【摘 要】目的：探討新生大鼠缺氧缺血性腦損傷模型中TRPC3通路介導(dǎo)的神經(jīng)自噬作用。方法：7日齡Sprague-Dawley（SD）雄性幼鼠隨機(jī)分為4組，每組20只，分別為Sham組、HIBD組、HIBD+Vector組和HIBD+TRPC3組。HIBD+Vector組和HIBD+TRPC3組在誘導(dǎo)HIBD模型前24 h，分別將Vector或TRPC3注射到左側(cè)腦室中。評(píng)估各組幼鼠腦梗死面積、神經(jīng)系統(tǒng)評(píng)分、腦水腫體積、神經(jīng)元凋亡和線粒體自噬。體外將小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系（HT22）分為以下6組：Control組、OGD/R組、OGD/R+TRPC3組、OGD/R+NC組、OGD/R+si-Pink1組和OGD/R+TRPC3+si-Pink1組。除Control組外，其他組使用氧氣-葡萄糖剝奪/再灌注（Oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）方法建立體外腦缺血再灌注模型。通過線粒體膜電位的檢測(cè)線粒體損傷情況。結(jié)果：與Sham組相比，HIBD組和HIBD+Vector組顯示出較大的梗死面積、腦含水量、神經(jīng)學(xué)評(píng)分和神經(jīng)元凋亡（Plt;0.05）。HIBD+TRPC3組的梗死面積、腦含水量、神經(jīng)學(xué)評(píng)分和神經(jīng)元凋亡較HIBD+Vector組明顯降低（Plt;0.05）。與Sham組相比，HIBD組和HIBD+Vector組線粒體自噬相關(guān)蛋白PTEN誘導(dǎo)假定激酶1（PTEN induced putative kinase 1，Pink1）、E3泛素連接酶（Parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase，Parkin）和微管相關(guān)蛋白輕鏈3（light chain 3，LC3）Ⅱ的表達(dá)水平增加（Plt;0.05）。與HIBD+Vector組相比，HIBD+TRPC3組Pink1、Parkin和Lc3Ⅱ的表達(dá)水平進(jìn)一步增加（Plt;0.05）。體外實(shí)驗(yàn)顯示，TRPC3上調(diào)可以強(qiáng)烈增加Pink1、Parkin的表達(dá)和Lc3Ⅱ/Lc3Ⅰ比值，以及減少選擇性自噬接頭蛋白（sequestosome-1，p62）的表達(dá)。Pink1沉默可以部分阻止TRPC3對(duì)線粒體自噬的影響。TRPC3上調(diào)增加了健康線粒體的數(shù)量，減少了受損線粒體的數(shù)量，提高了HT-22細(xì)胞的生存率。然而，Pink1沉默阻止了TRPC3對(duì)線粒體功能和增殖能力的恢復(fù)。結(jié)論：TRPC3通過激活Pink1/Parkin通路介導(dǎo)的線粒體自噬，在HIBD早期階段中發(fā)揮了重要的保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】新生兒；缺血缺氧性腦??；典型的瞬時(shí)受體電位3；線粒體自噬

【中圖分類號(hào)】R722 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2023-03-06

缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic braindamage，HIBD）是新生兒死亡和神經(jīng)系統(tǒng)殘疾的主要原因[1]。研究這種疾病的發(fā)病機(jī)制并開發(fā)更有效和實(shí)用的治療方案是圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)的研究重點(diǎn)。自噬是神經(jīng)元的正常生理過程，阻斷基底自噬會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物模型中的神經(jīng)元死亡[2]。此外，自噬是維持神經(jīng)元平衡的必要條件，在HIBD情況下，適度的線粒體自噬對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有保護(hù)作用[3]。典型的瞬時(shí)受體電位3（transient receptor potential channels 3，TRPC3）作為Ca2+通道，在腦細(xì)胞外間隙、神經(jīng)元和血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，敲除神經(jīng)元TRPC3通道與腦血流受損和神經(jīng)元活動(dòng)的高度瞬間變化相關(guān)[5]。還有研究發(fā)現(xiàn)，TRPC3作為線粒體Ca2+負(fù)荷的調(diào)控因子，其激活促進(jìn)過量Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜通透化，進(jìn)而激活線粒體自噬將受損的線粒體清除[6-7]。然而，目前尚不清楚TRPC3介導(dǎo)的線粒體自噬是否參與HIBD病理過程。在本研究中，通過建立新生大鼠HIBD模型，初步研究了TRPC3是否參與了HIBD的病理過程及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物7日齡Sprague-Dawley（SD）雄性幼鼠購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，體質(zhì)量（22±2） g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK（上海）2019-005。將大鼠隨機(jī)分為4組，每組20只，分別為Sham組、HIBD組（2只死亡）、HIBD+Vector組（3只死亡）和HIBD+TRPC3組（3只死亡）。所有大鼠置于溫度（22±2）℃、濕度50%～60%，12 h/12 h明暗循環(huán)的標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組處理 HIBD組、HIBD+Vector組和HIBD+TRPC3組參照文獻(xiàn)方法建立HIBD模型[8]，具體操作為：幼鼠用異氟烷完全麻醉（3%～4%用于誘導(dǎo)，1%～2%用于維持），并在解剖顯微鏡下，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，用8～0縫線在近端和遠(yuǎn)端結(jié)扎，然后從中間切開以防止血管再生。手術(shù)后，將幼鼠置于37 ℃的暖室中30 min以恢復(fù)；隨后，將它們放置在具有37 ℃絕緣墊的低氧室中，并以1 L/min的流速引入純氮?dú)?，以將低氧的氧濃度保持?%。缺氧60 min后，將幼鼠放回母親身邊休息，自由攝取母乳。相比之下，Sham組左側(cè)頸總動(dòng)脈不被結(jié)扎和不暴露于缺氧環(huán)境中，在37 ℃的暖箱中短暫休息后，將幼鼠放回其母親身邊，讓其自由攝取母乳。

通過將TRPC3 cDNA克隆到pcDNA3.1載體（美國(guó)Invitrogen公司）中獲得TRPC3 表達(dá)載體pcDNA3-TRPC3 質(zhì)粒（TRPC3），構(gòu)建的序列經(jīng)DNA測(cè)序驗(yàn)證。HIBD+Vector組和HIBD+TRPC3組在誘導(dǎo)HIBD模型前24 h，將幼鼠麻醉并固定在定位器上，將Hamilton微型注射器插入腦橋后1.0 mm，中線側(cè)2.0 mm，顱骨表面腹側(cè)3.5 mm，將pcDNA3-NC載體（Vector）或TRPC3（20 nmol/L，12 μL）在5 min內(nèi)注射到左側(cè)腦室中。注射前后幼鼠的行為無任何變化。

1.2.2 腦水腫的測(cè)量 HIBD后24 h，幼鼠在麻醉下被安樂死。迅速取出大腦，然后將大腦分為同側(cè)和對(duì)側(cè)半球。立即用電子秤測(cè)量2個(gè)半球的濕重；然后將半球在100 ℃的烤箱中加熱48 h，得到干重。腦含水量的計(jì)算公式：腦含水量（%）=（1-干重/濕重）×100%。

1.2.3 梗死體積分析 采用2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）評(píng)估腦梗死面積。HIBD后24 h，幼鼠在麻醉下被安樂死，并收集腦組織。在-20 ℃下冷凍15 min后，取成年大鼠的腦基質(zhì)，切成5個(gè)3 mm厚的冠狀切片。采集染色圖像后，用Image J測(cè)量和分析白色梗死區(qū)和紅色非梗死區(qū)的面積。梗死區(qū)的計(jì)算：梗死區(qū)百分比=（右半球尺寸-左半球紅色尺寸）/右半球尺寸×100%。

1.2.4 神經(jīng)系統(tǒng)缺損評(píng)分的評(píng)估 在幼鼠安樂死之前，對(duì)神經(jīng)功能缺損評(píng)分進(jìn)行評(píng)估[8]。0分反映了正常的行為；1分反映了未能完全伸出右前爪；2分表示向右盤旋；3分表示向右跌倒；4分表示缺乏自發(fā)行走和意識(shí)水平低下；5分表示動(dòng)物死亡。課題組在分析中排除了得分為0或5的實(shí)驗(yàn)性幼鼠。

1.2.5 蘇木精和曙紅（HE）染色、TUNEL細(xì)胞凋亡試驗(yàn)和電鏡檢查 HIBD后24 h，用正常生理鹽水+4%多聚甲醛（0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.4）灌注心肌。將腦組織在上述固定器中放置48 h，嵌入石蠟中，然后切成切片（5 μm），根據(jù)操作手冊(cè)進(jìn)行HE染色。使用光學(xué)顯微鏡觀察海馬組織中神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)水腫、染色疏松和核固縮情況。對(duì)于TUNEL檢測(cè)，將切片與TUNEL檢測(cè)液在37 ℃下孵育1 h，然后根據(jù)TUNEL檢測(cè)法用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。在熒光顯微鏡下計(jì)算每組每個(gè)組織的TUNEL 陽(yáng)性核的數(shù)量和細(xì)胞凋亡率。從梗死區(qū)取出皮質(zhì)，用2.5% 戊二醛固定。使用JEM-1400PLUS透射電子顯微鏡（日本電子公司）獲得大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞中線粒體周圍自噬體的超結(jié)構(gòu)圖像。

1.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)和處理 小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系（HT22）來自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。將HT22細(xì)胞以2×105 個(gè)/孔的密度平均接種于6/96孔板中，用于進(jìn)一步研究。HT22 細(xì)胞在含10% 胎牛血清的Dulbecco’s ModififiedEagle’s Medium（DMEM，美國(guó)Hyclone公司）中培養(yǎng)。將細(xì)胞分為以下6 組：Control 組、OGD/R 組、OGD/R+TRPC3 組、OGD/R+NC組、OGD/R+si-Pink1組和OGD/R+TRPC3+si-Pink1組。除Control組外，其他組使用氧氣-葡萄糖剝奪/再灌注（Oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）方法，建立體外腦缺血再灌注模型[9]。OGD/R+si-Pink1組在建立OGD/R模型前24 h，用Pink1 特異性小干擾RNA（si-Pink1）序列（5'-CCAATTGACAGGCCATAAA-3'）轉(zhuǎn)染HT22細(xì)胞。OGD/R+TRPC3組在建立OGD/R模型前24 h，用TRPC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HT22細(xì)胞。OGD/R+TRPC3+si-Pink1組在建立OGD/R模型前24 h，用TRPC3質(zhì)粒和si-Pink1轉(zhuǎn)染HT22細(xì)胞。OGD/R+NC 組在建立OGD/R 模型前24 h，用Vector 和si-NC 轉(zhuǎn)染HT22細(xì)胞。si-Pink1和si-NC均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2.7 免疫熒光染色 對(duì)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，幼鼠的大腦在0.9%生理鹽水灌注后迅速取出，用4%多聚甲醛在4 ℃固定24 h，在30%蔗糖溶液中脫水48 h，然后在-80 ℃冷凍。將大腦切片（20 μm）在4 ℃封閉緩沖液中用LC3B兔單克隆抗體（1∶2 000，英國(guó)Abcam 公司）和HSP60 兔多克隆抗體（1∶500，美國(guó)Servicebio公司）一起孵育過夜。用PBS洗滌后，將腦切片與相應(yīng)的二抗在室溫下孵育1 h。腦切片用DAPI（美國(guó)Servicebio公司）染色15 min，用PBS洗滌3次，每次5 min，對(duì)于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞在固定、包埋、制備、透化和封閉后，在4 ℃封閉緩沖液中用Tomm20兔單克隆抗體（1∶2 000，英國(guó)Abcam公司）和Parkin兔單克隆抗體（1∶1 500，英國(guó)Abcam公司）一起孵育過夜。用PBS洗滌后，將樣品在37 ℃下浸入二抗中1 h。用PBS沖洗樣品3次，每次10 min，在37 ℃下用將細(xì)胞核染色2 h。然后用熒光顯微鏡觀察結(jié)果（日本Nikon公司）。

1.2.8 體外線粒體膜電位的檢測(cè) 根據(jù)制造商的說明[10]，JC-1可以在健康線粒體中聚集并發(fā)出紅色熒光，而在去極化的線粒體中發(fā)出綠色熒光。用JC-1檢測(cè)試劑（北京Solarbio公司）處理后，用熒光顯微鏡獲得熒光圖像。

1.2.9 體內(nèi)和體外蛋白質(zhì)印跡 體內(nèi)和體外海馬細(xì)胞在含PMDF的冷RIPA緩沖液中勻漿10 min，通過高速離心獲得總蛋白。在通過比辛可寧酸分析（北京Solaibao公司）定量后，將30 μg蛋白質(zhì)在10%～12%（w/v）硫酸鹽-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠上電泳2 h，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（美國(guó)Millipore Corp公司）上約1.5 h。將膜在37 ℃下在5%脫脂乳中浸泡1.5 h。在含有吐溫20的Tris緩沖鹽水中洗滌10 min后將膜浸泡在抗線粒體自噬標(biāo)志蛋白線粒體體外膜移位酶20（translocase of outer mitochondrial membrane20，Tomm20）（1∶5 000，英國(guó)Abcam 公司）、微管相關(guān)蛋白輕鏈3（lightchain 3，LC3）（1∶2 000，英國(guó)Abcam公司）、選擇性自噬接頭蛋白（sequestosome-1，p62）（1∶20 000，英國(guó)Abcam公司）、熱休克蛋白-60（human heat shock protein 60，HSP60）（1∶500，美國(guó)Servicebio公司）、PTEN誘導(dǎo)假定激酶1（PTEN inducedputative kinase 1，Pink1）（1∶5 000，美國(guó)Bio Vision公司）、E3泛素連接酶（parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase，Parkin）（1∶1 000，美國(guó)Cell Signaling 公司）、TRAC3（1∶1 000，美國(guó)Proteintech公司）和β-actin（1∶2 000，北京ZSGB-BIO公司）稀釋的初級(jí)抗體一起孵育過夜。將膜洗滌3次，并在37 ℃下用山羊抗兔IgG （1∶5 000，安諾倫（北京）生物科技有限公司）滲透1.5 h。用TBST洗滌3次，每次10 min，使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光溶液和Amersham Imager 600 檢測(cè)膜上的蛋白質(zhì)表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0進(jìn)行所有的統(tǒng)計(jì)分析。采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)計(jì)量資料的正態(tài)性，檢驗(yàn)結(jié)果確認(rèn)為正態(tài)分布。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）形式表達(dá)，多組間比較采用單因素方差分析，然后進(jìn)行Tukey的多重比較檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 上調(diào)TRPC3改善HIBD幼鼠腦損傷

研究考察了上調(diào)TRPC3對(duì)大腦HIBD的影響。在HIBD幼鼠造模前注射質(zhì)粒來上調(diào)海馬組織中TRPC3的表達(dá)（圖1A）。TTC 染色結(jié)果證明，各組梗死面積存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=71.950，Plt;0.001）；與Sham 組相比，HIBD 組和HIBD+Vector 組顯示出較大的梗死面積（Plt;0.05）。HIBD+TRPC3組的梗死面積較HIBD+Vector組明顯降低（Plt;0.05）（圖1B、C）。此外，各組腦含水量和神經(jīng)學(xué)評(píng)分存在明顯差異（F=77.940、16.520，均Plt;0.001）；與Sham 組相比，HIBD 組和HIBD+Vector 組顯示出較大的腦含水量和神經(jīng)學(xué)評(píng)分（Plt;0.05）。HIBD+TRPC3組的腦含水量和神經(jīng)學(xué)評(píng)分較HIBD+Vector 組明顯降低（Plt;0.05）（圖1D、E）。HE 染色顯示，與sham組相比，HIBD組和HIBD+Vector組的神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)水腫、染色疏松和核固縮增加，HIBD+TRPC3組這些病理改變得到改善（圖1F）。

2.2 TRPC3上調(diào)減輕HIBD后的神經(jīng)元凋亡

接下來研究考察了在上調(diào)TRPC3 對(duì)神經(jīng)元凋亡的影響。免疫熒光分析結(jié)果顯示，各組神經(jīng)元凋亡存在明顯差異（F=42.250，Plt;0.001）；與Sham 組相比，HIBD 組和HIBD+Vector組神經(jīng)元凋亡明顯增加（Plt;0.05），并且HIBD+TRPC3組神經(jīng)元凋亡較HIBD+Vector 組明顯降低（Plt;0.05）（圖2A、B）。

2.3 TRPC3增強(qiáng)HIBD后的線粒體自噬

為了研究上調(diào)TRPC3對(duì)線粒體自噬的影響，用電子顯微鏡觀察了大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞中線粒體的形態(tài)。Sham組線粒體形態(tài)正常。在HIBD組和HIBD+Vector組中，許多線粒體被細(xì)胞溶酶體包圍，表明存在線粒體自噬作用。在HIBD+TRPC3組中，越來越多的自噬小泡包裹線粒體，顯示出更強(qiáng)的線粒體自噬活性（圖3A）。免疫熒光分析結(jié)果（圖3B、C）顯示，各組LC3B+HSP60+細(xì)胞數(shù)目差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=37.630，Plt;0.001）；與Sham 組相比，HIBD 組和HIBD+Vector組LC3B+HSP60+ 細(xì)胞數(shù)目明顯增加（Plt;0.05）。與HIBD+Vector組相比，HIBD+TRPC3組海馬組織中LC3B+HSP60+細(xì)胞數(shù)目進(jìn)一步增加（Plt;0.05）。免疫印跡分析顯示，各組細(xì)胞Lc3Ⅱ/Lc3Ⅰ比值和p62、Pink1、Parkin的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=13.570、18.920、20.72、18.81，均Plt;0.001）；與Sham組相比，HIBD 組和HIBD+Vector 組線粒體自噬相關(guān)蛋白Pink1、Parkin和Lc3Ⅱ的表達(dá)水平增加（Plt;0.05），和p62的表達(dá)水平降低（Plt;0.05）。與HIBD+Vector 組相比，HIBD+TRPC3組Pink1、Parkin和Lc3Ⅱ的表達(dá)水平進(jìn)一步增加（Plt;0.05），和p62的表達(dá)水平進(jìn)一步降低（Plt;0.05）（圖3D～F）。

2.4 上調(diào)TRPC3通過Pink1/Parkin促進(jìn)線粒體自噬

為了進(jìn)一步驗(yàn)證TRPC3對(duì)線粒體自噬的激活是否依賴于Pink1/Parkin通路，在HT-22細(xì)胞中使用Pink1沉默來檢測(cè)其在線粒體自噬中的作用。各組細(xì)胞Tomm20和Parkin之間的共定位存在明顯差異（F=14.360，Plt;0.001）；用TRPC3處理可以明顯增強(qiáng)Tomm20 和Parkin 之間的共定位，誘導(dǎo)Parkin在線粒體的積累。然而，Pink1沉默可以減少Tomm20和Parkin之間的共定位（圖4A、B）。各組細(xì)胞Lc3Ⅱ/Lc3Ⅰ比值和p62、Pink1、Parkin 的表達(dá)存在明顯差異（F=24.170、15.260、21.540、22.830，均Plt;0.001）；TRPC3上調(diào)可以強(qiáng)烈增加Pink1、Parkin的表達(dá)和Lc3Ⅱ/Lc3Ⅰ比值（Plt;0.05），以及減少p62 的表達(dá)（Plt;0.05）。此外，Pink1 沉默可以部分阻止TRPC3對(duì)線粒體自噬的影響（圖4C～E）。總之，這些結(jié)果表明，TRPC3可以在體外以依賴Pink1的方式促進(jìn)神經(jīng)元的線粒體自噬。

2.5 TRPC3 通過Pink1/Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬改善了HT-22的損傷

為了驗(yàn)證Pink1/Parkin 通路在TRPC3 激活的線粒體自噬中的積極作用，課題組檢查了HT-22細(xì)胞在OGD/R后的線粒體功能和細(xì)胞生存能力。TRPC3上調(diào)增加了健康線粒體的數(shù)量（紅色），減少了受損線粒體的數(shù)量（綠色）。各組細(xì)胞存活率存在明顯差異（F=27.18，Plt;0.001）；與對(duì)照組相比，OGD/R組HT-22細(xì)胞的存活率明顯降低（Plt;0.05）。與OGD/R組相比，OGD/R+TRPC3組HT-22細(xì)胞的存活率明顯增加（Plt;0.05）。然而，Pink1的沉默阻止了TRPC3對(duì)線粒體功能的恢復(fù)。同樣，與OGD/R+TRPC3 組相比，OGD/R+TRPC3+si-Pink1組HT-22細(xì)胞的存活率明顯降低（Plt;0.05）（圖5）。所有數(shù)據(jù)表明，TRPC3的神經(jīng)保護(hù)和Pink1/Parkin途徑的增強(qiáng)參與了線粒體自噬的過程。

3 討 論

線粒體功能障礙與各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾?。ㄈ鏗IBD）有關(guān)[11]。本研究建立了新生大鼠缺氧缺血模型，觀察TRPC3 是否參與了HIBD 的過程。首先，TTC染色和HE染色確認(rèn)成功建立了新生大鼠HIBD模型，并發(fā)現(xiàn)TRPC3上調(diào)減輕腦缺血缺氧損傷。通過電子顯微鏡觀察到自噬體的形成，表明TRPC3上調(diào)后線粒體自噬活動(dòng)更強(qiáng)，并且神經(jīng)元凋亡減少。證據(jù)表明，TRPC3可以保護(hù)海馬神經(jīng)元免受體內(nèi)和體外HIBD 的影響[12]。因此，關(guān)注線粒體的神經(jīng)保護(hù)作用可能是HIBD的一種新的治療策略[3]。此外，相關(guān)研究表明，促進(jìn)線粒體自噬可以通過改善線粒體功能來保護(hù)受損的神經(jīng)元[13]。本研究探討了TRPC3通過線粒體自噬治療HIBD及其潛在的治療機(jī)制。所有的研究結(jié)果與之前的研究一起支持了線粒體自噬作用可能是TRPC3 治療HIBD 的潛在目標(biāo)。

線粒體自噬是HIBD的一個(gè)重要病理變化，已成為研究的重點(diǎn)[14]。研究表明，不同器官的缺氧缺血可以誘發(fā)細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞凋亡與自噬密切相關(guān)[15]。值得注意的是，線粒體損傷的程度往往決定了細(xì)胞的命運(yùn)，對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)是一把“雙刃劍”。有報(bào)道顯示，在缺氧缺血的早期階段，線粒體自噬在清除受損的線粒體方面起到保護(hù)作用[15]；但隨著缺氧缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，線粒體自噬的過度降解會(huì)導(dǎo)致自噬樣細(xì)胞壞死，進(jìn)一步加重?fù)p傷[16]。最近，F(xiàn)eng J等[17]在腦缺血后的不同時(shí)間進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，他們發(fā)現(xiàn)缺血大鼠在缺血24 h后，腦梗死的面積和自噬程度擴(kuò)大。這些結(jié)果證明了缺血時(shí)間延長(zhǎng)能夠激活了過度線粒體自噬的有害影響。1項(xiàng)研究也證明，雷帕霉素在瞬時(shí)MCAO前同時(shí)治療（I/2 h和R/22 h），能夠增強(qiáng)線粒體自噬作用并削弱了腦缺血再灌注損傷[18]?；谏鲜鰧?shí)驗(yàn)現(xiàn)象，課題組認(rèn)為本研究建立的HIBD處于腦損傷早期階段，在這一階段中激活線粒體自噬可以清除受損的線粒體，并有利于回收細(xì)胞成分回收，以維持細(xì)胞的平衡[19]。值得注意的是，Pink1和Parkin的蛋白表達(dá)也隨著TRPC3的上調(diào)而增加，表明TRPC3對(duì)HIBD大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用可能與Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬的激活有關(guān)。

眾所周知，線粒體自噬是由FUNDC1、BNIP3 和Pink1/Parkin等多種途徑介導(dǎo)[20]。其中，Pink1/Parkin是調(diào)節(jié)線粒體自噬的經(jīng)典途徑。Pink1位于Parkin的上游，它們之間的相互作用可以誘導(dǎo)線粒體自噬[16]。生理上，Pink1可在缺血條件下穩(wěn)定積聚在受損線粒體外膜，并募集Parkin啟動(dòng)線粒體吞噬。隨后，自噬體可以通過識(shí)別連接受損線粒體和自噬體的橋梁LC3和p62來吞噬受損線粒體。最終，受損的線粒體可被溶酶體降解[16]。在本研究中，Pink1沉默用于檢測(cè)Pink1/Parkin信號(hào)通路在TRPC3上調(diào)對(duì)OGD/R損傷的HT22細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)中的作用。結(jié)果表明，在OGD/R背景下，Pink1沉默可抑制TRPC3上調(diào)對(duì)HT-22細(xì)胞的線粒體保護(hù)作用和增殖作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明TRPC3上調(diào)促進(jìn)的線粒體自噬作用可以保護(hù)神經(jīng)元免受HIBD損傷，并且這一過程依賴于激活的Pink1/Parkin通路。然而，本研究未能抽提線粒體膜行WB驗(yàn)證，以及沒有設(shè)計(jì)Trpc3基因敲除小鼠進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證。在未來的研究中需要針對(duì)上述不足開展相關(guān)研究，進(jìn)一步明確TRPC3通路介導(dǎo)的神經(jīng)自噬作用。

這些結(jié)果表明，TRPC3 通過激活Pink1/Parkin通路介導(dǎo)的線粒體自噬，在HIBD早期階段中發(fā)揮了重要的保護(hù)作用。因此，選擇性去除受損的線粒體被認(rèn)為是HIBD的有效治療策略。同時(shí)，本研究為TRPC3作為新生大鼠缺血缺氧后的治療提供了一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。

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（責(zé)任編輯：冉明會(huì)）