【摘 要】目的：探討叉頭盒（forkhead box，F(xiàn)OX）O蛋白3a（forkhead box O3a，F(xiàn)OXO3a）/轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2（nuclear factorerythroid 2-related factor 2，Nrf2）信號(hào)通路的調(diào)節(jié)尿毒癥骨骼肌自噬的機(jī)制。方法：24只小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、慢性腎?。╟hronic kidney disease，CKD）組和CKD+AST-120（AST）組，每組8只。通過(guò)5/6腎切除術(shù)建立CKD模型。在腎切除術(shù)后4周，CKD+AST組小鼠給予含AST-120粉末（尿毒毒素的木炭吸附劑）飲食，持續(xù)8周。透射電子顯微鏡觀察腓腸肌組織中的自噬溶酶體。C2C12小鼠成肌細(xì)胞分為對(duì)照（Control，Con）組、硫酸吲哚酚（indophenol sulfate，IS）組、IS+si-FOXO3a組。實(shí)時(shí)RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法分析FOXO3a表達(dá)情況。Giemsa染色對(duì)C2C12肌管直徑進(jìn)行量化。結(jié)果：與CKD組相比，CKD+AST組血清IS水平和腓腸肌組織中FOXO3a表達(dá)、自噬溶酶體的數(shù)量明顯降低（Plt;0.05），以及腓腸肌、脛骨前肌、比目魚(yú)肌質(zhì)量明顯增加（Plt;0.05）。與IS組相比，IS+si-FOXO3a組C2C12細(xì)胞中FOXO3a、肌肉萎縮盒基因（Muscle Atrophy F-box，atrogin-1）肌肉環(huán)脂蛋白1（muscle RING-finger protein-1，MuRF-1）的表達(dá)和細(xì)胞自噬通量明顯降低（Plt;0.05），以及細(xì)胞直徑明顯增加（Plt;0.05）。與Sham組相比，CKD組小鼠腓腸肌組織中Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，KEAP1）表達(dá)明顯升高（Plt;0.05），和NRF2表達(dá)明顯降低（Plt;0.05）。AST 治療逆轉(zhuǎn)了CKD 小鼠腓腸肌組織中這些蛋白的變化。si-NRF2逆轉(zhuǎn)了FOXO3a敲低對(duì)自噬流量的抑制作用。結(jié)論：IS可能通過(guò)持續(xù)刺激FOXO3a-KEAP1-NRF2軸促進(jìn)骨骼肌過(guò)度自噬，參與尿毒癥少肌癥的發(fā)病機(jī)制。

【關(guān)鍵詞】叉頭盒O蛋白3a；轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2；尿毒癥；骨骼肌；自噬

【中圖分類號(hào)】R730.6 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2023-07-04

目前，越來(lái)越多的流行病學(xué)證據(jù)表明，隨著腎功能惡化，慢性腎?。╟hronic kidney disease，CKD）患者的肌減少癥發(fā)病率較高[1]。尿毒癥少肌癥的重要性在于其對(duì)死亡率和發(fā)病率的影響，包括CKD患者骨折、心血管事件和總生存率[2]。除了先前研究指出的多種因素外，尿毒癥毒素的積累也可能導(dǎo)致尿毒癥性肌減少癥[3-4]。尿毒癥毒素通常由健康的腎臟過(guò)濾和排泄，但當(dāng)腎功能惡化時(shí)會(huì)在體內(nèi)積累。在尿毒癥毒素中，與蛋白質(zhì)結(jié)合的尿毒癥毒素，如硫酸吲哚酚（indoxyl sulfate，IS）和硫酸對(duì)甲苯酯，被認(rèn)為對(duì)腎臟、心血管系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等內(nèi)臟系統(tǒng)有直接危害[5]。研究發(fā)現(xiàn)，IS的積累對(duì)體外成肌細(xì)胞增殖和肌管大小及體內(nèi)骨骼肌質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響[6]。然而，IS如何調(diào)節(jié)尿毒癥少肌癥中的萎縮相關(guān)基因仍不清楚。叉頭盒（forkhead box，F(xiàn)OX）O蛋白，包括FOXO1、FOXO3a、FOXO4和FOXO6，在骨骼肌中表達(dá)，已知FOXO3a在肌肉萎縮過(guò)程中調(diào)節(jié)自噬途徑[7]。大量證據(jù)表明自噬在骨骼肌完整性調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。由于細(xì)胞成分的不斷清除，過(guò)度的自噬會(huì)減少肌肉質(zhì)量[8]。因此，本研究進(jìn)一步考察了FOXO3a介導(dǎo)的自噬在尿毒癥少肌癥中的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

雄性C57BL/6小鼠（體質(zhì)量：22～25 g）購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)：SCXK（京）2021-0011]。動(dòng)物飼養(yǎng)在一個(gè)12∶12 h光/暗循環(huán)和濕度、溫度保持在55%、23 ℃的環(huán)境中，在金屬飼養(yǎng)籠中自由獲取食物和水。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分為2個(gè)方案，方案一中24只小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）和CKD組，每組12只；方案二中24只小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、CKD組和CKD+AST-120（AST）組，每組8只。除Sham組外，其余組在異氟烷麻醉下分兩步進(jìn)行5/6腎切除術(shù)[9]。在手術(shù)過(guò)程中，小鼠在充滿1.5%異氟醚[異氟醚在O2 和N2（50%/50%）的混合物中，流速為0.9～1.0 L/min]的麻醉室中維持麻醉。在第一階段，進(jìn)行左側(cè)切口，移除左腎囊以避免損傷輸尿管和腎上腺，然后部分切除上下極。兩周后，進(jìn)行右側(cè)切口和右腎切除術(shù)。Sham組在第一階段進(jìn)行左側(cè)腹側(cè)切口，然后在確定腎的上下極后關(guān)閉腹側(cè)切口。兩周后，進(jìn)行右側(cè)腹切口，然后在確定右腎動(dòng)脈后關(guān)閉側(cè)切口。血清肌酐（SCr）和血尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN）水平用作腎功能指標(biāo)。方案一中，各組小鼠分別在腎切除術(shù)后4周、8周、12周隨機(jī)處死4只小鼠，分離血清和骨骼肌組織，用于評(píng)估腎功能、骨骼肌中肌肉重量和FOXO3a、KEAP1、轉(zhuǎn)錄因子NF-E2 相關(guān)因子2（NF-E2-related factor2，NRF2）蛋白表達(dá)。方案二中，在腎切除術(shù)后4 周CKD+AST 組小鼠給予含AST-120 粉末（尿毒毒素的木炭吸附劑，日本Kremezin 公司）飲用8%（w/w）水，持續(xù)8 周。AST的劑量選擇和時(shí)間點(diǎn)選擇參照文獻(xiàn)方法[10]。

1.2 方法

1.2.1 血清尿素氮、肌酐和硫酸吲哚酚水平 通過(guò)7060型自動(dòng)分析儀（日本日立公司）酶法測(cè)定血清BUN和Scr水平。參照文獻(xiàn)方法[11]，通過(guò)HPLC測(cè)定IS的血清濃度。HPLC系統(tǒng)由CBM-20A 通信總線模塊、SPD-20A、脫氣器和LC-20AD泵（日本SHIMADZU公司）組成。

1.2.2 蘇木精-伊紅染色和免疫熒光 從每組小鼠中收集腓腸肌組織，固定在4% 多聚甲醛中，包埋在石蠟中，切成4 μm厚的切片，用HE溶液染色，并在光學(xué)顯微鏡（廣州市明美光電技術(shù)有限公司）下檢查。Image J用于計(jì)算肌纖維的橫截面積。

脫蠟后，對(duì)包埋在石蠟中的腓腸肌進(jìn)行抗原修復(fù)和BSA封閉。然后在4 ℃下用FOXO3a（ 1∶100）和Nrf2（1∶50）一級(jí)抗體處理切片。第2天，用1∶300稀釋的Cy3熒光二級(jí)抗體處理1 h。然后用DAPI對(duì)切片進(jìn)行染色，并拍照。

1.2.3 透射電子顯微鏡法 在透射電子顯微鏡下觀察腓腸肌組織中的自噬溶酶體。腓腸肌組織被切成超薄切片，并置于固定液中。用PBS洗滌切片，然后用1.0% OsO4在4 ℃固定90 min。切片用鈾酰和檸檬酸鉛染色，并在TM-3000透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司）觀察切片。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng) C2C12小鼠成肌細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC，并維持在生長(zhǎng)培養(yǎng)基（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）中，該培養(yǎng)基由DMEM杜氏改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco’s Modified EagleMedium，DMEM）、10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS）、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素組成。將C2C12成肌細(xì)胞接種在96孔板中（每孔1×104個(gè)細(xì)胞）。為了誘導(dǎo)肌管形成，在細(xì)胞貼壁和半鋪滿（約80%～90%）后，將生長(zhǎng)培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換為分化培養(yǎng)基（含2%熱滅活馬血清的DMEM）中。

為了測(cè)試IS對(duì)C2C12的FOXO3a mRNA表達(dá)、增殖和脂質(zhì)積聚影響，將細(xì)胞以每孔5×103的密度接種到96孔板中，加入不同濃度IS（0 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L；美國(guó)Sigma-Aldrich公司）孵育24 h、36 h、48 h。IS溶解在0.1%二甲基亞砜（DMSO，美國(guó)Invitrogen公司）。

為了研究FOXO3a敲低在IS誘導(dǎo)的骨骼肌萎縮中的作用，將細(xì)胞分為對(duì)照（Con）組、IS組、IS+si-FOXO3a組。Con組用0.1 %DMSO處理24 h，IS組加入1 mmol/L IS處理24 h，IS+si-FOXO3a 組細(xì)胞在用IS 處理前，使用Lipofectamine2000（美國(guó)Invitrogen 公司）將si-FOXO3a轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h，然后將這些細(xì)胞與1 mmol/L IS一起孵育24 h。

為了研究NRF2 的作用，將C2C12 細(xì)胞分為IS+si-FOXO3a+si-NC 組和IS+si-FOXO3a+si-NRF2 組。2 組細(xì)胞在用IS 處理前，使用Lipofectamine 2000 將si-FOXO3a、si-NC、si-NRF2轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h，然后將這些細(xì)胞與1 mmol/L IS一起孵育24 h。由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成了靶向FOXO3a（si-FOXO3a）、NRF2（si-NRF2）和siRNAs陰性對(duì)照（si-NC）。

1.2.5 實(shí)時(shí)RT-PCR分析 通過(guò)Trizol方法提取總RNA，并通過(guò)cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Invitrogen 公司）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Green qPCR Mix（德國(guó)Qiagen 公司）在LightCycler 96 儀器對(duì)RNA 水平進(jìn)行定量，反應(yīng)條件為：第一步37 ℃（15 min），第二步50 ℃（5 min），最后一步98 ℃（5 min）。使用GAPDH 作為內(nèi)部參考基因，和使用標(biāo)準(zhǔn)的2-ΔΔCT方法計(jì)算相對(duì)mRNA表達(dá)。本研究中使用的引物序列如下，F(xiàn)OXO3a（F）：5’-AGCAGGGTCCCACTGCGAGTG-3’；FOXO3a（RT）：5’-GCTGTCAACGACACCGCTTTTA-3’，GAPDH（F）：5’-ACAGCCTCAAGATCATCAGC-3’，GAPDH（RT）：5’-GGTCATGAGTCCTTCCACGAT-3’。

1.2.6 Giemsa染色試驗(yàn) 使用Giemsa染色對(duì)肌管直徑進(jìn)行量化。用冰冷的PBS洗滌C2C12肌管，并在4%多聚甲醛中固定10 min。肌管與10%Giemsa染色溶液（上海Beyotime公司）一起孵育40 min。對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)組，使用光學(xué)顯微鏡隨機(jī)獲取6幅圖像。使用Image J軟件在3個(gè)不同的位置測(cè)量每個(gè)肌管的直徑。測(cè)量每個(gè)孔中至少100個(gè)肌管。

1.2.7 自噬通量分析 將C2C12細(xì)胞接種到24孔板后，用mCherry-GFP-LC3腺病毒（MOI=50）轉(zhuǎn)導(dǎo)它們，固定，并通過(guò)共TCS-SP8聚焦顯微鏡（德國(guó)Leica公司）觀察細(xì)胞。

1.2.8 蛋白質(zhì)印跡法 通過(guò)使用高速和低溫離心，提取蛋白質(zhì)。將來(lái)自不同樣品的蛋白質(zhì)等量置于10%或12.5% SDS聚丙烯酰胺凝膠上。之后，樣品在250 mA下轉(zhuǎn)移到PVDF膜（美國(guó)Millipore公司）上90 min。封閉后將下列初級(jí)抗體施加到膜上：FOXO3a、肌肉萎縮盒基因（Muscle Atrophy Fbox，atrogin-1）、肌肉環(huán)脂蛋白1（muscle RING-finger protein-1，MuRF-1）、Kelch 樣ECH 相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECHassociatedprotein 1，KEAP1）、NRF2和GAPDH（均為1∶1 000，購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司）。3次TBST溶液洗滌后，將膜與HRP 偶聯(lián)的第二抗體（1∶3 000）一起孵育2 h。最后，使用Bio-rad ChemiDoc觸摸成像系統(tǒng)觀察膜。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，2組間比較采用t 檢驗(yàn)，使用單向方差分析比較多組的數(shù)據(jù)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 CKD小鼠骨骼肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)的變化

圖1顯示了CKD條件下腎功能和骨骼肌中肌肉質(zhì)量表達(dá)的變化。在研究期間，Sham組和CKD組在研究期間體質(zhì)量無(wú)差異。與Sham組相比，CKD組在5/6-Nx后4周、8周、12周時(shí)血清Scr、BUN、IS水平增加（F=19.26、14.83、25.76，均Plt;0.05），表明腎功能在5/6-Nx后4周下降，并在12周之前受損。此外，與Sham組相比，CKD小鼠腓腸肌、脛骨前肌、比目魚(yú)肌質(zhì)量在5/6-Nx后4周出現(xiàn)下降，并在8～12周時(shí)下降（F=15.06、9.53、8.62，均Plt;0.05）。與骨骼肌質(zhì)量的減少一致，CKD組骨骼肌組織中FOXO3a的蛋白表達(dá)在5/6-Nx后4周、8 周、12 周時(shí)較Sham 組增加（t=4.45、5.03、5.46，均Plt;0.05，圖2）。

2.2 尿毒癥毒素與CKD小鼠骨骼肌中FOXO3a表達(dá)的關(guān)系

與CKD 組相比，CKD+AST 組血清IS 水平降低（F=16.75，Plt;0.05），和腓腸肌、脛骨前肌、比目魚(yú)肌質(zhì)量增加（F=8.32、7.64、7.93，Plt;0.05）。CKD 組和CKD+AST 組體質(zhì)量和血清Scr、BUN水平無(wú)差異（圖3A～G）。同樣，HE染色顯示，CKD 組小鼠腓腸肌肌纖維的橫截面積低于Sham 組（F=15.13，Plt;0.05）。但經(jīng)AST 處理后，上述現(xiàn)象得到改善（圖3H）。此外，通過(guò)免疫熒光和免疫印跡證實(shí)，CKD+AST組小鼠腓腸肌組織中FOXO3a表達(dá)較CKD組明顯降低（F=20.42，Plt;0.05）（圖3I～J）。

2.3 FOXO3a敲低在IS誘導(dǎo)的骨骼肌萎縮中的抑制作用

為了進(jìn)一步研究尿毒癥毒素和FOXO3a上調(diào)之間的關(guān)系，在體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中評(píng)估了它的作用，并發(fā)現(xiàn)C2C12肌管中FOXO3a mRNA 表達(dá)的上調(diào)呈IS 劑量依賴性（F=42.76，Plt;0.001，圖4A）。還使用C2C12細(xì)胞評(píng)估了FOXO3a在IS誘導(dǎo)的骨骼肌萎縮中的作用機(jī)制。與IS組相比，IS+si-FOXO3a組C2C12細(xì)胞中FOXO3a、Atrogin-1和肌肉環(huán)脂蛋白1（MuRF-1）的表達(dá)降低（F=30.16、18.36、21.00，均Plt;0.05）（圖4B）。Giemsa染色證實(shí)了FOXO3a敲低逆轉(zhuǎn)了IS誘導(dǎo)的C2C12細(xì)胞直徑降低（F=11.47，Plt;0.001，圖4C）。

2.4 FOXO3a介導(dǎo)的自噬在尿毒癥少肌癥中的作用

為了評(píng)估FOXO3a介導(dǎo)的自噬在尿毒癥少肌癥中的作用，利用透射電鏡證實(shí)了自噬過(guò)程。與Sham組相比，CKD組小鼠腓腸肌中自噬溶酶體的積累增加（F=18.84，Plt; 0.05）。CKD+AST組小鼠腓腸肌中自噬溶酶體的積累較CKD組減少（F=18.84，Plt;0.05）（圖5A）。用GFP-mRFP-LC3腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)C2C12細(xì)胞，并通過(guò)計(jì)數(shù)紅色（代表自噬溶酶體）和黃色斑點(diǎn)（代表自噬體）的數(shù)量來(lái)分析自噬的變化。在Con組中，細(xì)胞的自噬水平較低。在IS組中，C2C12細(xì)胞中黃色和紅色斑點(diǎn)數(shù)均較Con組增加（F=13.26、16.72，Plt;0.05），表明細(xì)胞自噬通量增加。IS+si-FOXO3a組C2C12細(xì)胞中黃色和紅色斑點(diǎn)數(shù)均較IS組減少（F=13.26、16.72，Plt;0.05）（圖5B、C）。

2.5 FOXO3a/NRF2信號(hào)軸在尿毒癥少肌癥中的作用

FOXO3a作為轉(zhuǎn)錄因子直接結(jié)合到KEAP1的啟動(dòng)子區(qū)域，從而影響KEAP1的轉(zhuǎn)錄。KEAP1作為NRF2的負(fù)調(diào)節(jié)因子，NRF2是氧化應(yīng)激的重要保護(hù)因子，并介導(dǎo)自噬功能障礙。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析檢測(cè)了上述指標(biāo)體內(nèi)表達(dá)情況。與Sham組相比，CKD組小鼠腓腸肌組織中KEAP1表達(dá)升高（F=15.26，Plt;0.05），和NRF2 表達(dá)降低（F=16.75，Plt;0.05）。AST 治療逆轉(zhuǎn)了CKD 小鼠腓腸肌組織中這些蛋白的變化（圖6A）。此外，通過(guò)免疫熒光證實(shí)CKD小鼠腓腸肌組織中NRF2表達(dá)降低（圖6B）。

為了進(jìn)一步研究NRF2 的作用，用si-NRF2 轉(zhuǎn)染FOXO3a敲低的C2C12細(xì)胞。與IS+si-FOXO3a+si-NC組相比，IS+si-FOXO3a+si-NRF2組C2C12細(xì)胞直徑降低（t=4.36，Plt;0.05），褐黃色和紅色斑點(diǎn)數(shù)增加（t=6.72、8.95，均Plt;0.05）（圖6C～D）。這些數(shù)據(jù)表明si-NRF2逆轉(zhuǎn)了FOXO3a敲低對(duì)自噬流量的抑制作用。

3 討論

CKD發(fā)病機(jī)制的一個(gè)關(guān)鍵方面是進(jìn)行性肌肉消耗。在CKD中觀察到的肌肉功能減少可能導(dǎo)致早期CKD患者耐力鍛煉減少和肌肉無(wú)力。本研究在CKD小鼠中觀察到腓腸肌、脛骨前肌、比目魚(yú)肌重量在5/6-Nx后4周出現(xiàn)持續(xù)下降。與此一致的是，這項(xiàng)研究在CKD 小鼠骨骼肌組織中觀察到FOXO3a的持續(xù)激活。FOXO3a是自噬過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)因子，位于平衡反饋環(huán)的中心[12]。當(dāng)基礎(chǔ)自噬被抑制時(shí)，F(xiàn)OXO3a通過(guò)使自噬靶失活來(lái)糾正自噬擾動(dòng)[13]。CARM1-Pontin-FOXO3a信號(hào)軸作用于遠(yuǎn)端區(qū)域，通過(guò)增強(qiáng)子激活自噬基因。抑制AKT導(dǎo)致核FOXO3a水平降低，并減弱自噬調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[14]。正常的基礎(chǔ)自噬水平對(duì)于防止各種分解代謝狀況下（包括饑餓、癌癥惡病質(zhì)、去神經(jīng)和敗血癥）的肌肉萎縮至關(guān)重要，然而肌肉中的異常自噬導(dǎo)致細(xì)胞改變，如線粒體損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、肌節(jié)蛋白周轉(zhuǎn)受損和細(xì)胞死亡，從而導(dǎo)致各種類型的骨骼肌疾病的發(fā)生。眾所周知，自噬/溶酶體系統(tǒng)是降解受損或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的主要機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，自噬溶酶體系統(tǒng)受FoxO3蛋白的控制，導(dǎo)致骨骼肌蛋白質(zhì)丟失[15]。本研究通過(guò)電子顯微鏡觀察到CKD小鼠骨骼肌中自噬溶酶體數(shù)量明顯增加，證實(shí)了FOXO3a介導(dǎo)的骨骼肌自噬在CKD 肌肉萎縮中的重要作用。

IS是一種眾所周知的蛋白結(jié)合性尿毒癥毒素，難以用透析除去，且IS 水平隨著腎功能下降而增加。IS與CKD患者的不良結(jié)果相關(guān)，包括心血管并發(fā)癥和死亡率[16]。最近的體外和體內(nèi)研究報(bào)道，IS通過(guò)有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在肌肉細(xì)胞中積累，并通過(guò)氧化應(yīng)激的激活和炎性細(xì)胞因子的遞增，導(dǎo)致肌生長(zhǎng)抑制素和Atrogen-1的產(chǎn)生[17]。最后，肌纖維的線粒體功能障礙可能會(huì)誘發(fā)骨骼肌分解代謝增加以及線粒體功能和生物合成減少[18]。本研究評(píng)估了AST給藥的CKD小鼠中尿毒癥毒素和FOXO3a蛋白表達(dá)之間的關(guān)系。AST是一種活性炭吸附劑，可通過(guò)吸附腸道中的尿毒癥毒素及其前體來(lái)減少CKD中的尿毒癥毒素，并用于評(píng)估尿毒癥毒素的相關(guān)性。結(jié)果顯示，服用AST可明顯抑制IS的累積、降低骨骼肌組織中FOXO3a表達(dá)以及骨骼肌重量和肌纖維尺寸的減少，但不會(huì)影響腎功能，證實(shí)了IS的累積、FOXO3a表達(dá)上調(diào)可能誘發(fā)了骨骼肌分解代謝增加。值得注意的是，體外研究證實(shí)了C2C12肌管中FOXO3a mRNA表達(dá)的上調(diào)呈IS劑量依賴性，并且FOXO3a 敲低逆轉(zhuǎn)了IS 誘導(dǎo)的C2C12 細(xì)胞萎縮。FOXO家族在骨骼肌的維持和流失中起著重要的作用。肌肉中FOXO 家族的缺失可防止肌肉萎縮，并降低對(duì)進(jìn)食和去神經(jīng)支配的反應(yīng)[19]。FOXO3a敲低可防止糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的肌肉細(xì)胞萎縮[7]。因此，IS可能通過(guò)持續(xù)刺激FOXO3a激活參與尿毒癥少肌癥發(fā)病機(jī)制。

先前的研究證實(shí)了FOXO3a-KEAP1-NRF2 軸提供了FOXO3a和自噬之間的重要分子聯(lián)系。在靜止條件下，NRF2通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑組成性降解，KEAP1作為靶向Nrf2的泛素連接酶復(fù)合物的銜接子，是FOXO3a調(diào)節(jié)自噬的關(guān)鍵靶點(diǎn)[20]。過(guò)表達(dá)的FOXO3a激活KEAP1，隨后KEAP1介導(dǎo)Nrf2泛素化受到阻礙，將Nrf2釋放到細(xì)胞核，在細(xì)胞核中與sMaf 結(jié)合，并位于其靶基因（如HO-1、CAT、NQO1和其他抗氧化酶）的啟動(dòng)子中[21]。應(yīng)該注意的是，Nrf2的激活依賴于泛素結(jié)合蛋白FOXO3a介導(dǎo)的自噬刺激，而自噬又由Nrf2驅(qū)動(dòng)，因此與Nrf2形成了正反饋環(huán)[22]。在這方面，本研究觀察到CKD組小鼠腓腸肌組織中KEAP1 表達(dá)顯著升高和NRF2 表達(dá)明顯降低，而AST治療逆轉(zhuǎn)了CKD小鼠腓腸肌組織中這些蛋白的變化，表明FOXO3a-KEAP1-NRF2軸參與了IS 介導(dǎo)的尿毒癥少肌癥發(fā)病機(jī)制。此外，NRF2敲低逆轉(zhuǎn)了FOXO3a敲低對(duì)細(xì)胞大小、自噬流量的恢復(fù)作用，證明FOXO3a誘導(dǎo)的肌病表型可以通過(guò)上調(diào)NRF2信號(hào)通路來(lái)挽救，至少是部分挽救。先前研究已經(jīng)表明FOXO3a/Nrf2信號(hào)通路在庫(kù)欣綜合征骨骼肌萎縮中發(fā)揮作用[7]。因此，F(xiàn)OXO3a/Nrf2信號(hào)通路可作為防止IS誘導(dǎo)的骨骼肌萎縮的潛在治療靶點(diǎn)。

總之，本研究確定IS 可能通過(guò)持續(xù)刺激FOXO3a-KEAP1-NRF2軸促進(jìn)骨骼肌過(guò)度自噬，參與尿毒癥少肌癥的發(fā)病機(jī)制。雖然FOXO3a敲低可防止IS誘導(dǎo)的骨骼肌萎縮，但是目前的研究尚不清楚體內(nèi)抑制FOXO3a-KEAP1-NRF2軸是否有助于延緩尿毒癥毒素誘導(dǎo)的骨骼肌萎縮，需要進(jìn)一步深入研究。

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（責(zé)任編輯：曾 玲）