3 growth and development periods of B.masoniana through real-time fluorescence quantita-tive PCR.【Result】Atotal of 110 members of the R2R3-MYB gene family were identified from the genome of B.masoniana.These gene family members had amino acid quantity ranging from 128 to 870，molecular weights ranging from 14660.85 to 97435.93 Da，and theoretical isoelectric points（pI）ranging from 4.92 to 10.10.There were great differences among the members，with most being unstable hydrophobic proteins，and all of them located in the nucleus.The 110 R2R3-MYB family genes were distributed across all 15 chromosomes，with some genes concentrated on the same chro-mosome forming gene clusters.BmaMYBs contained 0-10 introns；approximately 94%of the members contained Motif 1，Motif 2 and Motif 3；and the promoter regions of R2R3-MYB gene family members contained a large number of light-responsive elements.During leaf development，BmaMYB10，BmaMYB18，BmaMYB38，BmaMYB53，BmaMYB97，Bma-MYB99 and BmaMYB109 genes were expressed in both leaf spot and non-leaf spot regions；relative expression level ofthe BmaMYB53 gene in the leaf spot region was as high as 19.41 to 131.99 times compared to that in non-leaf spot region.【Conclusion】In the genome of B.masoniana，110 members of the R2R3-MYB gene family are identified.The relative ex-pression level difference between the leaf spot region and non-leaf spot region is the greatest for BmaMYB53 gene，sug-gesting that this gene is a key regulator in the formation of leaf spots in B.masoniana.

Key words：Begonia masoniana；R2R3-MYB gene family；anthocyanins；leaf spot

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（32271939，31870692）

0引言

【研究意義】鐵十字秋海棠（Begonia masoniana）作為原產(chǎn)于我國(guó)的重要觀葉植物，因其葉片中央分布有紅褐色十字形斑紋而得名，葉斑隨發(fā)育時(shí)期不同而呈現(xiàn)粉紅、紅褐和深褐色，然而其彩斑形成機(jī)理仍不清楚。研究表明，花青苷的積累可能會(huì)影響秋海棠屬植物葉斑的形成（Wang et al.，2018）。在植物體內(nèi)眾多轉(zhuǎn)錄因子家族中，MYB被認(rèn)為是數(shù)量最多的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，廣泛參與調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育、次生代謝、逆境脅迫響應(yīng)等各項(xiàng)生命活動(dòng)，同時(shí)還能夠調(diào)控花青苷的生物合成（左鑫，2023）。MYB轉(zhuǎn)錄因子的特征是在N端有一段高度保守的MYB-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，包含1～4個(gè)串聯(lián)的、不完全重復(fù)的MYB重復(fù)區(qū)域（R1、R2和R3）。根據(jù)MYB結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和位置將MYB基因家族分為四大類，分別是1R-MYB（或MYB相關(guān)）、2R-MYB（R2R3-MYB）、3R-MYB（R1R2R3-MYB）和4R-MYB（Dubos et al.，2010）。R2R3-MYB是植物所特有，在MYB基因家族中數(shù)量最多，已被證實(shí)與植物組織生長(zhǎng)發(fā)育（Paz-Ares et al.，1987）、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（Stracke et al.，2001）、調(diào)節(jié)花青苷生物合成（Davies et al.，2012）、響應(yīng)逆境脅迫（崔曉娜等，2023）等過(guò)程相關(guān)。因此，對(duì)鐵十字秋海棠R2R3-MYB基因家族進(jìn)行鑒定并分析其表達(dá)模式，對(duì)探究鐵十字秋海棠葉斑形成的分子機(jī)制和葉色改良及新品種培育具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究發(fā)現(xiàn)，花青苷的合成在鐵十字秋海棠斑葉發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用（楊婷等，2021）?；ㄇ嘬帐侵参锝缰凶畲蟮囊活愃苄陨兀瑢儆陬慄S酮化合物家族，主要儲(chǔ)存于植物的中央液泡中，使得多種植物組織如根、莖、葉、花、果實(shí)和種子呈現(xiàn)不同的顏色（梁平和宋洪元，2014；梁玉鐲等，2022）。而花青苷的合成主要受兩類基因的調(diào)控：一類是編碼花青苷生物合成各種酶的結(jié)構(gòu)基因，另一類是起轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的調(diào)節(jié)基因（Tanaka and Ohmiya，2008；Zhang et al.，2014）。目前已報(bào)道的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因主要包括MYB、bHLH和WD40，其中MYB和bHLH蛋白既可以單獨(dú)調(diào)控花青苷的生物合成，也可以通過(guò)MYB-bHLH-WD40（MBW）形成三元復(fù)合物抑制或者激活相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)控花青苷的合成和分布（Ramsay and Glover，2005）。植物中第一個(gè)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子于1987年首次在玉米（Zea mays）中被鑒定，證實(shí)其功能與花青苷的合成密切相關(guān)（Paz-Ares et al.，1987）。隨著研究的深入，MYB基因家族被鑒定的物種數(shù)量日益增多，R2R3-MYB基因家族在不同物種中的成員數(shù)量也呈現(xiàn)出多樣性，例如在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中有126個(gè)（Stracke et al.，2001），水稻（Oryza sativa）有102個(gè)（Chen et al.，2006），大豆（Glycine max）有244個(gè)（許玲等，2015），番茄（Solanum lycopersicum）有127個(gè)（Li et al.，2016）。在大量植物中已發(fā)現(xiàn)存在對(duì)花青苷生物合成具有正向調(diào)控的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，例如對(duì)擬南芥的研究發(fā)現(xiàn)，S6亞組的成員（AtMYB75、AtMYB90、AtMYB113和AtMYB114）能正向調(diào)控花青苷的生物合成（Gonzalez et al.，2008）；菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.）的CmMYB6和CmbHLH2轉(zhuǎn)錄因子互作，可上調(diào)CmDFR基因的表達(dá)誘導(dǎo)花青苷積累，將CmMYB6基因轉(zhuǎn)入煙草中過(guò)表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)煙葉中花青苷含量急劇增加，從而證實(shí)CmMYB6基因是調(diào)控菊花花青素生物合成的重要基因（Liu et al.，2015）；文心蘭（Oncidium Gower Ramsay）中OgMYB1可以激活CHI和DFR基因的轉(zhuǎn)錄，從而誘導(dǎo)花青苷的合成（Chiou and Yeh，2008）。此外，矮牽牛（Petunia hybrida）的AN2（Quattrocchioetal.，1999）和AN4（Walker et al.，1999）以及牡丹（Paeonia suffruticosa）的PsMYB12（Gu etal.，2019）都是調(diào)控花青苷生物合成的轉(zhuǎn)錄激活子。另外，研究還揭示了能夠抑制花青苷生物合成的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，此類抑制子在模式植物擬南芥中已有廣泛研究，如S4亞組的成員AtMYB4、AtMYB7和AtMYB32（Kranz etal.，1998），在其他植物種類中此類抑制子亦被發(fā)現(xiàn)，例如矮牽牛的PhMYB27（Albert et al.，2014）、郁金香（Tulipa gesne-riana）的TgMYB4（Hu etal.，2024）等?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，已對(duì)擬南芥（Stracke et al.，2001）、水稻（Chen et al.，2006）、大豆（許玲等，2015）等許多物種開(kāi)展R2R3-MYB基因家族鑒定分析研究，尚未見(jiàn)有關(guān)鐵十字秋海棠R2R3-MYB基因家族鑒定的相關(guān)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以鐵十字秋海棠3個(gè)關(guān)鍵生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的葉片為試驗(yàn)材料，參考擬南芥R2R3-MYB家族蛋白序列，利用生物信息學(xué)方法從鐵十字秋海棠基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定出R2R3-MYB基因家族成員，對(duì)其理化性質(zhì)、染色體定位、系統(tǒng)發(fā)育、基因結(jié)構(gòu)、保守基序及啟動(dòng)子順式作用元件等進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)7個(gè)BmaMYBs基因在鐵十字秋海棠3個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育期中葉斑區(qū)和非葉斑區(qū)的表達(dá)模式，進(jìn)而探究R2R3-MYB基因家族在鐵十字秋海棠葉斑形成過(guò)程中的分子機(jī)制，為鐵十字秋海棠葉色改良及新品種培育提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

樣品采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院培養(yǎng)室的2年生鐵十字秋海棠健康植株，分別選取葉片3個(gè)關(guān)鍵生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期，即S1：葉長(zhǎng)4 cm；S2：葉長(zhǎng)8 cm；S3：葉長(zhǎng)12 cm（圖1）。主要試劑：FastPure Universal Plant Total RNA Isolation Kit、HiScript II Q RT Super-Mix for qPCR+gDNA wiper RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和AceQ?Universal SYBR qPCR Master Mix定量PCR檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2鐵十字秋海棠R2R3-MYB基因家族成員鑒定

從國(guó)家基因庫(kù)生命大數(shù)據(jù)平臺(tái)（https：//db.cngb.org/search/assembly/CNA0013975/）下載獲得鐵十字秋海棠基因組數(shù)據(jù)（Li et al.，2022）（基因組編號(hào)：CNA0013975），從TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.arabi-dopsis.org/browse/genefamily/index.jsp）下載獲得擬南芥R2R3-MYB家族蛋白序列。隨后，使用擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)中的R2R3-MYB蛋白序列進(jìn)行本地Blast搜索，查詢鐵十字秋海棠基因組數(shù)據(jù)庫(kù)得到MYB候選基因。然后通過(guò)SMART（http：//smart.embl.de/）和Pfam（http：//pfam.xfam.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證候選基因中MYB結(jié)構(gòu)域，排除不包含完整MYB保守結(jié)構(gòu)域的序列，確定最終成員。

1.3鐵十字秋海棠R2R3-MYB家族蛋白理化性質(zhì)分析

利用ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)R2R3-MYB家族成員進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析，使用Cell-PLoc 2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，通過(guò)TMHMM網(wǎng)站（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMH MM-2.0/）預(yù)測(cè)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域。

1.4鐵十字秋海棠R2R3-MYB基因家族染色體定位

通過(guò)分析基因組GFF文件獲取鐵十字秋海棠的R2R3-MYB家族基因在染色體上的具體位置信息，并進(jìn)行整理統(tǒng)計(jì)。利用TBtools中Gene Location Visua-lize from GTF/GFF功能將鐵十字秋海棠R2R3-MYB家族基因的起始位置、終止位置以及相應(yīng)染色體的總長(zhǎng)度信息結(jié)合，繪制染色體定位模式圖。

1.5系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

通過(guò)MEGA 11.0中Clustal W對(duì)鐵十字秋海棠與擬南芥的R2R3-MYB蛋白序列進(jìn)行多重比對(duì)?；诒葘?duì)結(jié)果，采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap設(shè)為1000次。最后，利用在線工具iTOL（https：//itol.embl.de/）對(duì)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行可視化、優(yōu)化和美化處理。

1.6鐵十字秋海棠R2R3-MYB家族基因結(jié)構(gòu)及蛋白保守基序分析

將鐵十字秋海棠R2R3-MYB家族蛋白序列上傳到Multiple Expectation Maximization for Motif Elicitation在線分析平臺(tái)（http：//meme-suite.org/meme/tools/meme），然后利用TBtools對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.7鐵十字秋海棠R2R3-MYB基因家族啟動(dòng)子分析

使用TBtools中的gtf/gff3 Sequences Extract工具提取鐵十字秋海棠R2R3-MYB基因家族起始密碼子ATG上游2000 bp的啟動(dòng)子序列，然后通過(guò)PlantCARE網(wǎng)站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測(cè)其順式作用元件，分析整理后再利用TBtools將結(jié)果可視化。

1.8實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

利用FastPure Universal Plant Total RNA Isola-tion Kit分別提取鐵十字秋海棠葉片葉斑區(qū)和非葉斑區(qū)的3個(gè)關(guān)鍵生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期（S1～S3）的總RNA，并使用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，以其為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，分析鐵十字秋海棠葉片葉斑區(qū)和非葉斑區(qū)的3個(gè)關(guān)鍵生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期相關(guān)BmaMYBs基因的表達(dá)模式。利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)基因的編碼區(qū)（CDS）特異性引物（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序參照AceQ?Universal SYBR qPCR Master Mix定量PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，每樣本設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)以及3次技術(shù)重復(fù)。選取Actin7為內(nèi)參基因（楊婷等，2021），所有基因的表達(dá)水平以內(nèi)參基因Actin7進(jìn)行均一化，使用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.9統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 25.0進(jìn)行顯著性分析，使用GraphPad Prism 9.0制圖。

2結(jié)果與分析

2.1鐵十字秋海棠R2R3-MYB基因家族成員鑒定結(jié)果

通過(guò)比對(duì)分析擬南芥和鐵十字秋海棠R2R3-MYB基因家族蛋白的氨基酸序列和保守結(jié)構(gòu)域，從鐵十字秋海棠中共鑒定出130個(gè)MYB基因家族成員，依據(jù)結(jié)構(gòu)域類型進(jìn)行分類，其中屬于1R-MYB類型有13個(gè)，R2R3-MYB類型有110個(gè)，3R-MYB類型有6個(gè)，而4R-MYB類型僅有1個(gè)。由于R2R3-MYB是MYB基因家族中數(shù)量最多的一類，并且在植物轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究中扮演重要角色，因此，本研究選擇鐵十字秋海棠110個(gè)R2R3-MYB基因家族成員作為研究對(duì)象，為方便識(shí)別和引用，根據(jù)在基因組中的序列號(hào)順序?qū)⑵涿麨锽maMYB1～BmaMYB110。

2.2鐵十字秋海棠R2R3-MYB基因家族蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果

通過(guò)ExPASy對(duì)鐵十字秋海棠110個(gè)R2R3-MYB家族蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析，結(jié)果如表2所示。鐵十字秋海棠R2R3-MYB基因家族成員編碼的氨基酸數(shù)量為128～870個(gè)，差異較大；分子量為14660.85～97435.93 Da；理論等電點(diǎn)（pI）為4.92～10.10，其中64個(gè)BmaMYBs蛋白的pI小于7，為酸性蛋白；108個(gè)BmaMYBs蛋白不穩(wěn)定系數(shù)大于40，為不穩(wěn)定蛋白；102個(gè)BmaMYBs蛋白親/疏水性指數(shù)小于-0.5，表明絕大多數(shù)為疏水性蛋白。根據(jù)Cell-PLoc 2.0預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，110個(gè)BmaMYBs均定位在細(xì)胞核。通過(guò)TMHMM對(duì)110個(gè)BmaMYBs蛋白進(jìn)行蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，有108個(gè)蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域，僅2個(gè)蛋白（BmaMYB17和BmaMYB23）存在明顯的跨膜結(jié)構(gòu)域。

2.3鐵十字秋海棠R2R3-MYB基因家族染色體定位

為探究鐵十字秋海棠R2R3-MYB家族基因的進(jìn)化關(guān)系，利用TBtools對(duì)110個(gè)R2R3-MYB家族基因進(jìn)行染色體定位，根據(jù)基因位置信息獲得R2R3-MYB基因在鐵十字秋海棠染色體上的定位圖（圖2），鐵十字秋海棠110個(gè)R2R3-MYB家族基因在15條染色體上均有分布，但每條染色體上分布的基因數(shù)量各不相同，數(shù)量范圍為3～13。部分R2R3-MYB家族基因在同一染色體上的相同區(qū)域集中分布，例如BmaMYB29、BmaMYB30、BmaMYB31和BmaMYB32基因在12號(hào)染色體（Chr12）下端緊密分布。

2.4鐵十字秋海棠R2R3-MYB家族基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果

通過(guò)MEGA 11.0中Clustal W對(duì)鐵十字秋海棠R2R3-MYB家族110個(gè)蛋白氨基酸序列和擬南芥R2R3-MYB家族（Dubos etal.，2010）126個(gè)蛋白氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，并采用NJ構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果（圖3）顯示，根據(jù)擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子的分組方法（Dubos etal.，2010），將鐵十字秋海棠R2R3-MYB劃分為33個(gè)亞組，用B1～B33表示。鐵十字秋海棠B1亞組（BmaMYB15、BmaMYB68、BmaMYB76、BmaMYB86和BmaMYB100）與擬南芥S21亞組（AtMYB52、AtMYB54和AtMYB69）聚為一類；B19亞組（BmaMYB10、BmaMYB18、BmaMYB38、Bma-MYB53、BmaMYB97、BmaMYB99和BmaMYB109）與擬南芥S6亞組（AtMYB75、At-MYB90、AtMYB113和AtMYB114）屬于同一分支；B21亞組（BmaMYB55和BmaMYB73）與擬南芥S7亞組（AtMYB12和AtMYB111）聚為一類。

2.5鐵十字秋海棠R2R3-MYB家族基因結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白保守基序分析結(jié)果

對(duì)鐵十字秋海棠R2R3-MYB基因家族成員進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果如圖4-B所示。由于鐵十字秋海棠GFF文件并未對(duì)其非編碼區(qū)（UTR）進(jìn)行注釋，因此圖中僅展示了各基因家族成員之間的CDS和內(nèi)含子區(qū)域。鐵十字秋海棠R2R3-MYB基因家族的內(nèi)含子數(shù)量為0～10個(gè)，約63%的成員有2個(gè)內(nèi)含子，3個(gè)成員（BmaMYB51、BmaMYB69和BmaMYB110基因）無(wú)內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。

蛋白保守基序分析結(jié)果（圖4-A）顯示，特異性基序數(shù)量設(shè)置為12，分別為Motif 1～Motif 12。約92%成員的Motif分布在蛋白序列的N端，少數(shù)成員的Motif分布在序列中間以及C端。另外，約94%的成員均含有Motif 1、Motif 2和Motif 3，表明這3個(gè)Motifs是鐵十字秋海棠R2R3-MYB家族中較為保守的基序。

2.6鐵十字秋海棠R2R3-MYB基因家族啟動(dòng)子順式作用元件分析結(jié)果

由圖5可知，所有啟動(dòng)子均含有大量光響應(yīng)元件，推測(cè)其對(duì)光誘導(dǎo)會(huì)產(chǎn)生響應(yīng)。此外，該基因家族成員啟動(dòng)子的順式作用元件還包含激素響應(yīng)元件和逆境脅迫響應(yīng)元件。說(shuō)明R2R3-MYB基因家族的表達(dá)受到復(fù)雜機(jī)制的調(diào)控。

2.7 BmaMYBs基因表達(dá)模式分析結(jié)果

研究表明，花青素苷的合成在鐵十字秋海棠葉斑生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用（楊婷等，2021）。對(duì)位于B19亞組中的7個(gè)可能參與調(diào)控鐵十字秋海棠花青苷積累的基因BmaMYB10、BmaMYB18、Bma-MYB38、BmaMYB53、BmaMYB97、BmaMYB99和Bma-MYB109進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，分析這7個(gè)基因在鐵十字秋海棠葉片3個(gè)關(guān)鍵生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期中葉斑區(qū)和非葉斑區(qū)的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果（圖6）顯示，BmaMYB10基因在葉片3個(gè)關(guān)鍵生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期葉斑區(qū)和非葉斑區(qū)的相對(duì)表達(dá)量均無(wú)顯著差異（Pgt;0.05，下同）。在S1時(shí)期，葉斑區(qū)和非葉斑區(qū)BmaMYB18、BmaMYB38和BmaMYB99基因的相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異；在S2和S3時(shí)期，葉斑區(qū)BmaMYB18和Bma-MYB38基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于非葉斑區(qū)（Plt;0.05，下同），而B(niǎo)maMYB99基因在葉斑區(qū)的相對(duì)表達(dá)量卻顯著低于非葉斑區(qū)。S1～S3時(shí)期中，Bma-MYB53和BmaMYB97基因在葉斑區(qū)的相對(duì)表達(dá)量從S1到S3時(shí)期呈逐漸升高趨勢(shì)，且在3個(gè)時(shí)期葉斑區(qū)2個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于非葉斑區(qū)，葉斑區(qū)BmaMYB53基因的相對(duì)表達(dá)量較非葉斑區(qū)高達(dá)19.41～131.99倍。3個(gè)時(shí)期葉斑區(qū)BmaMYB109基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于非葉斑區(qū)，在S2時(shí)期差異最大，為非葉斑區(qū)的3.16倍。

3討論

本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法，首次對(duì)鐵十字秋海棠R2R3-MYB基因家族成員進(jìn)行鑒定，共鑒定出110個(gè)R2R3-MYB家族基因，其數(shù)量少于擬南芥（126個(gè)）（Stracke et al.，2001）、玉米（200個(gè)）（Dias et al.，2003）和番茄（127個(gè)）（Li etal.，2016），多于水稻（102個(gè)）（Chen et al.，2006）和黃瓜（99個(gè)）（Li etal.，2012）。研究表明，在馬鈴薯（李元銘，2021）、假儉草（蔣宇佳等，2023）和黃瓜（郭玉婷和杜長(zhǎng)霞，2024）中大多數(shù)R2R3-MYB家族基因分布在染色體的兩端，這種現(xiàn)象可能跟基因的串聯(lián)復(fù)制有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)鐵十字秋海棠中也存在類似現(xiàn)象，110個(gè)家族成員分布在15條染色體上，且大部分基因家族成員聚集在染色體的兩端形成基因簇，推測(cè)通過(guò)基因串聯(lián)復(fù)制可擴(kuò)大基因家族數(shù)量以便發(fā)揮更為豐富的功能。

R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物功能研究中發(fā)揮重要作用，尤其在調(diào)控花青苷生物合成方面（Dubos et al.，2010）。Zuluaga等（2008）研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中屬于不同亞族的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子能激活或抑制花青苷生物合成途徑中的關(guān)鍵基因，而S6亞組成員對(duì)花青苷的生物合成具有正調(diào)控。宋楊等（2015）對(duì)越橘（Vaccinium corymbosum）中21個(gè)R2R3-MYB基因家族構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在S4、S5和S6亞組中有6個(gè)基因與花青苷生物合成有關(guān)。本研究將鐵十字秋海棠110個(gè)R2R3-MYB家族成員與擬南芥的126個(gè)R2R3-MYB家族成員建立系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，并參照擬南芥R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的分組方式，將鐵十字秋海棠110個(gè)R2R3-MYB分為33個(gè)亞組，其中有23個(gè)亞組成員可以歸類到擬南芥亞家族中。鐵十字秋海棠B1亞組（BmaMYB15、BmaMYB68、BmaMYB76、BmaMYB86和BmaMYB100）與擬南芥S21亞組（AtMYB52、AtMYB54和AtMYB69）聚為一類，擬南芥S21亞組成員是致力于纖維細(xì)胞細(xì)胞壁增厚的正調(diào)節(jié)因子（Zhong et al.，2008），因?qū)儆谕粊喗M的蛋白通常具有相似且保守的功能，因此推測(cè)鐵十字秋海棠B1亞組成員也具有相似功能。擬南芥中S7亞組（AtMYB12和AtMYB111）參與調(diào)控所有組織中黃酮醇的生物合成，鐵十字秋海棠B21亞組（BmaMYB55和BmaMYB73）與擬南芥S7亞組聚為一類，表明鐵十字秋海棠B21亞組成員也可能參與調(diào)控黃酮醇的生物合成（Dubos et al.，2010）。位于鐵十字秋海棠B19亞組中的BmaMYB53等轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥中調(diào)控花青苷合成的MYB轉(zhuǎn)錄因子（S6亞組）聚為一類。位于同一分支兩個(gè)物種的基因家族成員可能具有部分相同功能，擬南芥S6亞組可調(diào)控花青苷的合成（Gonzalez et al.，2008），推測(cè)鐵十字秋海棠B19亞組也參與花青苷物質(zhì)的合成。崔衛(wèi)華和管開(kāi)云（2013）研究發(fā)現(xiàn)，花青素苷的合成分布可能會(huì)影響秋海棠葉片的斑紋結(jié)構(gòu)，因此推測(cè)B19亞組成員是影響鐵十字秋海棠葉斑形成的關(guān)鍵調(diào)控因子。

鐵十字秋海棠R2R3-MYB基因家族成員啟動(dòng)子順式作用元件主要包含3類：光響應(yīng)元件、激素響應(yīng)元件和逆境脅迫響應(yīng)元件。光響應(yīng)元件可能與鐵十字秋海棠為陰生植物，在弱光環(huán)境中更適合生存等因素有關(guān)。薛珍珍等（2023）對(duì)鐵十字秋海棠GASA基因家族啟動(dòng)子順式作用元件進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)除了光響應(yīng)元件以外，GASA基因家族啟動(dòng)子還包含與環(huán)境信號(hào)有關(guān)的低溫和干旱脅迫響應(yīng)元件，以及與植物激素響應(yīng)有關(guān)的順式作用元件，本研究結(jié)果與之類似，推測(cè)R2R3-MYB基因家族在鐵十字秋海棠生長(zhǎng)發(fā)育及抵御非生物脅迫等方面發(fā)揮重要作用。

花青苷生物合成途徑中調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子高表達(dá)能導(dǎo)致植物呈現(xiàn)深色。桃葉的紅色是由于花青苷積累造成，通過(guò)分析在紅色和綠色葉片相關(guān)PpMYBs基因的相對(duì)表達(dá)量差異，發(fā)現(xiàn)PpMYB10.4基因能調(diào)節(jié)桃葉中花青苷色素沉著（Yinget al.，2014）；對(duì)蝴蝶蘭（Phalaenopsis orchids）的黑色花斑進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在PeMYB11基因啟動(dòng)子中存在1個(gè)可以插入到PeMYB11基因上游調(diào)控區(qū)的反轉(zhuǎn)座子，造成PeMYB11基因表達(dá)量增加超過(guò)2倍，從而使黑色花瓣中花青苷高度積累（Hsu et al.，2019）；在矮牽牛中，PaMYB33/AN2基因?qū)儆赑11（S6）亞組，參與類黃酮生物合成，在色素沉著過(guò)程中該基因的表達(dá)水平升高（Chen et al.，2021）。本研究中，對(duì)可能與鐵十字秋海棠花青苷生物合成有關(guān)的7個(gè)BmaMYBs基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BmaMYB10基因在鐵十字秋海棠葉片葉斑區(qū)和非葉斑區(qū)的相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異，BmaMYB18、BmaMYB38、BmaMYB97、BmaMYB99和BmaMYB109基因在葉斑區(qū)和非葉斑區(qū)的相對(duì)表達(dá)量雖然有差異，但5個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量較低，推測(cè)這5個(gè)基因并非關(guān)鍵調(diào)控基因。BmaMYB53基因在葉斑區(qū)的表達(dá)量隨著生長(zhǎng)發(fā)育階段發(fā)生明顯變化，其相對(duì)表達(dá)量逐漸升高，葉斑區(qū)該基因的相對(duì)表達(dá)量較非葉斑區(qū)高19.41～131.99倍，且與鐵十字秋海棠葉片生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，葉斑的顏色呈逐漸由淺變深的變化趨勢(shì)一致，因此推測(cè)Bma-MYB53在鐵十字秋海棠葉斑形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，具有調(diào)控花青苷生物合成的功能，可為進(jìn)一步探究鐵十字秋海棠葉斑形成機(jī)理提供理論依據(jù)。

4結(jié)論

在鐵十字秋海棠基因組中鑒定出110個(gè)R2R3-MYB基因家族成員，通過(guò)對(duì)鐵十字秋海棠與擬南芥的R2R3-MYB家族成員構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)獲得的7個(gè)與花青苷合成分布有關(guān)的BmaMYBs基因，其中，3個(gè)葉片關(guān)鍵生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的葉斑區(qū)與非葉斑區(qū)BmaMYB53基因的相對(duì)表達(dá)量差異最大，推測(cè)該基因是調(diào)控鐵十字秋海棠葉斑形成的關(guān)鍵基因。

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（責(zé)任編輯 李洪艷）