摘要：【目的】評估不同鹽度條件下序批式反應(yīng)器（SBR）和序批式生物膜反應(yīng)器（SBBR）的氨氮去除效果及其表面生物膜特性，探究高鹽條件下能實現(xiàn)高效去除氨氮的微生物菌群結(jié)構(gòu)，為海水養(yǎng)殖過程中微生物高效硝化技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用提供參考依據(jù)。【方法】SBR和SBBR接種相同的活性污泥后，模擬海水養(yǎng)殖廢水處理，并在未加鹽的條件下首次啟動，保持15 d的穩(wěn)定運行后將反應(yīng)器內(nèi)的鹽度逐漸增加到1.0%、2.0%、3.0%和4.0%，然后通過掃描電子顯微鏡—能譜分析、N-（1-萘基）-乙二胺光度法、納氏試劑光度法和宏基因組測序分析對每個鹽度階段不同反應(yīng)器的硝化性能、微生物群落結(jié)構(gòu)及代謝基因豐度變化進行評價。【結(jié)果】SBR硝化性能受鹽度的影響較明顯，在高鹽（3.0%和4.0%）條件下的氨氮去除率僅為43.18%和37.97%；鹽度變化對SBBR的硝化功能無明顯影響，在4.0%的高鹽條件下仍能實現(xiàn)高效硝化（氨氮去除率在98.00%以上）。相對于SBR，SBBR中微生物群落的物種豐度及多樣性更高、群落結(jié)構(gòu)相對更穩(wěn)定，尤其是冰冷桿菌屬（Gelidibacter）和亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）的相對豐度不受鹽度變化的影響；副球菌屬（Paracoccus）、陶厄氏菌屬（Thauera）及假單胞菌屬（Pseudomonas）等反硝化細(xì)菌在SBBR中也具有較高的相對豐度。相對于SBR，反硝化關(guān)鍵基因norB和nosZ在SBBR中的豐度更高，且具有更強的協(xié)同效應(yīng)?！窘Y(jié)論】以海綿生物膜填料為載體的SBBR能在高鹽條件下實現(xiàn)短期啟動硝化脫氮及維持微生物群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，促使SBBR存在多種脫氮途徑，同時表現(xiàn)出更強的脫氮基因協(xié)同效果。SBBR的脫氮效果較傳統(tǒng)活性污泥法有明顯提升，為高鹽條件下海水養(yǎng)殖廢水脫氮處理提供了有效的解決方案。

關(guān)鍵詞：序批式生物膜反應(yīng)器；海水養(yǎng)殖廢水；硝化脫氮；鹽度；微生物群落

中圖分類號：S969.38文獻標(biāo)志碼：A文章編號：2095-1191（2024）09-2824-11

Construction of sequential batch biofilm reactor in marine aqua?culture wastewater and its nitrogen removal performance andmicrobial community structure analysis

WEN Xue-zhe1，2，CUI Liang2*，LIN Hua-li1，2，ZHU Wen-qiang1，2，SHAO Zong-ze1，2，WANG Yong2*

（1School of Advanced Manufacturing，F(xiàn)uzhou University，Jinjiang，F(xiàn)ujian 362251，China；2Key Laboratory ofMarine Biogenetic Resources，Third Institute of Oceanography，Ministry of Natural Resources，Xiamen，F(xiàn)ujian 361005，China）

Abstract：【Objective】Evaluation of ammonia nitrogen removal efficiency and biofilm characteristics in sequential batch reactor（SBR）and sequential batch biofilm reactor（SBBR）under varying salinity conditions was conducted，mi-crobial community structure for efficient ammonia nitrogen removal in high-salinity conditions was investigated to pro-vide reference for the development and application of high-efficiency microbial nitrification technology in marine aquacul-ture.【Method】SBR and SBBR were used to inoculate the same activated sludge in order to simulate the treatment condi-tions of mariculture wastewater.Both sets of reactors were initially started without the addition of salt and operatedsteadily for 15 d.Subsequently，the salinity in the reactors was gradually increased to 1.0%，2.0%，3.0%and 4%.The ni-trification performance，microbial community structure and metabolic gene abundance of each reactor stage were evalua-ted using scanning electron microscopy-energy dispersive spectroscopy，N-（1-naphthyl）-ethylenediamine photometry，Nessler’s reagent photometry and metagenomic sequencing analysis.【Result】The salinity greatly affected the nitrification performance of SBR.In a high salt environment（3.0%and 4.0%），the removal rate of ammonia nitrogen was only 43.18%and 37.97%for SBR.The salinity change had no obvious effect on thenitration function of SBBR，SBBR could still achieve efficient nitrification with a removal rate of ammonia nitrogen of 98.00%even at a salinity of 4.0%.Com-pared to SBR，the microbial community in SBBR demonstrated higher species abundance and diversity，with a relatively more stable community structure.Notably，the relative abundances of Gelidibacter and Nitrosomonas were not affected by salinity changes.Denitrification bacteria such as Paracoccus，Thauera and Pseudomonas also exhibited higher relative abundance in SBBR.The key denitrification genes norB and nosZ showed higher abundance in SBBR compared to SBR，and showed stronger synergistic effects.【Conclusion】SBBR using sponge biofilm carriers can achieve short-term nitrifica-tion and nitrogen removal startup under high-salinity conditions，while maintaining the stability of microbial community structure.This facilitates multiple nitrogen removal pathways and enhances the synergistic effects of nitrogen removal genes.Compared to conventional activated sludge processes，the denitrification performance of SBBR is greatly im-proved，offering an effective solution for nitrogen removal in seawater aquaculture wastewater under high-salinity condi-tions.

Key words：sequencing batch biofilm reactor；marine aquaculture wastewater；nitrification and nitrogen removal；salinity；microbial community

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（91851203）

0引言

【研究意義】隨著全球海水養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，減少有害廢水排放及確保自然資源可持續(xù)開發(fā)利用已成為海水養(yǎng)殖廢水治理與污染控制領(lǐng)域亟待解決的核心問題。魚蝦排泄物和飼料殘留物產(chǎn)生的氮（主要是氨）、磷及懸浮物等破壞了海洋環(huán)境的生態(tài)平衡，限制了海水養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展（Song et al.，2018），尤其是近岸海域的富營養(yǎng)化對人類健康已構(gòu)成嚴(yán)重威脅（Tang et al.，2014；Budria and Candolin，2015）。硝化作用在海水養(yǎng)殖廢水處理過程中扮演著重要角色，由硝化菌介導(dǎo)氨氮轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，最終轉(zhuǎn)化為硝酸鹽（朱振興等，2023）。自養(yǎng)硝化無需額外地補充有機碳源，且氧化作用所產(chǎn)生的能量可用于自養(yǎng)硝化菌的生長（de Boer and Kowalchuk，2001），更符合“雙碳”的目標(biāo)要求，也有利于實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略部署。因此，亟待開發(fā)并優(yōu)化海水養(yǎng)殖廢水生態(tài)處理新工藝，減少含氮化合物污染，以確保海水養(yǎng)殖的可持續(xù)健康發(fā)展?！厩叭搜芯窟M展】近年來，越來越多的養(yǎng)殖廢水處理研究聚焦于生物脫氮，并針對性研發(fā)出多種有效的微生物制劑（Zhou et al.，2016；Gao et al.，2017）。如紅球菌屬（Rhodococcus sp.）（Chen et al.，2012）、甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌（Bacillus methylotrophicus）（Zhang et al.，2012）及海桿菌屬（Marinobacter sp.）（Zheng et al.，2012）的微生物制劑可通過硝化/反硝化作用，有效去除無機氮（Hong et al.，2017），即通過微生物制劑調(diào)節(jié)氮平衡（包括轉(zhuǎn)化和吸收）已成為減少水產(chǎn)養(yǎng)殖水體氮污染的有效方法。Wang和Gu（2010）研究發(fā)現(xiàn)，添加嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）RS058株、沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris）GH642株和凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）NJ105株能顯著提高凡納濱對蝦的最終體重、日增重及相對增重；Shan等（2016）研究證實，溶藻弧菌（Vibrio algi-nolyticus）VZ5微生物制劑對對蝦養(yǎng)殖水體中的氮毒性降解有顯著效果；Zhu等（2019）將海洋著色菌（Marichromatium gracile）YL28株應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖氮污染原位修復(fù)，通過反硝化和同化性硝酸鹽還原，能在7 d內(nèi)去除99.96%的亞硝酸鹽（1 mg/L），同時有95.60%的銨（3.5 mg/L）被直接同化。但在高鹽條件下，微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性和穩(wěn)定性均會受到影響，進而影響其硝化活性（Uygur，2006）。Sudarno等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鹽度（NaCl）從0 g/L增加到50 g/L時，氨的去除效率從94%降至48%。究其原因可能是鹽度對活性污泥脫氫酶活性產(chǎn)生抑制作用，而導(dǎo)致活性污泥脫氮系統(tǒng)不穩(wěn)定、沉降性能差及微生物群落損失（Gomes etal.，2018）。在高鹽度條件下，活性污泥的沉降性能、沉降效率和機械完整性也會降低（Li etal.，2020）。Campos等（2002）研究表明，將鹽度從0.5%提升至2.0%時，活性污泥的污泥容積指數(shù)（SVI）由110 mL/g降至70 mL/g；Hong等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，隨鹽度的增加，活性污泥微生物生長速率下降、細(xì)胞內(nèi)外結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，導(dǎo)致其代謝活性降低；Li等（2021）研究表明，當(dāng)鹽度達(dá)3.0%時，污泥絮體被破壞，污泥沉降性能變差?！颈狙芯壳腥朦c】至今，針對海水養(yǎng)殖廢水氨氮去除效率的研究主要集中在脫氮速率、微生物群落多樣性等方面（Fan and Sun，2024），在高鹽條件下通過維持微生物群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性達(dá)到高效去除氨氮的研究相對較少。【擬解決的關(guān)鍵問題】評估不同鹽度水平下序批式反應(yīng)器（Sequencing batch reactor，SBR）和序批式生物膜反應(yīng)器（Sequencing batch biofilm reactor，SBBR）的氨氮去除效果及其表面生物膜特性，探究高鹽條件下能實現(xiàn)高效去除氨氮的微生物菌群結(jié)構(gòu)，為海水養(yǎng)殖過程中微生物高效硝化技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1活性污泥及人工合成廢水

活性污泥從福建廈門市污水處理廠的回流池出口獲得，轉(zhuǎn)移至工作體積為3.9 L的實驗室反應(yīng)器中序批式運行1個月。進行生物增強試驗前將活性污泥曝氣2 d，以去除其儲存的多余碳源。人工合成廢水成分：NH4Cl 285.0 mg/L，KH2PO4 22.0 mg/L，NaHCO3 875.0 mg/L，MgSO4·7H2O 75.0 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 5.0 mg/L，CaCl2 5.0 mg/L，MnCl2·2H2O 0.1 mg/L，ZnCl2 70.0μg/L，H3BO3 6.0μg/L，Na2MoO4·2H2O 6.0μg/L，NiCl2·6H2O 24.0μg/L，CuCl2·2H2O 2.0μg/L，Na2SeO3·5H2O 8.0μg/L，Na2WO4·2H2O 0.5μg/L。

1.2反應(yīng)器設(shè)置

SBR和SBBR均由甲基丙烯酸甲酯（PMMA）制成，工作體積3.9 L，直徑12 cm，高度34 cm（圖1）。SBBR是在SBR的基礎(chǔ)上添加聚酯纖維材質(zhì)的海綿生物膜填料（彭秋瑜等，2023；王年等，2023）。反應(yīng)器在室溫（25℃）下穩(wěn)定運行，通過底部擴散器鼓泡后，溶解氧濃度保持在10 mg/L左右。每種反應(yīng)器在每個鹽度梯度下均設(shè)3個平行，且在取樣時分上、中、下部3個取樣點，混合樣品經(jīng)0.45 mm濾紙過濾后進行分析。在持續(xù)60 d的試驗周期中，SBR和SBBR的運行周期不變，每個周期的循環(huán)時間均為8 h，包括注水10 min，正常好氧反應(yīng)420 min，沉淀40 min，倒水10min。給料期間，以蠕動泵將人工合成廢水（3.0 L）引入SBR，倒水期間則將3.0 L的上清液從反應(yīng)器中排出。對污水處理廠收集的活性污泥與人工合成廢水進行馴化，其鹽度逐漸增加（0%、1.0%、2.0%、3.0%和4.0%）且每個馴化步驟保持15 d，以獲得較高的生物活性。記錄馴化過程中氨態(tài)氮（NH4+-N）去除性能的變化情況。

1.3活性污泥自養(yǎng)硝化馴化

SBR和SBBR的鹽度控制在0%～4.0%。SBR在不加鹽的條件下首次啟動，并保持15 d的穩(wěn)定運行；然后將鹽度逐漸增加到1.0%、2.0%、3.0%和4.0%。在不同鹽度階段，硝化污泥均穩(wěn)定馴化15 d，以適應(yīng)鹽度的增加。

1.4生物膜自養(yǎng)硝化馴化

傳統(tǒng)的活性污泥會隨著鹽度的增加其沉降性能降低，導(dǎo)致反應(yīng)器生物量流失，進而降低反應(yīng)器的氨氮去除性能（彭秋瑜等，2023；楊名帆等，2023）。為了測試生物膜對活性污泥的氨氮去除效果及其脫氮途徑，在容積3.9 L、溫度（25.0±0.5）℃的反應(yīng)器中進行不同批次試驗，每組設(shè)3個平行。將海綿復(fù)合材料（孔隙率95%，側(cè)長10±1 mm）制成的生物膜載體引入SBBR中，以附著活性污泥，所用活性污泥與馴化試驗的污泥同批次。投加填料洗滌3次后，將活性污泥裝入各反應(yīng)器中；每個反應(yīng)器加入相同濃度的NaCl溶液，其鹽度逐漸增加到1.0%、2.0%、3.0%和4.0%，每個馴化步驟保持15d，以獲得較高的生物活性。待各鹽度下反應(yīng)器脫氮性能穩(wěn)定后，取填料進行掃描電子顯微鏡掃描分析，觀察填料表面生物膜的附著情況及其表面形態(tài)。同時，向每個反應(yīng)器注入3.0 L人工合成廢水，持續(xù)處理24h，每隔2h從反應(yīng)器中采集樣品進行分析。

1.5檢測分析方法

硝態(tài)氮（NO3--N）采用SHIMADZU UV-1780紫外可見分光光度計進行測定，而硝態(tài)氮（NO2--N）和NH4+-N采用DR1900便攜式分光光度計，分別通過N-（1-萘基）-乙二胺光度法和納氏試劑光度法進行測定。同時，以掃描電子顯微鏡（LEO-1530）檢測SBBR生物膜的表面形態(tài)變化，從收集的生物膜填料上隨機剪取適宜大小的膜塊（約50mm2），用導(dǎo)電膠將剪取的膜塊黏貼固定在掃描電子顯微鏡樣品臺上，再使用離子濺射儀在膜塊樣品表面噴鍍金，使其導(dǎo)電性符合掃描電子顯微鏡觀測要求，最后進行掃描電子顯微鏡—能譜分析。

1.6 DNA提取及宏基因組測序分析

分別于馴化第15 d（鹽度1.0%）、第30 d（鹽度2.0%）、第45 d（鹽度3.0%）及第60 d（鹽度4.0%），從反應(yīng)器中采集污泥樣品，完成基因組DNA抽提后以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA，通過Covaris M220儀將DNA片段化至400bp左右。采用NEXT-flexTM Rapid DNA-Seq Kit試劑盒篩選去除接頭自連片段，經(jīng)PCR擴增構(gòu)建PE文庫，然后在Illumina NovaSeq平臺完成高通量測序。對原始序列（Raw reads）進行拆分、質(zhì)量剪切及去除污染等質(zhì)控處理，經(jīng)拼接組裝與基因預(yù)測后，對得到的基因進行宏基因組分析及物種分類與功能注釋。宏基因組測序分析委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.7統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)在美吉生物云平臺（https：//cloud.major-bio.com）上完成統(tǒng)計分析，具體操作如下：（1）采用Mothur（http：//www.mothur.org/wiki/Calculators）計算Alpha多樣性指數(shù)；（2）通過典范對應(yīng)性分析（CCA）調(diào)查廢水理化指標(biāo)對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響；（3）基于Spearman相關(guān)系數(shù)|r|gt;0.6且Plt;0.05挑選物種功能注釋結(jié)果進行相關(guān)分析。

2結(jié)果與分析

2.1 SBBR生物膜的表征結(jié)果

分別于馴化第1 d（鹽度0%）、第15 d（鹽度1.0%）、第30 d（鹽度2.0%）、第45 d（鹽度3.0%）及第60 d（鹽度4.0%）取SBBR中的填料進行掃描電子顯微鏡掃描分析，觀察填料表面生物膜的附著情況及其表面形態(tài)，結(jié)果顯示，未掛膜的填料表面呈蜂窩狀，孔隙規(guī)則清晰（圖2-A）；填料掛膜后其表面孔徑明顯變小，孔隙間有大量污泥附著（圖2-B～圖2-E），有利于微生物附著及穩(wěn)定生長，且長時間內(nèi)不會分解。污泥附著量隨鹽度的增加而降低，表明鹽度會影響污泥的吸附性能，還可能導(dǎo)致微生物多樣性下降。此外，填料在不同鹽度條件下存在一定程度的扭曲、變形或斷裂。

2.2 SBBR的脫氮效果

接種活性污泥后，SBR和SBBR在未添加有機碳源的條件下均可成功實現(xiàn)硝化作用，但二者間存在明顯差異。不同鹽度條件下，SBR和SBBR出水口水樣的氨氮、總氮變化趨勢如圖3所示。在不添加海綿生物膜填料的SBR中，出水氨氮濃度波動較大，在各鹽度梯度變化初期其硝化功能明顯降低，氨氮去除率為5.17%～21.35%（圖3-A）。SBR的氨氮去除率在1.0%和2.0%鹽度下可達(dá)93.97%左右，但隨著鹽度的增加，SBR的硝化能力進一步受到抑制，無法在15 d內(nèi)恢復(fù)至初始性能，因此在3.0%和4.0%鹽度下的氨氮去除率僅為43.18%和37.97%。這是由于鹽度的增加極大降低了污泥沉降性能，導(dǎo)致?lián)Q水周期內(nèi)有大量硝化菌流失，致使SBR呈現(xiàn)出不可逆的硝化能力減弱現(xiàn)象。

相對于SBR，SBBR表現(xiàn)出更穩(wěn)定且高效的硝化性能，在各鹽度條件下的出水氨氮濃度始終維持在0.2 mg/L以內(nèi)（圖3-B），說明鹽度變化對SBBR的硝化功能無明顯影響。試驗期間的鹽度已達(dá)到傳統(tǒng)活性污泥的抑制閾值（3.0%～4.0%）（Wang et al.，2016），但SBBR的硝化性能始終保持穩(wěn)定，氨氮去除率均在98.00%以上。前人研究認(rèn)為，1.0%的鹽度梯度變化通常需要2～3周的適應(yīng)期（Cui et al.，2006），明顯長于本研究的馴化周期，可能是由于海綿生物膜填料能有效富集污泥和微生物，且SBBR生物膜上的污泥停留時間更長，強化了硝化菌對氨氮的去除效果。

整個試驗期間，SBR并未呈現(xiàn)明顯的總氮下降趨勢（圖3-C），而SBBR中出現(xiàn)總氮部分去除現(xiàn)象（圖3-D），平均總氮去除率為28.67%。由此推測，曝氣期間SBBR填料內(nèi)部可能存在局部微氧區(qū)，致使富集污泥中的反硝化菌可利用人工合成廢水中的電子供體及部分海綿生物膜填料進行混合營養(yǎng)型反硝化作用（Huang and Lee，2021），從而達(dá)到去除總氮的效果。

2.3微生物群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

海綿生物膜填料的加入強化了氨氮去除生物處理效果，與SBBR附著的微生物分布及其種類密切相關(guān)。為此，分別對各鹽度條件下的SBR活性污泥和SBBR海綿生物膜填料進行取樣，通過Illumina NovaSeq平臺完成高通量測序分析。按照97%的序列相似性將質(zhì)控獲得的有效序列（Clean reads）聚類為OTUs（蘇俊宇等，2022），結(jié)果（圖4）顯示，鹽度的增加會對微生物群落多樣性產(chǎn)生明顯影響，且SBBR海綿生物膜填料樣品較SBR活性污泥樣品獲得更多的OTUs，表明海綿生物膜填料上的微生物群落更具特異性，可能是海綿生物膜填料結(jié)構(gòu)的易富集性導(dǎo)致SBBR中存在能適應(yīng)高鹽條件的菌種。由表1可知，SBR和SBBR各樣品的覆蓋度均接近100.0%，表明收集到的基因序列能很好地表征微生物群落結(jié)構(gòu)。綜合Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)可知，SBBR海綿生物膜填料上微生物群落的物種豐度及多樣性較SBR活性污泥更高。

在門分類水平上，SBR與SBBR微生物群落的優(yōu)勢菌門均包括變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidota）、綠彎菌門（Chloroflexi）、放線菌門（Actinobacteria）和Planctomycetota（圖5），其中變形菌門和擬桿菌門在Zhang等（2016）、Yan等（2017）、Chen等（2018）針對活性污泥的相關(guān)研究也屬于優(yōu)勢菌門。SBBR中放線菌門和擬桿菌門的相對豐度較高，可能是由于海綿生物膜填料的多孔結(jié)構(gòu)更有利于其累積生物量。此外，在SBBR中發(fā)現(xiàn)少量廣古菌門（Euryarchaeota），廣古菌門包含豐富種類的厭氧氨氧化菌，可能是海綿生物膜填料中的局部缺氧環(huán)境為其生長創(chuàng)造了有利條件（Li etal.，2013），由此推測SBBR中的少部分氨氮是通過厭氧氨氧化而非硝化去除。

在屬分類水平（圖6）上，SBR微生物群落結(jié)構(gòu)中以亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）的相對豐度最高，鹽度變化對其相對豐度有明顯影響，在1.0%和2.0%鹽度條件下的相對豐度差異不明顯（11.23%～12.52%），但鹽度增加至3.0%和4.0%后，其相對豐度急劇下降，分別為7.98%和3.54%。亞硝化單胞菌屬菌株可代謝氮，是在污水處理系統(tǒng)中的常見菌株。SBBR微生物群落結(jié)構(gòu)中以冰冷桿菌屬（Gelidi-bacter）的相對豐度最高，在不同鹽度（1.0%、2.0%、3.0%和4.0%）條件下分別為8.5%、10.25%、14.04%和12.03%；其次是未分類厭氧繩菌目（unclassi-fied o Anaerolineales）（相對豐度分別為7.37%、2.63%、2.17%和0.30%）、未分類綠彎菌門（unclassi-fied p Chloroflexi）（相對豐度分別為4.25%、3.33%、3.89%和1.57%）、硝化螺旋菌屬（Nitrospira）（相對豐度分別為2.28%、1.04%、0.76%和0.35%）及亞硝化單胞菌屬（相對豐度分別為0.53%、0.44%、1.12%和4.74%）。雖然SBBR微生物群落中亞硝化單胞菌屬和硝化螺旋菌屬的相對豐度低于SBR微生物群落，但SBBR的物種多樣性和種群數(shù)量明顯高于SBR，尤其是冰冷桿菌屬上升為絕對優(yōu)勢菌屬。冰冷桿菌屬是常見的海洋低溫好氧菌，可在高鹽條件下消耗氨氮（Bowman et al.，1997）。此外，未分類厭氧繩菌目屬于厭氧菌（Li etal.，2021），可在厭氧條件下利用硫化物進行反硝化作用?？梢?，在SBBR中存在多種脫氮途徑。

2.4微生物群落氮代謝基因豐度變化情況

氮代謝基因可合理解釋SBR和SBBR的硝化作用，氮代謝相關(guān)酶編碼基因的豐度變化見圖7。在好氧體系中，氨氮首先被氨單加氧酶（amoA）氧化為羥胺，然后進一步被羥胺氧化還原酶（hao）轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮（Kuypers et al.，2018）。值得注意的是，SBBR中amoA和hao基因的豐度隨鹽度的增加呈明顯下降趨勢（7306 Reads→3102 Reads，25040 Reads→11422 Reads）?？梢姡琒BR經(jīng)梯度鹽度馴化后具有較高的硝化性能，SBBR在短程高鹽脅迫下雖然硝化相關(guān)基因豐度下降，但仍保留有完整的硝化基因以維持穩(wěn)定的硝化性能。

反硝化涉及多種形式的氮，NO3（-）通過膜靠硝酸鹽還原酶G/H/I（narG/H/I）、亞硝酸還原酶K（nirK）、一氧化氮還原酶B/C（norB/C）、一氧化二氮還原酶（nosZ）等氮代謝相關(guān)酶依次還原為NO2（-）、NO、N2O和N2。nirS基因在2種反應(yīng)器中的豐度基本相似；narG基因在SBR中的豐度較SBBR更高，可能與SBBR中活性污泥在海綿生物膜填料上的富集情況有關(guān)，通過降低與氧氣接觸的比表面積，而表現(xiàn)出較弱的NO2（-）-N去除性能；nirK基因同樣在SBR中的豐度更高，與Li等（2021）的研究結(jié)果一致，與nirK基因主要分配在硝化螺旋菌屬有關(guān)；norB和nosZ基因均表現(xiàn)為SBBR中的豐度高于SBR，由此推測SBBR具有較高的N2O去除性能，有助于減少溫室氣體的排放，也進一步佐證SBBR出現(xiàn)總氮降低現(xiàn)象。SBR與SBBR在好氧且不添加碳源的條件下均保留有反硝化的全套基因，且因SBBR的海綿生物膜填料存在局部微氧區(qū)而表現(xiàn)出更明顯的反硝化效果。

3討論

在“雙碳”目標(biāo)大背景下，實行高效低碳處理海水養(yǎng)殖過程產(chǎn)生的含氮廢水是確保海洋漁業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的根本要求。本研究通過評估不同鹽度條件下SBR和SBBR的氨氮去除效果及其表面生物膜特性，探究高鹽條件下實現(xiàn)高效去除氨氮的微生物菌群結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，相對于SBR，SBBR在高鹽度條件下具有更高的微生物群落豐度及多樣性，在各高鹽度馴化周期（15 d內(nèi)）下能成功實現(xiàn)高效硝化作用，氨氮去除率均在98.00%以上，且在未額外添加碳源的前提下也能達(dá)到去除總氮的效果。

已有研究表明，在鹽度從0 g/L上升至20 g/L的過程中，傳統(tǒng)活性污泥系統(tǒng)對氮的去除效率及微生物多樣性越來越低，是由于鹽度抑制了活性污泥的脫氫酶活性，且鹽度增加會導(dǎo)致反應(yīng)系統(tǒng)不穩(wěn)定，活性污泥沉降性能變差，反硝化菌群嚴(yán)重流失（Gomes et al.，2018）。本研究通過比較SBR與SBBR的微生物群落Alpha多樣性指數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SBBR中的微生物群落物種豐度明顯高于SBR，且隨著鹽度的增加，2個反應(yīng)器中的微生物群落多樣性均受到影響，但SBBR的微生物群落結(jié)構(gòu)相對更穩(wěn)定，可能是由于SBBR中的亞硝化單胞菌屬和硝化螺旋菌屬在高鹽環(huán)境下仍能維持穩(wěn)定的數(shù)量及豐度（相對豐度分別為4.74%和0.35%），但這2種菌屬在SBR中的相對豐度隨鹽度的增加分別降至3.50%和0.06%。此外，SBBR中的優(yōu)勢菌屬——冰冷桿菌屬與傳統(tǒng)硝化菌具有相似功能，但在SBR中具有獨特硝化功能的菌屬隨鹽度的增加而逐漸消失。由于海綿生物膜填料上的微生物群落穩(wěn)定性得到改善，因此SBBR在高鹽條件下表現(xiàn)出更穩(wěn)定的硝化性能。

本研究還發(fā)現(xiàn)，在不添加碳源且進行連續(xù)曝氣的情況下SBBR出現(xiàn)總氮降低現(xiàn)象（總氮去除率29.00%），可能與反應(yīng)器中存在反硝化細(xì)菌和厭氧氨氧化細(xì)菌有關(guān)。反硝化細(xì)菌最初存在于SBR和SBBR接種的活性污泥中，但隨著鹽度的增加其在SBR中的相對豐度逐漸下降，并最終消失。SBBR中的反硝化細(xì)菌具有較高的相對豐度，主要包含副球菌屬（Paracoccus）、陶厄氏菌屬（Thauera）及假單胞菌屬（Pseudomonas），其中副球菌屬是一種能利用有機碳和還原態(tài)硫進行反硝化的混合營養(yǎng)反硝化細(xì)菌（Huang and Lee，2021）。SBBR中還富集了具有不完全反硝功能的反硝化細(xì)菌，包括Quisquiliibacte-rium、Luteimonas、Porticocccus、Ralstonia、Roseimari-tima及Nitratireductor等（相對豐度lt;0.01%）（Ren et al.，2022）。SBBR中的海綿生物膜填料為反硝化細(xì)菌創(chuàng)造了低溶解氧環(huán)境及富集條件，因此反硝化細(xì)菌可在高鹽環(huán)境下有效附著，最終促進反硝化過程及強化對總氮的去除效果。

氮代謝基因能很好解釋SBR與SBBR的硝化差異。SBR經(jīng)鹽度梯度馴化后保持較高的硝化性能，SBBR在高鹽脅迫下雖然部分硝化基因豐度有所下降，但仍維持穩(wěn)定的硝化作用。在反硝化過程中，SBBR表現(xiàn)出較高的norB和nosZ基因豐度，故推測其具有較強的N2O去除能力（常堯楓等，2022）。此外，2種反應(yīng)器均保留了完整的反硝化基因組，SBBR因海綿生物膜填料中存在局部微氧區(qū)（Li et al.，2013；Huang and Lee，2021），而表現(xiàn)出更明顯的反硝化效果。

4結(jié)論

以海綿生物膜填料為載體的SBBR能在高鹽條件下實現(xiàn)短期啟動硝化脫氮及維持微生物群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，促使SBBR存在多種脫氮途徑，同時表現(xiàn)出更強的脫氮基因協(xié)同效果。SBBR的脫氮效果較傳統(tǒng)活性污泥法有明顯提升，為高鹽條件下海水養(yǎng)殖廢水脫氮處理提供了有效的解決方案。

參考文獻（References）：

常堯楓，郭萌蕾，謝軍祥，謝嘉瑋，陳重軍.2022.厭氧氨氧化脫氮除碳功能菌群結(jié)構(gòu)及代謝途徑［J］.中國環(huán)境科學(xué)，42（3）：1138-1145.［Chang Y F，Guo M L，Xie J X，Xie J W，Chen C J.2022.The structure and metabolic pathway of functional bacteria for nitrogen and carbon removal in anammox［J］.China Environmental Science，42（3）：1138-1145.］doi：10.19674/j.cnki.issn 1000-6923.2022.0045.

彭秋瑜，劉如玲，李萌，陳進進，劉健，佘宗蓮.2023.序批式反應(yīng)器改良工藝對海水養(yǎng)殖廢水中氮和磺胺嘧啶去除及微生物群落分析［J］.中國海洋大學(xué)學(xué)報，53（12）：146-154.［Peng Q Y，Liu R L，Li M，Chen J J，Liu J，She Z L.2023.The study of nitrogen and sulfadiazine removal and the microbial community in modified sequencing batch reactor treating mariculture wastewater［J］.Periodical of Ocean University of China，53（12）：146-154.］doi：10.16441/j.cnki.hdxb.20220188.

蘇俊宇，陳辰，李偉，雷駱，祝駿賢，羅來福，耿露露，史偉，李健松，張繼平，朱新平.2022.2種充氣模式中華鱉工廠化養(yǎng)殖水體水質(zhì)及微生物群落結(jié)構(gòu)［J］.廣東海洋大學(xué)學(xué)報，42（5）：45-53.［Su J Y，Chen C，Li W，Lei L，Zhu J X，Luo L F，Geng L L，Shi W，Li J S，Zhang J P，Zhu X P.2022.Water quality and microbial community structure ofindoor industrial aquaculture system for Chinese softshellturtles（Pelodiscus sinensis）under two aeration methods［J］.Journal of Guangdong Ocean University，42（5）：45-53.］doi：10.3969/j.issn.1673-9159.2022.05.006.

王年，郁小娟，駱楠，王玲，王昭玥，肖冰冰，陳俊律，宋增福.2023.玻璃輕石序批式生物膜反應(yīng)器構(gòu)建參數(shù)優(yōu)化及水產(chǎn)養(yǎng)殖污水脫氮性能研究［J］.南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，54（9）：2721-2731.［Wang N，Yu X J，Luo N，Wang L，Wang Z Y，Xiao B B，Chen J L，Song Z F.2023.Optimization of con-struction parameters of glass pumice sequencing batch bio-film reactor and study on denitrification performance of aquaculture wastewater［J］.Journal of Southern Agricul-ture，54（9）：2721-2731.］doi：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.09.023.

楊名帆，石婷宇，羅國芝，譚洪新，劉文暢.2023.厭氧/缺氧/好氧序批式反應(yīng)器處理養(yǎng)殖尾水的脫氮除磷性能研究［J］.漁業(yè)現(xiàn)代化，50（1）：9-18.［Yang M F，Shi T Y，Luo G Z，Tan H X，Liu W C.2023.Study on the removal of nitrogen and phosphorus by A2/O-SBR process in treating aquacul-ture tail water［J］.Fishery Modernization，50（1）：9-18.］doi：10.3969/j.issn.1007-9580.2023.01.002.

朱振興，江興龍，劉勇.2023.高效脫氮降磷菌株的篩選及在工廠化鰻鱺養(yǎng)殖中的應(yīng)用［J］.漁業(yè)現(xiàn)代化，50（2）：32-39.［Zhu Z X，Jiang X L，Liu Y.2023.Screening of a high-efficient nitrogen and phosphorus removal functional strain and application research in eel intensive culture［J］.Fishery Modernization，50（2）：32-39.］doi：10.3969/j.issn.1007-9580.2023.02.005.

Bowman J P，McCammon S A，Brown M V，Nichols D S，McMeekin T A.1997.Diversity and association of psy-chrophilic bacteria in Antarctic sea ice［J］.Applied and Environmental Microbiology，63（8）：3068-3078.doi：10.1128/aem.63.8.3068-3078.1997.

Budria A，Candolin U.2015.Human-induced eutrophication maintains high parasite prevalence in breeding threespine stickleback populations［J］.Parasitology，142（5）：719-727.doi：10.1017/S0031182014001814.

Campos J L，Mosquera-Corral A，Sánchez M，Méndez R，Lema J M.2002.Nitrification in saline wastewater with high ammonia concentration in an activated sludge unit［J］.Water Research，36（10）：2555-2560.doi：10.1016/S0043-1354（01）00467-5.

Chen P Z，Li J，Li Q X，Wang Y C，Li S P，Ren T Z，Wang L G.2012.Simultaneous heterotrophic nitrification and aerobic denitrification by bacterium Rhodococcus sp.CPZ24［J］.Bioresource Technology，116：266-270.doi：10.1016/j.bior-tech.2012.02.050.

Chen Y J，He H J，Liu H Y，Li H R，Zeng G M，Xia X，Yang C P.2018.Effect of salinity on removal performance and activated sludge characteristics in sequencing batch reac-tors［J］.Bioresource Technology，249：890-899.doi：10.1016/j.biortech.2017.10.092.

Cui Y W，Peng Y Z，Peng C Y，Gan X Q，Ye L.2006.Achie-ving biological nitrogen removal via nitrite by salt inhibi-tion［J］.Water Scienceamp;Technology，53（6）：115-122.doi：10.2166/wst.2006.183.

de Boer W，Kowalchuk G A.2001.Nitrification in acid soils：Micro-organisms and mechanisms［J］.Soil Biology and Biochemistry，33（7-8）：853-866.doi：10.1016/S0038-0717（00）00247-9.

Fan L L，Sun F L.2024.Nitrogen metabolism potential in bio-film microbial communities：Potential applications in the mariculture wastewater treatment［J］.Aquacultural Engi-neering，104：102387.doi：10.1016/j.aquaeng.2023.102387.

Gao F，Li Z W，Chang Q B，Gao M C，She Z L，Wu J，Jin C J，Zheng D，Guo L，Zhao Y G，Wang S.2017.Effect of flor-fenicol on performance and microbial community of asequencing batch biofilm reactor treating mariculture wastewater［J］.Environmental Technology，39（3）：363-372.doi：10.1080/09593330.2017.1301567.

Gomes M B，Gonzales-Limache E E，Sousa S T P，Dellagnezze B M，Sartoratto A，Silva L C F，Gieg L M，Valoni E，Souza R S，Torres A P R，Sousa M P，de Paula S O，Silva C C，Oliveira V M.2018.Exploring the potential of halophilic bacteria from oil terminal environments for biosurfactant production and hydrocarbon degradation under high-salinity conditions［J］.International Biodeteriorationamp;Biodegradation，126：231-242.doi：10.1016/j.ibiod.2016.08.014.

Hong J M，Li W B，Lin B，Zhan M C，Liu C D，Chen B Y.2013.Deciphering the effect of salinity on the performance of submerged membrane bioreactor for aquaculture of bac-terial community［J］.Desalination，316：23-30.doi：10.1016/j.desal.2013.01.015.

Hong X，Chen Z W，Zhao C G，Yang S P.2017.Nitrogen trans-formation under different dissolved oxygen levels by the anoxygenic phototrophic bacterium Marichromatium gra-cile［J］.World Journal of Microbiology and Biotechnology，33：113.doi：10.1007/s 11274-017-2280-z.

Huang X W，Lee P H.2021.Shortcut nitrification/denitrifica-tion through limited-oxygen supply with two extreme COD/N-and-ammonia active landfill leachates［J］.Chemi-cal Engineering Journal，404：126511.doi：10.1016/j.cej.2020.126511.

Kuypers M M M，Marchant H K，Kartal B.2018.The microbial nitrogen-cycling network［J］.Nature Reviews Microbio-logy，16：263-276.doi：10.1038/nrmicro.2018.9.

Li J W，Peng Y Z，Gao R T，Yang L，Deng LY，Zhao Q，Liu Q Y，Li X Y，Zhang Q，Zhang L.2021.Highly enriched anammox within anoxic biofilms by reducing suspended sludge biomass in a real-sewage A2/O process［J］.Water Research，194：116906.doi：10.1016/j.watres.2021.116906.

Li J X，Ma Z P，Gao M M，Wang Y K，Yang Z J，Xu H，Wang X H.2020.Enhanced aerobic granulation at low tempera-ture by stepwise increasing of salinity［J］.Science of the Total Environment，722：137660.doi：10.1016/j.scitotenv.2020.137660.

Li Y Q，Zhang R H，Chen C，Liu G Q，He Y F，Liu X Y.2013.Biogas production from co-digestion of corn stover and chicken manure under anaerobic wet，hemi-solid，and solid state conditions［J］.Bioresource Technology，149：406-412.doi：10.1016/j.biortech.2013.09.091.

Ren Z Q，Wang H，Zhang L G，Du X N，Huang B C，Jin R C.2022.A review of anammox-based nitrogen removal tech-nology：From microbial diversity to engineering applica-tions［J］.Bioresource Technology，363：127896.doi：10.1016/j.biortech.2022.127896.

Shan H W，Bao W Y，Ma S，Wei D P，Gao L.2016.Ammonia and nitrite nitrogen removal in shrimp culture by Vibrio alginolyticus VZ5 immobilized in SA beads［J］.Aquacul-ture International，24：357-372.doi：10.1007/s 10499-015-9930-7.

Song W L，Li Z P，Liu F，Ding Y，Qi P S，You H，Jin C.2018.Effective removal of ammonia nitrogen from waste seawa-ter using crystal seed enhanced struvite precipitation tech-nology with response surface methodology for process optimization［J］.Environmental Science and Pollution Re-search，25：628-638.doi：10.1007/s 11356-017-0441-0.

Sudarno U，Winter J，Gallert C.2011.Effect of varying sali-nity，temperature，ammonia and nitrous acid concentra-tions on nitrification of saline wastewater in fixed-bed reac-tors［J］.Bioresource Technology，102（10）：5665-5673.doi：10.1016/j.biortech.2011.02.078.

Tang W Z，Shan B Q，Cui J G，Zhao Y，Zhang W Q.2014.Effects of nitrogen pollution on periphyton distribution，elemental composition and assemblage shifts in river eco-systems［J］.Clean-Soil Air Water，43（10）：1375-1380.doi：10.1002/clen.201300927.

Uygur A.2006.Specific nutrient removal rates in saline waste-water treatment using sequencing batch reactor［J］.Process Biochemistry，41：61-66.doi：10.1016/j.procbio.2005.03.068.

Wang R，Zheng P，Ding A Q，Zhang M，Ghulam A，Yang C，Zhao H P.2016.Effects of inorganic salts on denitrifying granular sludge：The acute toxicity and working mecha-nisms［J］.Bioresource Technology，204：65-70.doi：10.1016/j.biortech.2015.12.062.

Wang Y B，Gu Q 2010.Effect of probiotics on white shrimp（Penaeus vannamei）growth performance and immune response［J］.Marine Biology Research，6（3）：327-332.doi：10.1080/17451000903300893.

Yan Z，He H J，Yang C P，Zeng G M，Luo L，Jiao P P，Li H R，Lu L.2017.Biodegradation of 3，5-dimethyl-2，4-dichloro-phenol in saline wastewater by newly isolated Penicillium sp.yz11-22N2［J］.Journal of Environmental Sciences，57：211-220.doi：10.1016/j.jes.2017.02.012.

Zhang Q L，Liu Y，Ai G M，Miao L L，Zheng H Y，Liu Z P.2012.The characteristics of a novel heterotrophic nitri-fication-aerobic denitrification bacterium，Bacillus methy-lotrophicus strain L7［J］.Bioresource Technology，108：35-44.doi：10.1016/j.biortech.2011.12.139.

Zhang Y，Li B，Xu R X，Wang G X，Zhou Y，Xie B.2016.Effects of pressurized aeration on organic degradation effi-ciency and bacterial community structure of activated sludge treating saline wastewater［J］.Bioresource Techno-logy，222：182-189.doi：10.1016/j.biortech.2016.10.005.

Zheng H Y，Liu Y，Gao X Y，Ai G M，Miao L L，Liu Z P.2012.Characterization of a marine origin aerobic nitrifying-denitrifying bacterium［J］.Journal of Bioscience and Bio-engineering，114（1）：33-37.doi：10.1016/j.jbiosc.2012.02.025.

Zhou S L，Huang T L，Zhang H H，Zeng M Z，Liu F，Bai S Y，Shi J C，Qiu X P，Yang X.2016.Nitrogen removal charac-teristics of enhanced in situ indigenous aerobic denitrifica-tion bacteria for micro-polluted reservoir source water［J］.Bioresource Technology，201：195-207.doi：10.1016/j.bior-tech.2015.11.041.

Zhu B T，Chen S C，Zhao C G，Zhong W H，Zeng R Y，Yang S P.2019.Effects of Marichromatium gracile YL28 on the nitrogen management in the aquaculture pond water［J］.Bioresource Technology，292：121917.doi：10.1016/j.bior-tech.2019.121917.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）