摘 要：為深入了解益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的潛在益處，從魚池底泥中分離得到兩株微生物，分別為沙福芽孢桿菌（Bacillus safensis）BS-1和德爾布乳酸菌（Lactobacillus delbrueckii）LL-1，將這兩株益生菌添加到黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）魚苗的飼料中，進(jìn)行為期28 d的養(yǎng)殖試驗(yàn)，評估其對黃顙魚生長指標(biāo)和肌肉營養(yǎng)成分的影響及效果。結(jié)果表明，相較于未添加益生菌的對照組（CK），添加BS-1d的BS組黃顙魚魚苗的體重、增重率和特定增長率都有顯著提升（Plt;0.05），飼料系數(shù)有顯著優(yōu)化（Plt;0.05）；添加LL-1的LL組黃顙魚魚苗的體重、增重率和特定增長率都有極顯著提升（Plt;0.01），飼料系數(shù)則有顯著優(yōu)化（Plt;0.05）。此外，兩種益生菌對黃顙魚魚苗的肌肉營養(yǎng)成分有一定影響，BS組和LL組黃顙魚的肌肉水分、灰分含量相較于CK組黃顙魚的肌肉水分、灰分含量差別不大，但肌肉粗蛋白含量顯著高于CK組（Plt;0.05），BS組與CK組相比，肌肉粗脂肪含量無顯著差異，而LL組的肌肉粗脂肪含量顯著高于CK組（Plt;0.05）。

關(guān)鍵詞：黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）；沙福芽孢桿菌（Bacillus safensis）；德爾布乳酸菌（Lactobacillus delbrueckii）；肌肉；營養(yǎng)成分；生長指標(biāo)

隨著近年來全球人口密度的不斷增加，對水產(chǎn)品的需求也呈逐漸增長趨勢，尤其是對高品質(zhì)水產(chǎn)品的需求日益提升。然而，水產(chǎn)養(yǎng)殖密度的增大不僅容易引發(fā)水產(chǎn)動物疾病，還可能導(dǎo)致環(huán)境問題[1-3]。為應(yīng)對這一挑戰(zhàn)，急需尋找一種綠色環(huán)保、安全有效的技術(shù)手段來解決高密度養(yǎng)殖所帶來的問題。益生菌輔助水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)在解決這一難題上表現(xiàn)出良好的效果，并展現(xiàn)了廣泛的應(yīng)用前景[4]。

黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）作為我國優(yōu)質(zhì)淡水養(yǎng)殖魚類之一，以其鮮美的肉質(zhì)和豐富的營養(yǎng)而聞名。目前黃顙魚的產(chǎn)量較低，尤其在集約化養(yǎng)殖下，常面臨體色異常和魚肉品質(zhì)下降等問題。因此，尋找解決這些問題的有效途徑顯得尤為重要。益生菌輔助水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)在解決水產(chǎn)養(yǎng)殖難題方面表現(xiàn)出良好的效果，包括但不限于提高養(yǎng)殖效率、改善魚體生長指標(biāo)、激發(fā)免疫系統(tǒng)、降解水體中有害物質(zhì)等方面[5-9]。芽孢桿菌屬、乳酸菌屬的微生物是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)常見的飼料添加益生菌。然而，將這些微生物應(yīng)用于黃顙魚養(yǎng)殖的研究較少。因此，篩選獲得能改善黃顙魚養(yǎng)殖的應(yīng)用益生菌有重要的科研和經(jīng)濟(jì)意義，同時為進(jìn)一步應(yīng)用益生菌制劑在黃顙魚高密度水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)方面提供理論依據(jù)，有著很好的前景。

本研究通過從池塘底泥之中篩選出芽孢桿菌屬和乳酸菌屬的微生物，將其添加至黃顙魚的日常養(yǎng)殖飼料中，以探究其在黃顙魚魚苗生長和肌肉營養(yǎng)成分上帶來的生物學(xué)效果。通過數(shù)據(jù)計(jì)算和分析，評估不同添加微生物對黃顙魚的體重增長率、特定生長率和飼料系數(shù)的影響，并進(jìn)行肌肉常規(guī)營養(yǎng)成分的測定。本研究旨在為選擇適宜用作黃顙魚飼料添加的益生菌提供理論依據(jù)，推動益生菌制劑在黃顙魚高密度水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的進(jìn)一步應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 底泥樣品 于一魚池中采集底泥樣本。采集過程如下：于目標(biāo)池塘選中間距1.5 m的三個采樣點(diǎn)，每個采樣點(diǎn)使用經(jīng)過滅菌處理的聚乙烯瓶采集約20 g底泥樣本，將聚乙烯瓶置于裝有冰塊的泡沫保存箱中，并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。在無菌條件下，從三瓶聚乙烯瓶中各稱量10.0 g底泥樣本，混合均勻后形成綜合底泥樣本，以備后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.1.2 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基和分離純化培養(yǎng)基的成分詳見表1和表2，其中表1列示了芽孢桿菌菌株所需的富集培養(yǎng)基和分離純化培養(yǎng)基成分；表2則詳細(xì)描述了乳酸菌菌株相應(yīng)的培養(yǎng)基成分。

1.1.3 試驗(yàn)試劑和儀器 試驗(yàn)試劑均為國產(chǎn)分析純。試驗(yàn)儀器如表3所示。

1.1.4 黃顙魚魚苗和菌懸液 選取體長4.50～5.00 cm，體質(zhì)量2.0～2.5 g的黃顙魚魚苗350尾。備好之前篩選活化的BS-1、LL-1菌液。

1.1.5 飼料 黃顙魚魚苗飼料基礎(chǔ)配方如表4所示。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 芽孢桿菌屬菌株的篩選及形態(tài)觀察 選取10.0 g底泥樣本，無菌水100倍稀釋，并在80 ℃條件下預(yù)處理20 min。隨后，采用LB培養(yǎng)基涂布篩選，獲得芽孢桿菌屬候選菌株，觀察菌落的表面形態(tài)與顏色，拍照記錄結(jié)果。隨后，對這些候選菌株進(jìn)行進(jìn)一步的篩選和鑒定。

1.2.2 乳酸菌屬菌株的篩選及形態(tài)觀察 同樣，取10.0 g底泥樣本，用生理鹽水稀釋100倍，隨后使用添加了無菌碳酸鈣懸濁液的MRS培養(yǎng)基進(jìn)行涂布篩選，獲得帶有透明圈的乳酸菌候選菌株，觀察菌落的表面形態(tài)與顏色，拍照記錄結(jié)果。再對這些候選菌株進(jìn)行篩選鑒定。

1.2.3 菌懸液的制備 取活化好的菌懸液按5 %（v/v）接種量接種于對應(yīng)培養(yǎng)液中，37 ℃條件下，175 r/min搖床培養(yǎng)，16 h后，3 500 r/min離心15 min，用已滅菌的生理鹽水將菌液調(diào)至相應(yīng)的濃度。

1.2.4 菌株的16S rRNA序列分析與分子鑒定

1.2.4.1 16S rDNA序列測定 將芽孢桿菌屬候選菌株菌懸液和乳酸菌候選菌株菌懸液送至檢測公司進(jìn)行16S rRNA序列測定，獲得菌株的16S rRNA序列。

1.2.4.2 構(gòu)建菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹 將獲得的菌株序列通過NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blast比對，利用生物信息學(xué)軟件Mega11進(jìn)行序列對比分析并基于16S rRNA序列構(gòu)建菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 黃顙魚養(yǎng)殖試驗(yàn)的前處理 在一個統(tǒng)一管理的魚池內(nèi)設(shè)置了9個獨(dú)立的網(wǎng)箱，以實(shí)現(xiàn)不同處理組的隔離飼養(yǎng)。在試驗(yàn)開始前，排水、清潔魚池內(nèi)壁，注入新水并等待一晚，以確保水質(zhì)穩(wěn)定。試驗(yàn)前將全部魚苗置于潔凈魚缸中不飼喂靜置24 h，檢查黃顙魚魚苗生理狀態(tài)，選擇體表無傷痕、游動姿態(tài)正常健康的魚苗300尾。在黃顙魚入池前，采用濃度為2%的鹽水浸浴5 min處理，以減少可能的病原體負(fù)載。

1.2.6 黃顙魚養(yǎng)殖試驗(yàn)的分組及過程設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)共設(shè)置3個處理組，對照組（CK）、芽孢桿菌處理組（BS）以及乳酸菌處理組（LL），每組包含30尾黃顙魚魚苗，且每組設(shè)置3次重復(fù)。飼料具體配方如表4，其中對照組飼料僅使用無菌水調(diào)配，益生菌處理組飼料則分別添加相應(yīng)菌液，具體菌液添加量見表5。

各組魚苗每日定時投喂2次對應(yīng)飼料，每次投喂量均為1 g。每隔2 d更換70%的新水以維持良好的水質(zhì)環(huán)境。每個網(wǎng)箱內(nèi)安裝1臺增氧設(shè)備，以保證黃顙魚在養(yǎng)殖過程中不出現(xiàn)缺氧狀況。同時，通過適時施用生石灰或降堿靈等水質(zhì)調(diào)節(jié)劑，將水體pH值控制在適宜黃顙魚生長的弱堿性范圍。整個試驗(yàn)時間為28 d。在此期間，每日監(jiān)測并記錄黃顙魚的攝食情況、生理反應(yīng)及健康狀態(tài)。

1.2.7 黃顙魚體重及生長性能參數(shù)測定 在開始試驗(yàn)前（第0天）和試驗(yàn)結(jié)束日使用精密電子天平對魚體進(jìn)行稱重，稱重前盡量去除魚體表面水分，確保數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。據(jù)此，計(jì)算各組黃顙魚魚苗的體重增長率（WGR，%）、特定生長率（SGR，%）和飼料系數(shù)（FCR）。

計(jì)算公式如下：

個試驗(yàn)組魚總數(shù)。

1.2.8 黃顙魚肌肉常規(guī)營養(yǎng)成分的測定方法 采用GB 5009.3-2016 第一法（直接干燥法）測定黃顙魚肌肉水分；采用GB 5009.5-2016 第一法（凱氏定氮法）測定黃顙魚肌肉粗蛋白；采用GB 5009.6-2016 第二法（酸水解法）測定黃顙魚肌肉粗脂肪；采用GB 5009.4-2016 第一法測定黃顙魚肌肉粗灰分。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件對各組別魚苗的生理和生化數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（LSD法），若各組間存在顯著性差異，則進(jìn)一步進(jìn)行Duncan多重比較檢驗(yàn)，設(shè)定顯著性水平P＜0.05為顯著，P＜0.01為極顯著。所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 鑒定結(jié)果 芽孢桿菌屬候選菌株通過在固體培養(yǎng)基上涂布后，其單菌落表面特征如圖1、圖2，其菌落特征如表6；乳酸菌屬候選菌株通過在固體培養(yǎng)基上涂布后，其單菌落表面特征如圖3、圖4，其菌落特征如表6。

2.1.2 16S rRNA序列分析與分子鑒定結(jié)果 獲得的芽孢桿菌屬候選菌株的16S rRNA的序列長度為1 468 bp。將序列通過NCBI網(wǎng)站比對后發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌屬候選菌株與芽孢桿菌屬Bacillus safensis細(xì)菌高度相似，并根據(jù)構(gòu)建的芽孢桿菌屬候選菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5）可以得出芽孢桿菌屬候選菌株屬于沙福芽孢桿菌。

獲得的乳酸菌候選菌株的16S rRNA的序列長度為1 591 bp。將序列通過NCBI網(wǎng)站比對后發(fā)現(xiàn)，乳酸菌候選菌株與乳桿菌屬Lactobacillus delbrueckii細(xì)菌高度相似，并根據(jù)構(gòu)建的乳酸菌候選菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖6）可以得出乳酸菌候選菌株屬于德爾布乳桿菌。

鑒定后，將沙福芽孢桿菌命名為BS-1；將德爾布乳桿菌命名為LL-1。活化稀釋獲得BS-1、LL-1菌液。

2.1.3 體重及生長性能的統(tǒng)計(jì)分析 表7詳細(xì)記錄了各組黃顙魚魚苗的初始體重、終末體重以及相關(guān)的生長性能指標(biāo)，包括增重率、特定增長率和飼料系數(shù)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如下：相對于CK組，BS組魚苗的平均終末質(zhì)量顯著性增加（P＜0.05），而LL組魚苗的終末體重提升更為顯著，達(dá)到了極顯著差異水平（P＜0.01）；在增重率方面，BS組黃顙魚魚苗增重率達(dá)到15.02%，顯著高于CK組（P＜0.05），LL組增重率更是高達(dá)14.31%，極顯著高于CK組（P＜0.01）；同樣，對于特定增長率這一關(guān)鍵生長性能指標(biāo)，BS組與CK組相比顯示出了顯著性優(yōu)勢（P＜0.05），而LL組的表現(xiàn)更為突出，其特定增長率與CK組的差距達(dá)到了極顯著水平（P＜0.01）。此外，在飼料效率方面，無論是BS組還是LL組，其飼料系數(shù)相較于CK組均有顯著下降（P＜0.05），這意味著兩株益生菌的添加有助于提高飼料利用效率，促進(jìn)黃顙魚魚苗更高效地生長。

2.1.4 肌肉常規(guī)營養(yǎng)成分的定量分析 表8顯示了各組試驗(yàn)后黃顙魚肌肉中的水分、粗蛋白、粗脂肪和灰分含量。在肌肉水分與灰分這兩個指標(biāo)上，經(jīng)過對比分析，BS組和LL組與CK組之間的差異并不顯著；然而，在肌肉粗蛋白含量方面，BS組和LL組均表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，其中BS組黃顙魚肌肉的粗蛋白含量為16.477%，LL組為15.725%，均顯著高于CK組黃顙魚肌肉的粗蛋白含量（P＜0.05），這表明兩株益生菌的應(yīng)用對提高黃顙魚肌肉中蛋白質(zhì)積累具有積極作用。至于肌肉粗脂肪含量，BS組與對照組之間并無顯著差異；然而，LL組黃顙魚肌肉的粗脂肪含量為3.416%，顯著高于CK組（P＜0.05），這一結(jié)果揭示了乳酸菌處理對黃顙魚肌肉脂肪含量可能產(chǎn)生的獨(dú)特影響，值得進(jìn)一步研究探討。

3 討論

3.1 BS-1和LL-1益生菌對黃顙魚生長性能的影響及其機(jī)理探討

水產(chǎn)動物生長性能和飼料轉(zhuǎn)化效率是衡量養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益的關(guān)鍵指標(biāo)，尋求能有效提升生長性能并優(yōu)化飼料轉(zhuǎn)化率的優(yōu)質(zhì)飼料添加劑，對現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)至關(guān)重要。已有研究表明，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis Ch9）作為草魚飼料中的益生菌添加劑，能夠顯著提升草魚體重，并顯示出更好的餌料系數(shù)[10]。其它芽孢桿菌種類，如解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）和短小芽孢桿菌（B. pumilus）被證實(shí)能在短期內(nèi)提高尼羅羅非魚的生長速率；而單獨(dú)添加B. subtilis ATCC 6633也能顯著增強(qiáng)尼羅羅非魚的個體重量和飼料轉(zhuǎn)化率[11-13]。此類益生菌通過其生理活性和代謝產(chǎn)物在水產(chǎn)動物腸道內(nèi)發(fā)揮作用，促進(jìn)水產(chǎn)動物的生長發(fā)育、激活免疫系統(tǒng)，從而提升整體生長性能[14-15]。本研究中，飼料添加沙福芽孢桿菌BS-1后，試驗(yàn)組黃顙魚的增重率提升到15.02%，顯著高于對照組（Plt;0.05），同時飼料轉(zhuǎn)化率也要顯著高于對照組。顯示了沙福芽孢桿菌BS-1不僅可以有效提升黃顙魚魚苗的體重和增重率，還可以提高飼料利用效率。乳酸菌作為一類廣泛存在于自然界的厭氧或兼性厭氧菌，在動物腸道微生態(tài)中也扮演著重要角色。當(dāng)乳酸菌作為飼料添加劑應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖時，能夠促進(jìn)宿主體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、增強(qiáng)免疫力[16]。此前的研究中，乳桿菌屬（Lactobacillus）同樣被證實(shí)可提高大菱鲆（Scophthalmus maximus）的生長速率[17]。本研究中，德爾布乳酸菌LL-1極顯著地提高了黃顙魚體重和增重率（P＜0.01），同時顯著優(yōu)化了飼料系數(shù)（P＜0.05），體現(xiàn)出了促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收這一生物學(xué)功能。進(jìn)一步證明了乳酸菌也是一種適用于水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料添加的益生菌菌種[18]。

深入探討益生菌改善水產(chǎn)動物營養(yǎng)吸收能力的機(jī)制，目前認(rèn)為主要包括以下幾個方面：首先，益生菌可通過調(diào)控水產(chǎn)動物消化道內(nèi)消化酶活性來增進(jìn)營養(yǎng)吸收。例如，枯草芽孢桿菌（B. subtilis strains L10，G1）能提高凡納濱對蝦消化酶活性，而嗜酸乳桿菌（L.acidophilus）對凡納濱對蝦消化器官內(nèi)的多種酶活性具有顯著增強(qiáng)效應(yīng)，特別是對腸道中的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性影響尤為顯著[7， 18]。其次，益生菌還能夠改變腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)，增加腸道絨毛長度和寬度，進(jìn)而改善腸道的營養(yǎng)吸收機(jī)能[19]。例如，任雪[20]發(fā)現(xiàn)，熱滅活的植物乳桿菌（L. plantarum）和復(fù)合益生菌（GH35A，GH35B）的組合對凡納濱對蝦腸壁增厚和腸道絨毛排列有序度具有積極作用。另有研究指出，添加枯草芽孢桿菌（B. subtilis BS1 （MW447607））、植物乳桿菌（L. plantarum LP1 （MW447608））以及糞腸球菌（Enterococcus faecalis EF1 （MW447606））至鱸魚飼料中，連續(xù)飼喂8周后，鱸魚腸道絨毛長度和腸壁高度明顯增加[21]。此外，某些益生菌能夠分泌胞外酶，如乳酸菌產(chǎn)生的脂肪酶和蛋白酶等，能夠分解食物中的大分子有機(jī)物，從而促進(jìn)水產(chǎn)動物的消化吸收能力[22]。針對后者，篩選具有胞外酶生產(chǎn)能力的益生菌時，重點(diǎn)應(yīng)關(guān)注其代謝產(chǎn)物的檢測與分析。

3.2 BS-1和LL-1益生菌對黃顙魚肌肉營養(yǎng)品質(zhì)的影響

近年來，黃顙魚等經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類的肌肉品質(zhì)成為研究熱點(diǎn)，而肌肉營養(yǎng)成分的豐富程度被視為評價(jià)水產(chǎn)魚類肌肉品質(zhì)的核心指標(biāo)[23]。在諸多營養(yǎng)成分中，粗蛋白和粗脂肪含量尤為重要，因其直接影響魚肉營養(yǎng)價(jià)值的高低，間接反映魚肉品質(zhì)[24]。先前研究中，趙怡迪[25]指出，在鯉飼料中添加由嗜酸乳桿菌（L. acidophilus）、枯草芽孢桿菌（B. subtilis）和紅法夫酵母（P. rhodozyma）組成的復(fù)合益生菌，能夠顯著提高鯉肌肉中的蛋白質(zhì)含量（P＜0.05），并且能有效抑制嗜水氣單胞菌感染導(dǎo)致的肌肉水分升高、蛋白質(zhì)和脂肪含量下降等不良反應(yīng)。另外一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，將包含乳酸菌、芽孢桿菌等多種有益菌株配制而成的混合菌液添加至鯽飼料中，在適宜添加量（0.4%）下，試驗(yàn)組鯽肌肉的蛋白質(zhì)含量和灰分含量相較于對照組均表現(xiàn)出顯著提升（P＜0.05），證實(shí)了混合益生菌對肌肉營養(yǎng)品質(zhì)的優(yōu)化作用[26]。在本研究中，相較于CK組，試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示BS組和LL組黃顙魚肌肉的粗蛋白含量均有顯著提升（P＜0.05），同時LL組的肌肉粗脂肪也顯著提高（P＜0.05）。這充分證明了沙福芽孢桿菌BS-1和德爾布乳酸菌LL-1對黃顙魚魚苗肌肉營養(yǎng)成分具有積極的改良效果，能夠有效提升黃顙魚肌肉的營養(yǎng)價(jià)值和品質(zhì)。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，將沙福芽孢桿菌BS-1菌株作為飼料添加劑，其對黃顙魚魚苗的生長性能產(chǎn)生了顯著積極影響，具體表現(xiàn)為魚體體重（P＜0.05）、增重率（P＜0.05）和特定增長率（P＜0.05）；而德爾布乳酸菌LL-1菌株在飼料中的表現(xiàn)更為突出，能夠極顯著地提高黃顙魚魚苗的魚體體重（P＜0.01）、增重率（P＜0.01）和特定增長率（P＜0.01）；同時，無論BS-1菌株還是LL-1菌株的添加，均能顯著改善黃顙魚魚苗的飼料系數(shù)（P＜0.05）。由此，BS-1菌株和LL-1菌株均可作為黃顙魚魚苗的有效功能益生菌，其添加可顯著提高魚苗的生長速度和飼料利用率，從而有望在一定程度上提升黃顙魚養(yǎng)殖的產(chǎn)量并減少飼料消耗。

在肌肉營養(yǎng)成分方面，BS-1菌株作為飼料添加劑能夠顯著提高黃顙魚魚苗肌肉中粗蛋白含量（P＜0.05）；與此同時，LL-1菌株的添加不僅顯著增加了肌肉中粗蛋白含量（P＜0.05），而且還顯著提高了粗脂肪含量（P＜0.05）。據(jù)此，兩種益生菌可作為功能性飼料添加劑，有效提高黃顙魚的肌肉營養(yǎng)價(jià)值。相較而言，在改善黃顙魚魚苗肌肉營養(yǎng)成分方面的效果更優(yōu)，可視為更佳的飼料功能益生菌選擇。

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