摘要：【目的】分離篩選產(chǎn)植酸酶益生乳酸菌菌株?！痉椒ā恳园l(fā)酵飼料、博扎、漿水為代表的發(fā)酵樣品中，分離篩選出形態(tài)差異菌株，通過產(chǎn)酶篩選及16S rDNA分子鑒定，獲得產(chǎn)植酸酶乳酸菌菌株，并通過耐酸、耐膽鹽、耐腸胃液、自聚集力及抑菌分析對其進行評價?！窘Y(jié)果】篩選出4株產(chǎn)植酸酶乳酸菌，其中菌株JS5植酸酶酶活高達0.83 U/mL，與植物乳桿菌菌株 DSM 20174相似性為100%，確定該菌株為植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）。菌株JS5在pH值3條件下存活率高達100%，在膽鹽濃度0.1%時JS5存活率為0.55%，在模擬腸液和胃液中，存活率分別為8.56%和0.38%，其活菌數(shù)均在1×106CFU/mL以上，達到發(fā)揮益生作用的最小活菌數(shù)要求。菌株JS5自聚集力為（9.69%±0.44%），可促進菌株在腸道定殖。菌株JS5發(fā)酵液對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌均有抑制作用?！窘Y(jié)論】植保乳桿菌JS5產(chǎn)植酸酶較高，可在模擬腸胃液中存活，具有良好的細胞黏附能力和抑制病原菌生長，可用于益生的畜禽微生態(tài)制劑。

關(guān)鍵詞：乳酸菌；植酸酶；篩選

中圖分類號：S188文獻標志碼：A文章編號：1001-4330（2024）09-2290-10

0引 言

【研究意義】植酸酶是將植酸（肌醇六磷酸）或植酸鹽水解為肌醇、磷酸或磷酸鹽的一類酶的總稱［1］。植酸通常與鈣、鐵、磷等礦物質(zhì)元素結(jié)合，形成不溶性鹽類，還可以絡(luò)合蛋白質(zhì)，減少其與消化酶的接觸及抑制消化酶的活性［2，3］，過高的植酸將降低飼料的轉(zhuǎn)化率，動物飼糧中的磷主要以植酸的形式存在，限制了飼料中營養(yǎng)物質(zhì)利用。由于單胃動物不能分泌植酸酶，因此飼料外源中必須添加足量的植酸酶［4］?！厩叭搜芯窟M展】在家禽飼糧中特別是低有效磷飼糧添加植酸酶可提高生產(chǎn)效益［5，6］。乳酸菌及其制品可調(diào)整腸道微生態(tài)平衡、提高飼料的利用率?！颈狙芯壳腥朦c】關(guān)于微生物產(chǎn)植酸酶報道雖多，如曲霉［7，8］、芽孢桿菌［9，10］等，但有關(guān)乳酸菌產(chǎn)植酸酶的研究較少。乳酸菌具有調(diào)節(jié)免疫、修復腸道菌群益生功能和培養(yǎng)方式簡單，產(chǎn)胞外酶易獲取等優(yōu)點，為推進相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)，需對乳酸菌進行定向篩選，獲得優(yōu)良菌株。【擬解決的關(guān)鍵問題】以發(fā)酵飼料、博扎、漿水為代表的發(fā)酵樣品中，篩選耐胃酸、耐膽鹽、耐腸胃液，且具有良好細胞黏附及抑制病原菌能力的產(chǎn)植酸酶乳酸菌。

1材料與方法

1.1材 料

樣品：博扎、漿水、發(fā)酵飼料樣品。

植酸鈉瓊脂培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、植酸鈉4 g/L、氯化鈣2 g/L、硝酸銨5 g/L、氯化鉀0.5 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、硫酸鐵0.01 g/L、硫酸錳0.01 g/L和瓊脂15 g/L［11］。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基：酪蛋白胨10 g/L、牛肉浸取物4 g/L、酵母提取物2 g/L、葡萄糖10 g/L、乙酸鈉5 g/L、檸檬酸氫二銨2 g/L、吐溫-80 1 g/L、半胱氨酸0.05%（w/v）、植酸鈉0.65 g/L、MOPS 0.1 mol/L、硫酸鎂0.58 g/L、硫酸錳0.25 g/L、碳酸鈣20 g/L和瓊脂15 g/L，調(diào)pH值5.0～5.5［12］。

MRS培養(yǎng)基：酪蛋白胨10 g/L、牛肉浸取物8 g/L、酵母浸粉4 g/L、葡萄糖20 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、檸檬酸氫二銨2 g/L、乙酸鈉5 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、硫酸錳0.04 g/L、吐溫-80 1g/L，調(diào)pH值（5.7±0.2）。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化鈉10 g/L，調(diào)pH值（7.0±0.2）。

1.2方 法

1.2.1試驗設(shè)計

稱取不同來源的材料（博扎、漿水、發(fā)酵飼料）各10 g，與90 mL無菌生理鹽水振蕩混合，10倍梯度稀釋成不同濃度的菌懸液，取10-4、10-5、10-6稀釋度各100 μL分別涂布MRS平板中挑選形態(tài)差異菌株。取純化后的菌株在MRS肉湯37℃培養(yǎng)24 h后，將菌懸液（3 μL）點接在改進后的植酸鈉瓊脂培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)7 d。植酸酶陽性菌落的周圍形成透明圈，挑選出透明圈直徑與菌落直徑較大的菌株斜面保藏。

1.2.2測定指標

1.2.2.1標準曲線制作

取適量KH2PO4于105℃烘至恒重，稱取0.272 g于500 mL容量瓶定容，獲得4 μmol/mL的KH2PO4標準溶液。按照0.00、0.80、1.60、2.40、3.20、4.00 μmol/mL濃度梯度對KH2PO4標準溶液進行稀釋，取定量稀釋KH2PO4溶液與顯色劑反應，以無機磷標準液的濃度為橫坐標、吸光值（700 nm）為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.2.2植酸酶酶活測定

挑取篩選出的菌株接種至產(chǎn)酶培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，通過離心（11 000 r/min，10 min，4℃）獲得無細胞上清液用于測定胞外酶活。取50 μL上清液，加入200 μL 3 mmol/L溶解于pH值 5.0的醋酸緩沖液的植酸鈉，55℃溫育10 min，加入250 μL的5%（w/v）三氯乙酸停止反應。加入500 μL由4體積1.5%鉬酸銨溶液與5.5%硫酸和1體積2.7%硫酸亞鐵溶液混合制成的顯色劑，室溫反應10 min，測定700 nm吸光度，對照組先加入終止液再加入植酸鈉溶液和顯色液，計算被測樣品中植酸酶的活力［13，14］。

酶活力 = cnvt（U）.

式中，c為反應混合物中植酸鈉釋放的磷酸鹽濃度（μmol/mL）；n為稀釋倍數(shù)；v為酶提取物體積（mL）；t為反應時間（min）。

植酸酶活性的一個單位（U）定義：在測定條件下釋放1 μmol Pi/min所需的酶的量。

1.2.3產(chǎn)植酸酶乳酸菌鑒定

將保藏菌株活化兩代并劃線至MRS固體平板，37℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)。挑取單菌落涂布于載玻片上，采用革蘭氏染色法鏡檢。使用天根細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，引物為27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’）與1 492R（5’-GGT-TACCTTGTTACGACTT-3’），以DNA為模板進行PCR擴增送新時代眾合科技生物公司測序，菌株16S rDNA序列上傳EzBioCloud進行分類鑒定。

1.2.4乳酸菌益生潛力的體外評價

1.2.4.1菌體懸浮液的制備

將菌種接種于5 mL MRS肉湯中，37℃靜態(tài)培養(yǎng)24 h。將1%（v/v）的上述培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到10 mL MRS培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)后，離心（11 000 r/min，10 min，4℃）收集菌體，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH值 7.3）洗滌2次，并重新懸浮于其中［15］。

1.2.4.2耐酸性

將100 μL菌體懸浮液分別與900 μL PBS pH值2.0、3.0和7.3混合，37℃培養(yǎng)3 h，稀釋取100 μL涂布在MRS瓊脂平板上測定活菌數(shù)（CFU/mL）并計算存活率［15］。

1.2.4.3膽鹽耐受性

將100 μL菌體懸浮液分別與900 μL膽鹽濃度（0.0%、0.1%、0.2%和0.3%）MRS肉湯混合，37℃培養(yǎng)3 h，稀釋取100 μL涂布在MRS瓊脂平板上測定活菌數(shù)（CFU/mL）并計算存活率［15］。

1.2.4.4胃液耐受性

將100 μL菌體懸浮液分別與900 μL合成胃液混合（胃液由膽鹽0.05 g；CaCl2，0.11 g；葡萄糖，3.5 g；KCl，0.37 g；KH2PO4，0.6 g；溶菌酶，0.1 g；NaCl，2.05 g；胃蛋白酶，0.013 3 g；胰蛋白胨，8.3 g；水1 L，pH值 2.5），37℃培養(yǎng)。在MRS瓊脂平板上測定0和3 h的活菌數(shù)（CFU/mL）并計算存活率［15］。

1.2.4.5腸液耐受性

將100 μL菌體懸浮液分別與900 μL合成腸液混合（腸液由1 mg/mL胰酶（胰淀粉酶10 U/mg；胰脂肪酶20 U/ mg；胰蛋白酶4 U/mg），溶解于含有0.3%膽鹽的0.85%（w/v）NaCl溶液中制備，pH值 8.0），37℃培養(yǎng)。在MRS瓊脂平板上測定0和6 h的活菌數(shù)（CFU/mL）并計算存活率［15］。

1.2.4.6菌體的自聚集力

活化后培養(yǎng)的乳酸菌，取2 mL，11 000 r/min，4℃離心10 min，用PBS （pH值 7.3）清洗菌體2次，并將其稀釋至OD=0.5 （600 nm）。將2 mL懸浮液輕輕渦旋10 s，37℃培養(yǎng)1 h。取出上部懸浮液，記錄OD （600 nm）讀數(shù)，計算自聚集力［15］。

A（%）=（1-ODy/ODx）×100.

式中，A為自聚集力，ODx為總菌懸液吸光度，ODy為上懸液吸光度。

1.2.4.7抑菌能力

將保藏的乳酸菌活化兩代，接種至MRS液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)72 h。將5種指示菌株大腸桿菌、沙門氏桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和金黃色葡萄球菌分別接種到LB 液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，以20 mL/L的量加入40℃ NA培養(yǎng)基中，凝固后打孔（7 mm）并每孔加入65 μL帶菌發(fā)酵液和發(fā)酵上清液（11 000 r/min，10 min，4℃），37℃培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑大小，判斷乳酸菌的抑菌活性［16］。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016和Origin 2021軟件進行數(shù)據(jù)整理及圖表繪制，通過IBM SPSS Statistics 20軟件進行顯著性和方差分析，顯著性水平Plt;0.05。

2結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)植酸酶菌株鏡檢形態(tài)鑒定

研究表明，從不同來源的材料（博扎、漿水、發(fā)酵飼料）分離純化出37株菌株，得到具有植酸鈉水解能力的菌株共22株，均為革蘭氏陽性，其中球菌4株，桿菌18株。對符合乳酸菌形態(tài)的球菌、桿菌液體發(fā)酵進行胞外植酸酶測定，進一步篩選產(chǎn)胞外植酸酶較高菌株。圖1，表1

2.2胞外植酸酶酶活測定

研究表明，準確配置4 μmol/mL KH2PO4標準溶液，將標準溶液稀釋成0.0、0.8、1.6、2.4、3.2 μmol/mL的溶液。以無機磷含量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。其回歸方程為Y=0.106 6X+0.004 2，相關(guān)系數(shù)為0.999，在無機磷濃度為范圍內(nèi)，該方法可作為定量測定胞外植酸酶的方法。圖2

2.316S rDNA基因序列同源性

研究表明，乳酸菌JS2、JS5、S1和J6植酸酶酶活分別為0.78±0.04、0.84±0.04、0.48±0.03和0.62±0.02。

初步鑒定JS5為植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum），JS2為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei），J6為發(fā)酵乳桿菌（Limosilactobacillus fermentum），S1為斯特拉斯堡乳植物桿菌 （Lactiplantibacillus argentoratensis），利用MEAG11，以Neighbor-joining法（1 000 bootstrap）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。圖3

2.4模擬體外腸道條件下的存活率

2.4.1乳酸菌菌株的耐酸性能

研究表明，在pH值3條件下，3 h時4株乳酸菌的存活率范圍在25.34%～100.00%，其中菌株J6存活率為95.69%，菌株JS5存活率高達100%，菌株JS5、J6均具有良好的耐酸性，能夠適應模擬胃酸的環(huán)境。在pH值2條件下，只有菌株S1存活，且存活率下降至1.74%。試驗篩選的菌株JS5、J6具有較好的耐酸性能。 圖4

2.4.2乳酸菌菌株的耐膽鹽性能

研究表明，選取4株乳酸菌在不同濃度的膽鹽溶液中孵育3 h。在膽鹽濃度0.1%條件下，3 h后4株乳酸菌的存活率下降。其中菌株J6、JS5存活率為0.86%和0.55%，對膽鹽的耐受能力較弱，但活菌數(shù)仍保持在106CFU/mL以上，乳酸菌發(fā)揮益生作用的最低活菌數(shù)為106 CFU/mL。菌株S1、JS2不耐受膽鹽，在膽鹽濃度0.1%條件下不能存活。當膽鹽濃度提高至0.2%時，4株菌株均不能存活，4株菌株膽鹽耐受性較弱。4株乳酸菌對膽鹽的耐受性較弱，可能與菌體內(nèi)相關(guān)水解酶有關(guān)。表2

2.4.3乳酸菌菌株的耐腸液性能

研究表明，以人工腸液模擬菌株生長環(huán)境，6 h時觀察4株乳酸菌的耐腸液能力。4株乳酸菌對模擬腸液均有一定的耐受能力，活菌數(shù)均在107CFU/mL以上。其中菌株J6、S1在模擬腸液中處理6 h后存活率較高，達到92.45%和51.92%，具有較高的耐受性。菌株JS5在腸液培養(yǎng)6 h后，存活率為8.56%，但活菌數(shù)達到1.13×108CFU/mL，高于存活率為92.45%的菌株J6。表3

2.4.4乳酸菌菌株的耐胃液性能

研究表明，菌株JS2、J6對人工胃液的耐受性較高，3 h后活菌數(shù)存活率為52.86%和27.66%。菌株JS5、S1耐受性低，存活率為0.38%和1.76%。其中菌株JS5在人工胃液中培養(yǎng)3 h后活菌數(shù)為6.33×106CFU/mL，在4株菌株中最低。表4

2.4.5乳酸菌菌株的自聚集力

研究表明，菌株JS2、JS5自聚集力較高，1 h后自聚集力為（9.95±0.54）%、（9.69±0.44）%。菌株J6、S1自聚集力較低，1 h后自聚集力為（6.12±0.70）%、（2.50±0.31）%。篩選的菌株JS2、JS5具有良好的自聚集力，具有在腸道中定殖的能力。圖5

2.4.6乳酸菌菌株的抑菌性能

研究表明，菌株JS5、JS2、S1發(fā)酵上清液和菌液對5種致病菌均有抑菌作用，菌株J6發(fā)酵上清液對金黃色葡萄球菌沒有抑菌作用，對大腸桿菌、沙門氏菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌有抑菌作用；菌株J6菌液對5種致病菌均有抑菌作用。其中4株乳酸菌2種不同處理中抑制大腸桿菌效果最佳為S1菌液；抑制沙門氏菌效果最佳為JS5發(fā)酵液；抑制金黃色葡萄球菌效果最佳為JS2菌液；抑制白色念珠菌效果最佳為S1菌液和發(fā)酵液；抑制銅綠假單胞菌效果最佳為J6菌液。不同菌株抑菌能力的差異可能與菌株所產(chǎn)的抑菌成分的種類和抑菌物質(zhì)活性有關(guān)。表5

3討 論

植酸酶是一種胞外酶，廣泛存在于自然界中，在動物、植物、微生物中均有發(fā)現(xiàn)。其中動物植酸酶含量較低，難以大規(guī)模應用；

乳酸菌生長在pH值小于4.0的環(huán)境下會受到明顯抑制［17］。胃液中鹽酸是調(diào)節(jié)胃酸的主要成分，其pH值通常在3.0左右，在空腹情況下pH值可下降至2.5［18］。乳酸菌發(fā)揮益生作用的前提是能夠在胃液中存活，只有具有良好耐酸能力的乳酸菌才能通過胃液發(fā)揮益生特性，食物在胃中消化時間，一般不會超過3 h，液體通過時間則更短［19］。王祎然等［19］研究6株菌的耐酸能力，在pH值2.5環(huán)境中，菌株存活率最低為88.17%，最高為94.48%。馮秀娟等［20］自26株乳酸菌中篩選出2株菌具有良好的耐酸性，在pH值 3.0的環(huán)境中能夠培養(yǎng)生長，且在脅迫2h后有持續(xù)生長的趨勢，存活率達到100%，食物經(jīng)過胃液的消化后會進入十二指腸與具有抑菌作用的膽鹽接觸［19］。小腸中膽鹽濃度一般為0.03%～0.3%，且膽鹽可產(chǎn)生較高滲透壓，會對菌體細胞造成影響，對細胞膜和DNA都有一定程度的損傷，可造成細胞的死亡［21］。一般食物經(jīng)過需要3 h［22］，Sakandar［23］發(fā)現(xiàn)6株乳酸菌在0.3%的膽鹽濃度中培養(yǎng)3h后的活菌數(shù)下降到106 CFU/mL。楊曉宇等［24］對6株乳酸菌研究發(fā)現(xiàn)，膽鹽濃度達到3g/L時，存活率明顯降低，平均為45%，其中存活率較高的可達69%。小腸內(nèi)的pH值一般在7.6左右，食物在小腸內(nèi)會停留 3～8 h，益生菌需定殖并存活在腸道內(nèi)，耐腸液也是益生菌篩選的重要指標之一［25］。腸液主要成分為胰液和膽鹽，胰液中的胰蛋白酶可水解微生物的菌體蛋白質(zhì)，抑制微生物的生長，膽鹽能改變微生物細胞膜的通透性，殺死進入腸道的微生物。因此益生菌要發(fā)揮益生功能，需要能耐受腸液中胰蛋白酶、膽鹽等物質(zhì)［26］。

程秀芳等［27］對８株乳酸菌在人工胃液中培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，其中7株乳酸菌死亡率較高，僅有1株菌株能夠耐受，活菌數(shù)的數(shù)量級為1×106CFU/mL。許多細菌都表現(xiàn)出自動聚集的特性，在自聚集中，相同類型的細菌會形成多細胞團塊，最終沉淀在培養(yǎng)管的底部［28］。在腸道中，自聚集力是評估細菌能否在腸壁定殖能力的關(guān)鍵［15］。Ahire等［15］對乳酸菌UBLP40研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌UBLP40自聚集力為9.66±0.26，顯著高于其他對照組，可促進乳酸菌UBLP40在腸道的定殖。

通常乳酸菌的主要抑菌成分包括有機酸、過氧化氫、細菌素等［29］。

植物來源的植酸酶最適pH值范圍較窄，在單胃禽畜的胃腸環(huán)境中很難發(fā)揮作用［30］；微生物來源的植酸酶憑借高活性、穩(wěn)定性良好、適用范圍廣、分離純化簡便等特性而廣泛應用。曹偉超等［31］篩選出一株乳酸菌L-19，胞外酶活為1.36 U/mL，可降低黑豆酸面團中的植酸含量。研究以微生物產(chǎn)植酸酶為主，從發(fā)酵飼料、漿水、博扎中分離得到4株產(chǎn)植酸酶乳酸菌菌株，徑16SrDNA分子鑒定，1株為植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum），1株為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei），1株為發(fā)酵乳桿菌（Limosilactobacillus fermentum），1株為斯特拉斯堡乳植物桿菌 （Lactiplantibacillus argentoratensis），其中植物乳桿菌JS5胞外植酸酶酶活達到0.83 U/mL。麥日艷古·亞生等［32］從發(fā)酵乳制品中篩選出41 株乳酸菌，發(fā)現(xiàn)41株菌對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均有抑制作用，研究分離的4株乳酸菌抑菌譜更廣。Heo等［33］從健康仔豬糞便中分離得到植物乳桿菌JDFM LP11，具有較強的胃腸道耐受性。吳雨甍等［34］從醬香型白酒酒醅中分離出6株乳酸菌，菌株可耐受pH值 3.0和0.5%膽鹽，在模擬人體胃液、腸液中處理3 h后，其活菌數(shù)均＞106 CFU/mL。研究4株乳酸菌具有較強的胃腸道耐受性，表明菌株具備在腸道定殖的基本能力，可以以活菌的形式定殖在腸道中。腸上皮細胞是益生菌發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的重要位點，益生菌對腸上皮細胞的黏附能力是其發(fā)揮益生功能的基礎(chǔ)［35］，4株乳酸菌株的高自聚集力可促進在腸道的定殖。乳酸菌株JS5具有較高的植酸酶活力和益生能力，具有作為飼用益生菌的潛在能力。

4結(jié) 論

篩選出4株產(chǎn)植酸酶乳酸菌，其中菌株JS5植酸酶酶活高達0.83 U/mL，與植物乳桿菌菌株 DSM 20174的相似性為100%，該菌株為植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）。菌株JS5發(fā)酵液對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌均有抑制作用。植物乳桿菌JS5產(chǎn)植酸酶較高，可在模擬腸胃液中存活，具有良好的細胞黏附能力和抑制病原菌生長，可用于益生的畜禽微生態(tài)制劑。從發(fā)酵飼料、漿水、博扎中分離篩選得到的乳酸菌JS5、JS2、S1、J6對酸、膽鹽、腸胃液有一定的耐受性，具有良好的細胞黏附能力，能夠抑制大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌的生長，綜合性能菌株JS5可作為飼用益生菌。

參考文獻（References）

［1］王亞林， 嚴建芳， 李睿， 等. 植酸酶固體發(fā)酵工藝的研究［J］. 糧食與飼料工業(yè)， 2002， （4）： 34-35.

WANG Yalin， YAN Jianfang， LI Rui， et al. Study on the solid fermentation technology of phytase［J］. Cereal amp; Feed Industry， 2002， （4）： 34-35.

［2］ Selle P H， Macelline S P， Chrystal P V， et al. The contribution of phytate-degrading enzymes to chicken-meat production［J］. Animals， 2023， 13（4）： 603.

［3］ Zhou J R， Jr Erdman J W. Phytic acid in health and disease［J］. Critical Reviews in Food Science and Nutrition， 1995， 35（6）： 495-508.

［4］ 何進， 徐思楊， 劉波， 等. 乳酸菌在農(nóng)業(yè)和食品加工中的應用研究進展［J］. 微生物學雜志， 2022， 42（4）： 1-11.

HE Jin， XU Siyang， LIU Bo， et al. Advance on applied researches of lactic acid bacteria in AgricuLture and food industry［J］. Journal of Microbiology， 2022， 42（4）： 1-11.

［5］ Borda-Molina D， Zuber T， Siegert W， et al. Effects of protease and phytase supplements on small intestinal microbiota and amino acid digestibility in broiler chickens［J］. Poultry Science， 2019， 98（7）： 2906-2918.

［6］ Pirgozliev V， Bedford M R. Energy utilisation and growth performance of chicken fed diets containing graded levels of supplementary bacterial phytase［J］. British Journal of Nutrition， 2013， 109（2）： 248-253.

［7］ Ajith S， Ghosh J， Shet D， et al. Partial purification and characterization of phytase from Aspergillus foetidus MTCC 11682［J］. AMB Express， 2019， 9（1）： 3.

［8］ Shah P C， Kumar V R， Dastager S G， et al. Phytase production by Aspergillus niger NCIM 563 for a novel application to degrade organophosphorus pesticides［J］. AMB Express， 2017， 7（1）： 66.

［9］ Trivedi S， Husain I， Sharma A. Purification and characterization of phytase from Bacillus subtilis P6： Evaluation for probiotic potential for possible application in animal feed［J］. Food Frontiers， 2022， 3（1）： 194-205.

［10］ Danial E N， Alkhalf M I. Purification and characterization of phytase from novel slated Bacillus cereus EME 48 and study its kinetic properties［J］. Journal of Pure and Applied Microbiology， 2016， 10（4）： 2521-2529.

［11］ akr E， Arc M， Durak M Z. Biodiversity and techno-functional properties of lactic acid bacteria in fermented hull-less barley sourdough［J］. Journal of Bioscience and Bioengineering， 2020， 130（5）： 450-456.

［12］ 張洪. 產(chǎn)植酸酶乳酸桿菌的篩選及對肉雞生長性能和糞磷排出量的影響［D］. 雅安： 四川農(nóng)業(yè)大學， 2009.

ZHANG Hong. Screening of Phytase-producing Lactobacilli and Their Effect on Growth Performance and Phosphrous Excretion of Broiler Chicken［D］. Yaan： Sichuan Agricultural University， 2009.

［13］ Sandez Penidez S H， Velasco Manini M A， Gerez C L， et al. Partial characterization and purification of phytase from Lactobacillus plantarum CRL1964 isolated from pseudocereals［J］. Journal of Basic Microbiology， 2020， 60（9）： 787-798.

［14］ Raghavendra P， Halami P M. Screening， selection and characterization of phytic acid degrading lactic acid bacteria from chicken intestine［J］. International Journal of Food Microbiology， 2009， 133（1/2）： 129-134.

［15］ Ahire J J， Jakkamsetty C， Kashikar M S， et al. In vitro evaluation of probiotic properties of Lactobacillus plantarum UBLP40 isolated from traditional indigenous fermented food［J］. Probiotics and Antimicrobial Proteins， 2021， 13（5）： 1413-1424.

［16］ 袁麗紅， 柳成東， 肖明霞， 等. 三株飼用枯草芽孢桿菌抑菌性能的比較研究［J］. 飼料工業(yè)， 2023， 44（1）： 87-95.

YUAN Lihong， LIU Chengdong， XIAO Mingxia， et al. Comparation on the antibacterial properties of three Bacillus subtilis strains［J］. Feed Industry， 2023， 44（1）： 87-95.

［17］ 王筍， 呂嘉櫪， 辛博， 等. 西北地區(qū)泡菜中乳酸桿菌的生物學特性［J］. 中國調(diào)味品， 2014， 39（3）： 15-18.

WANG Sun， LYU Jiali， XIN Bo， et al. Biological characteristics of lactic acid bacteria from pickles in northwest of China［J］. China Condiment， 2014， 39（3）： 15-18.

［18］ 趙小茜， 魏旭丹， 陳戴玲， 等. 產(chǎn)多糖植物乳桿菌的耐酸耐膽鹽能力［J］. 乳業(yè)科學與技術(shù)， 2016， 39（3）： 1-3.

ZHAO Xiaoxi， WEI Xudan， CHEN Dailing， et al. Acid and bile salt tolerance of exopolysaccharide-producing strains of Lactobacillus plantarum［J］. Journal of Dairy Science and Technology， 2016， 39（3）： 1-3.

［19］ 王祎然， 韋明明， 張涵， 等. 酸湯中乳酸菌的鑒定及其耐酸、耐膽鹽和抗氧化活性［J］. 食品工業(yè)科技， 2020， 41（16）： 121-126， 139.

WANG Yiran， WEI Mingming， ZHANG Han， et al. Identification， acid and bile salt tolerance， and antioxidant ability of lactic acid bacteria isolated from sour soup［J］. Science and Technology of Food Industry， 2020， 41（16）： 121-126， 139.

［20］ 馮秀娟， 左芳雷， 陳麗麗， 等. 乳酸菌耐酸耐膽鹽分析與膽鹽水解酶研究［J］. 中國食品學報， 2013， 13（11）： 139-147.

FENG Xiujuan， ZUO Fanglei， CHEN Lili， et al. Analysis of acid and bile salt tolerance and study on bile salt hydrolase in lactic acid bacteria［J］. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology， 2013， 13（11）： 139-147.

［21］ Merritt M E， Donaldson J R. Effect of bile salts on the DNA and membrane integrity of enteric bacteria［J］. Journal of Medical Microbiology， 2009， 58（Pt 12）： 1533-1541.

［22］ 向雙云， 周珍輝， 關(guān)文怡， 等. 來源于雞腸道的乳酸菌的篩選及其飼用性的評價［J］. 中國畜牧雜志， 2017， 53（2）： 97-101， 168.

XIANG Shuangyun， ZHOU Zhenhui， GUAN Wenyi， et al. Screening lactic acid bacteria derived from adult chicken intestinal gut and evaluation for their implications in chicken feeding［J］. Chinese Journal of Animal Science， 2017， 53（2）： 97-101， 168.

［23］ Sakandar H A， Kubow S， Sadiq F A. Isolation and in-vitro probiotic characterization of fructophilic lactic acid bacteria from Chinese fruits and flowers［J］. LWT， 2019， （104）： 70-75.

［24］ 楊曉宇， 張七斤， 于晨龍， 等. 不同來源乳酸菌的耐酸耐膽鹽試驗［J］. 動物醫(yī)學進展， 2014， 35（2）： 73-77.

YANG Xiaoyu， ZHANG Qijin， YU Chenlong， et al. Tolerance assays to acid and bile salt of Lactobacillus from different sources［J］. Progress in Veterinary Medicine， 2014， 35（2）： 73-77.

［25］ Chou L S， Weimer B. Isolation and characterization of acid- and bile-tolerant isolates from strains of Lactobacillus acidophilus［J］. Journal of Dairy Science， 1999， 82（1）： 23-31.

［26］ 覃志成， 周笑犁， 吳承木， 等. 番茄發(fā)酵液中乳酸桿菌的分離鑒定及對模擬胃腸液耐受性研究［J］. 食品與生物技術(shù)學報， 2023， 42（8）： 54-61.

QIN Zhicheng， ZHOU Xiaoli， WU Chengmu， et al. Isolation and identification of Lactobacillus in tomato fermentation broth and investigation of its tolerance to simulated gastrointestinal environment［J］. Journal of Food Science and Biotechnology， 2023， 42（8）： 54-61.

［27］ 程秀芳， 王叢叢， 谷巍. 乳酸菌在體外模擬胃腸環(huán)境中的抗性研究及其發(fā)酵特性［J］. 齊魯藥事， 2012， 31（1）： 6-8.

CHENG Xiufang， WANG Congcong， GU Wei. Study on the tolerance in vitro imitative gastroenteric environment and the fermentation properties of lactobacillus［J］. Journal of Pharmaceutical Research， 2012， 31（1）： 6-8.

［28］ Trunk T， Khalil H S， Leo J C. Bacterial autoaggregation［J］. AIMS Microbiology， 2018， 4（1）： 140-164.

［29］ Khan F， Tabassum N， Kim Y M. A strategy to control colonization of pathogens： embedding of lactic acid bacteria on the surface of urinary catheter［J］. Applied Microbiology and Biotechnology， 2020， 104（21）： 9053-9066.

［30］Xin G， Porres Jm， Mullaney ， et al. Phytase： source， structure and ［J］. Industrial Enzymes： Structure， Function and Applications， 2007： 505-529.

［31］ 曹偉超， 羅昆， 程新， 等. 高產(chǎn)植酸酶乳酸菌及其黑豆酸面團發(fā)酵低植酸營養(yǎng)面包研究［J］. 食品與機械， 2021， 37（2）： 186-193.

CAO Weichao， LUO Kun， CHENG Xin， et al. Studies on screening of high-yield phytase-producing lactic acid bacteria and its low-phytate nutritional breads through black bean sourdough fermentation［J］. Food amp; Machinery， 2021， 37（2）： 186-193.

［32］ 麥日艷古·亞生， 伊力米熱·熱夏提， 努爾古麗·熱合曼. 北疆傳統(tǒng)發(fā)酵生奶酪中乳酸菌的耐受性及益生特性測定［J］. 微生物學通報， 2023， 50（5）： 2044-2062.

Mairiyangu Yasheng， Yilimire rexiati， Nuermanguli Reheman.Tolerance and probiotic characteristics of lactic acid bacteria in traditional fermented raw cheese in northern Xinjiang［J］. Microbiology China， 2023， 50（5）： 2044-2062.

［33］ Heo J， Shin D， Chang S Y， et al. Comparative genome analysis and evaluation of probiotic characteristics of Lactobacillus plantarum strain JDFM LP11［J］. Korean Journal for Food Science of Animal Resources， 2018， 38（5）： 878-888.

［34］吳雨甍，孫羊羊，尹亞格，等．醬香型白酒酒醅中乳酸菌的分離鑒定及其益生特性研究 ［J］. 中國釀造， 2023， 42（4）： 76-82.

WU Yumeng， SUN Yangyang， YIN Yage， et al. Isolation identification and probiotic characteristics of lactic acid bacteria in fermented grains of sauce-flavor Baijiu ［J］. China Brewing， 2023， 42（4）： 76-82.

［35］ 鮑國櫻， 余行， 王孝義， 等. 散養(yǎng)云南地方豬源乳酸菌分離、鑒定及其益生特性的研究［J］. 動物營養(yǎng)學報， 2023， 35（8）： 5418-5429.

BAO Guoying， YU Hang， WANG Xiaoyi， et al. Isolation， identification and probiotic characteristics of lactic acid bacteria derived from free range local pigs in Yunnan Province［J］. Chinese Journal of Animal Nutrition， 2023， 35（8）： 5418-5429.

Screening of phytase producing probiotic lactic acid bacteria

WANG Haozhong1，2， LIN Qing2， ZENG Jun2， GAO Yan2， ZHAO Yanhui3， SHI Hongling2， MA Guijun3， MA Zhenghai1， LOU Kai2， HUO Xiangdong2

（1.College of Life Science and Technology， Xinjiang University， Urumqi 830046， China; 2. Xinjiang Laboratory of Special Environmental Microbiology / Institute of Microbiology， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences， Urumqi 830091， China; 3.Xinjiang Tiankang Feed Co.， Ltd， Wujiaqiu Xinjiang 750300， China）

Abstract：【Objective】 To isolate and characterization phytase production probiotic lactic acid bacteria.

【Methods】 Morphologically different strains were isolated from fermented feed， boza and Jiangshui. Through enzyme production screening and 16S rDNA molecular identification， phytase producing lactic acid bacteria strains were obtained and evaluated through acid tolerance， bile salt tolerance， intestinal and gastric juice tolerance， self-aggregation ability， and antibacterial analysis.

【Results】 Four phytase producing lactic acid bacteria were identified. Among them， strain JS5， which was 100% similar to Lactobacillus paracasei JCM 1171， with a maximum phytase activity of 0.83 U/mL. The strain was designated as lactobacillus paracasei. The survival rate of strain JS5 under pH 3 was as high as 100%. At a bile salt concentration of 0.1%， the survival rate of JS5 was 0.55%. In simulated gastric juice and intestinal juice， the survival rates were 8.56% and 0.38%，respectively， and the number of viable bacteria was above 1×106CFU/mL， which was the lowest viable bacteria number with beneficial effects. The self-aggregation ability of strain JS5 was （9.69±0.44）， which can promote the colonization of strain JS5 in the intestine. It had inhibitory effects on Escherichia coli， Salmonella， Staphylococcus aureus， Candida albicans， and Pseudomonas aeruginosa.

【Conclusion】 Lactobacillus paracasei JS5 has a high phytase production and can survive in simulated gastrointestinal fluid. It has good cell adhesion ability and inhibits the growth of pathogenic bacteria and can be used as a probiotics for livestock and poultry.

Key words：lactic acid bacteria; phytase; screen

Fund projects：Key R amp; D Program of Xinjiang Production and Construction Corps （2022AB013）; Project for Stable Support to Agricultural Sci-Tech Renovation（xjnkywdzc-2023005-6）

Correspondence author：LOU Kai（1968-）， male， from Henan， professor， research direction： microbiology， （E-mail）loukai02@mail.tsinghua.edu.cn

HUO Xiangdong（1977-）， male， from Gansu， associate professor， research direction： microbial resources， （E-mail）xiangdonghuo@163.com

收稿日期（Received）：2024-02-14

基金項目：新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團重點研發(fā)計劃專項（2022AB013）；農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新穩(wěn)定支持項目（xjnkywdzc-2023005-6）

作者簡介：王浩中（1997-），男，甘肅人，碩士研究生，研究方向為微生物學，（E-mail）490335311@ qq.com

通訊作者：婁愷（1968-），男，河南人，研究員，博士，研究方向為微生物學，（E-mail）loukai02@mail.tsinghua.edu.cn

霍向東（1974-），男，甘肅人，副研究員，博士，研究方向為微生物資源，（E-mail）xiangdonghuo@163.com