摘 要：為給寧德市南美白對(duì)蝦（Penaeus vannmei）養(yǎng)殖病害提供精準(zhǔn)用藥依據(jù)，從7個(gè)海水養(yǎng)殖場(chǎng)南美白對(duì)蝦體內(nèi)分離病原菌，通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化和16s rRNA鑒定，確定其分類地位，并進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)。結(jié)果表明，分離的9株病原菌在TCBS瓊脂培養(yǎng)基中菌落均呈藍(lán)-綠色，通過革蘭氏染色鏡檢可見為革蘭氏陰性菌，呈棒狀、弧狀、卵圓狀，無芽孢。在氧化酶反應(yīng)、葡萄糖、賴氨酸、鳥氨酸、甘露醇、6%鹽胨水、8%鹽胨水、動(dòng)力等8項(xiàng)試驗(yàn)中，結(jié)果呈陽性，確定為副溶血弧菌。9株副溶血弧菌對(duì)青霉素、新霉素、四環(huán)素等3種藥物耐受比例較高，對(duì)恩諾沙星、呋喃唑酮、萬古霉素等6種藥物均高度敏感。

關(guān)鍵詞：南美白對(duì)蝦（Penaeus vannmei）；副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）；分離鑒定；藥敏試驗(yàn)

南美白對(duì)蝦（Penaeus vannmei）又名凡納濱對(duì)蝦，因其生長(zhǎng)速度快、鹽度適應(yīng)強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)效益好等特點(diǎn)，生產(chǎn)區(qū)域在我國(guó)廣泛分布，也是對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的品種之一[1-2]。根據(jù)寧德市漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒，2022年全市南美白對(duì)蝦海水養(yǎng)殖產(chǎn)量2.16萬t，淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量0.21萬t，全市南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖以海水養(yǎng)殖為主[3]。伴隨著南美白對(duì)蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展，病害問題成為制約南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸，當(dāng)前南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖過程中病害種類多、發(fā)展快，主要的病害有病毒性疾?。ò装呔C合征、肝胰腺壞死病等）和細(xì)菌性疾?。t腿病、腸炎病、白便綜合征等）[4-7]，其中又以細(xì)菌性疾病最為常見。

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一種嗜鹽性的革蘭氏陰性菌，也是南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖中細(xì)菌性疾病最主要的致病菌，會(huì)造成對(duì)蝦急性肝胰腺壞死?。ˋHPND），是近年來導(dǎo)致全球?qū)ξr養(yǎng)殖大規(guī)模減產(chǎn)的重要病害之一[8]，同時(shí)該菌也是水產(chǎn)品中典型的食源性致病菌，誤食易引起人體急性腸胃炎[9]。如何在南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖過程中科學(xué)“處理”副溶血弧菌，對(duì)養(yǎng)殖效益至關(guān)重要，當(dāng)前應(yīng)對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖病害還是以使用抗生素藥品為主，若長(zhǎng)期、大量使用抗生素會(huì)使病原菌產(chǎn)生抗藥性，對(duì)水產(chǎn)品質(zhì)量安全和人類健康造成潛在危害[10]。

筆者從福建省寧德市蕉城區(qū)、福鼎市和霞浦縣等沿海地區(qū)7個(gè)海水養(yǎng)殖場(chǎng)在養(yǎng)南美白對(duì)蝦分離出病原菌，并進(jìn)行生理生化特征和藥敏特性分析鑒定，旨在為寧德地區(qū)南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖病害防治提供精準(zhǔn)用藥依據(jù)，科學(xué)指導(dǎo)養(yǎng)殖戶健康養(yǎng)殖。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)樣品分別于2022年3月、5月從蕉城區(qū)、福鼎市和霞浦縣南美白對(duì)蝦海水養(yǎng)殖場(chǎng)隨機(jī)采集健康生長(zhǎng)無病害的南美白對(duì)蝦，共計(jì)9份。其中，蕉城區(qū)3份樣品于2022年3月采自蕉城區(qū)A養(yǎng)殖場(chǎng)的不同養(yǎng)殖池；福鼎市3份樣品于2022年5月分別采自福鼎市B、C、D養(yǎng)殖場(chǎng)；霞浦縣3份樣品于2022年5月分別采自霞浦縣E、F、G養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離 將南美白對(duì)蝦肝、胰腺組織用一次性無菌接菌環(huán)在TCBS瓊脂培養(yǎng)基上劃線，放置在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，再將單個(gè)菌落在液體BHI培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)。

1.2.2 病原菌生理生化鑒定 對(duì)純化菌株進(jìn)行革蘭氏染色，將單個(gè)菌落按照生化鑒定試劑說明書操作，培養(yǎng)觀察反應(yīng)現(xiàn)象。

1.2.3 病原菌分子鑒定 通過通用16S rRNA引物27F/1492R進(jìn)行基因擴(kuò)增。引物序列為27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’;1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。反應(yīng)體系：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL、上下游引物各1 μL、DNA模板0.5 μL、ddH2O 10 μL；反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送生工生物工程 （上海） 股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information， NCBI）網(wǎng)站比對(duì)。

1.2.4 病原菌藥敏特性測(cè)定

結(jié)合水產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)際生產(chǎn)過程中可能使用的9大類18種抗生素的藥敏特性進(jìn)行測(cè)定，其中包括氯霉素類抗生素：氯霉素（chloroamphenicol）；硝基呋喃類抗生素2種：呋喃唑酮（furazolidone）、呋喃妥因（furadantin）；β內(nèi)酰胺類抗生素2種：新生霉素（novobiocin）、青霉素（penicillin）；氨基糖苷類抗生素5種：新霉素（neomycin）、鏈霉素（streptomycin）、萬古霉素（vancomycin）、卡那霉素（kanamycin）、慶大霉素（gentamicin）；喹諾酮類抗生素3種：氧氟沙星（ofloxacin）、諾氟沙星（norfloxacin）、恩諾沙星（enrofloxacin）；四環(huán)素類抗生素2種：四環(huán)素（tetracycline）、多西環(huán)素（doxycycline）；大環(huán)內(nèi)酯類：紅霉素（erythromycin）；磺胺類抗生素：復(fù)方新諾明（trimethoprim/sulfamethoxazole）；利福霉素類抗生素：利福平（rifampin）。

將純化好的菌株接種到TSA瓊脂培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)24 h，然后用滅菌生理鹽水無菌操作洗下菌落，并用麥?zhǔn)媳葷嵴{(diào)到0.5；用移液器取100 μL菌液于培養(yǎng)基上，均勻涂布在MH培養(yǎng)基表面，每次涂布完1/3平板時(shí)即將平板旋轉(zhuǎn)60°直至涂滿整個(gè)平板，連續(xù)涂布3次，以保證涂布均勻；再分別依次貼上18種藥敏紙片，每塊平板貼4片，28 ℃溫箱中正置培養(yǎng)30 min后再倒置過夜培養(yǎng)，判定結(jié)果，每次試驗(yàn)均重復(fù)三次。本研究所用藥敏紙片為杭州濱和微生物試劑有限公司生產(chǎn)，藥敏特性參照該公司的《紙片法藥敏試驗(yàn)抑菌圈直徑判斷標(biāo)準(zhǔn)》和美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）所給出副溶血弧菌相關(guān)抗生素敏感性標(biāo)準(zhǔn)作為判定依據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 病原菌分離結(jié)果

蕉城區(qū)A養(yǎng)殖場(chǎng)不同養(yǎng)殖池樣品分離出3株菌株，分別命名為JX1、JX2、JX3；福鼎市B、C、D養(yǎng)殖場(chǎng)樣品分離出3株菌株，分別命名為FD1、FD2、FD3；霞浦縣E、F、G養(yǎng)殖場(chǎng)樣品各分離出1株菌株，分別命名為XP1、XP2、XP3。

2.2 病原菌生理生化鑒定結(jié)果

9株病原菌在TCBS瓊脂培養(yǎng)基中菌落均呈藍(lán)-綠色，通過革蘭氏染色鏡檢可見為革蘭氏陰性菌，呈棒狀、弧狀、卵圓狀，無芽孢。由生理生化鑒定結(jié)果可知（表1），9株病原菌特征與《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)》（GB 4789.7-2013）中副溶血弧菌主要特征完全符合。

2.3 病原菌分子鑒定結(jié)果

將獲得的序列在Gen Bank數(shù)據(jù)中進(jìn)行同源序列比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)序列相似性高的大部分為副溶血弧菌，與致病性副溶血弧菌有99%的同源性，經(jīng)生理生化鑒定與副溶血弧菌指標(biāo)一致。最終根據(jù)生理生化鑒定和16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果，確定分離的9株菌均為副溶血弧菌。

2.4 病原菌的藥敏特性

由藥敏試驗(yàn)結(jié)果（表2）可知，9株副溶血弧菌中，除編號(hào)為XP1的副溶血弧菌對(duì)18種藥物均高度敏感外，其余菌株對(duì)18種藥物均有不同程度的耐藥，其中FD1耐藥譜最廣，對(duì)7種藥物耐藥，其次分別為JX2（6種）、FD3（5種）、JX1（3種）、JX3（3種）、FD2（3種）、XP2（2種）、XP3（2種）、XP1（1種）。同時(shí)，不同區(qū)域分離菌株的藥敏特性也存在差異，蕉城區(qū)的3株菌株均對(duì)氯霉素、呋喃唑酮、呋喃妥因、新生霉素、萬古霉素、氧氟沙星、諾氟沙星和恩諾沙星高度敏感，對(duì)新霉素、四環(huán)素耐藥；福鼎市的3株菌株均對(duì)呋喃唑酮、呋喃妥因、萬古霉素、氧氟沙星、諾氟沙星和恩諾沙星高度敏感，對(duì)青霉素耐藥；霞浦縣的3株菌株除對(duì)新霉素、慶大霉素藥敏特性存在差異，對(duì)青霉素耐藥外，對(duì)其余15種藥物均高度敏感。對(duì)比耐藥情況可知，9株副溶血弧菌對(duì)青霉素耐藥率最高（88.9%），其次分別為新霉素（77.8%）、四環(huán)素（55.6%），9株副溶血弧菌均對(duì)呋喃唑酮、呋喃妥因、萬古霉素、氧氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星等6種抗生素高度敏感。

3 討論與分析

3.1 副溶血弧菌對(duì)寧德市水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的影響

本研究中，寧德市7家南美白對(duì)蝦海水養(yǎng)殖場(chǎng)均有檢出副溶血弧菌，雖然在采樣期間上述養(yǎng)殖場(chǎng)未發(fā)生相關(guān)病害，但若不及時(shí)采取預(yù)防措施，隨著養(yǎng)殖殘餌、糞便及其他有機(jī)物在池底沉積和有害細(xì)菌大量繁殖，最終可能會(huì)引起水質(zhì)惡化，導(dǎo)致養(yǎng)殖病害的發(fā)生。此外，副溶血弧菌也會(huì)對(duì)其他養(yǎng)殖品種帶來不利影響，以寧德市大黃魚養(yǎng)殖為例，副溶血弧菌是造成養(yǎng)殖大黃魚爛身、斷尾、腹水等一系列弧菌病的主要因子[11-13]。如果南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖過程中亂用、濫用抗生素，則容易導(dǎo)致病原菌耐藥性增加，伴隨著養(yǎng)殖過程水體交換，相鄰養(yǎng)殖區(qū)域的大黃魚必然受到影響。因此，養(yǎng)殖過程必須提倡精準(zhǔn)用藥，對(duì)病害的防治也不能局限在單一養(yǎng)殖品種，要謹(jǐn)防多重耐藥問題，加強(qiáng)致病菌耐藥性和耐藥基因監(jiān)測(cè)。

3.2 不同地區(qū)南美白對(duì)蝦副溶血弧菌耐藥性對(duì)比

當(dāng)前，國(guó)內(nèi)關(guān)于南美白對(duì)蝦副溶血弧菌藥敏特性的研究并不鮮見，其中廣西南美白對(duì)蝦源副溶血弧菌對(duì)磺胺二甲嘧（97.00%）、青霉素G（89.55%）、氨芐青霉素（79.11%）的耐藥率較高[14]；上海南美白對(duì)蝦源副溶血弧菌對(duì)青霉素G（95.24%）、磺胺甲噁唑（71.43%）、氨芐西林（61.91%）的耐藥率較高[15]；山東南美白對(duì)蝦源副溶血弧菌對(duì)慶大霉素（98%）、硫酸新霉素（90%）、氨芐西林（86%）耐藥率較高[16]。對(duì)比可知，各地南美白對(duì)蝦源副溶血弧菌抗生素耐藥性均存在差異。本研究中，蕉城區(qū)、福鼎市和霞浦縣南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)分離出的副溶血弧菌對(duì)青霉素（88.9%）、新霉素（77.8%）和四環(huán)素（55.6%）耐藥性較高，耐藥性結(jié)果與廣西、上海、山東等地的研究結(jié)果相近，均對(duì)青霉素和新霉素耐藥?？紤]到產(chǎn)生耐藥性的原因復(fù)雜多樣，可能受副溶血弧菌基因序列、人為用藥習(xí)慣不同等影響，但具體如何影響仍需進(jìn)一步研究。

3.3 寧德市南美白對(duì)蝦健康養(yǎng)殖建議

本研究中，寧德地區(qū)9株副溶血弧菌均對(duì)呋喃唑酮、呋喃妥因、萬古霉素、氧氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星等6種抗生素高度敏感。根據(jù)《獸藥管理?xiàng)l例》《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙2022年1、2號(hào)》等有關(guān)規(guī)定，呋喃唑酮、呋喃妥因、萬古霉素為禁用藥，氧氟沙星、諾氟沙星為停用藥，恩諾沙星為限用藥，結(jié)合水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中不得使用禁、停用藥，因此，在實(shí)際養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中若發(fā)生相關(guān)病害可嘗試使用恩諾沙星進(jìn)行預(yù)防治療，但要嚴(yán)格遵守休藥期制度。

結(jié)合筆者走訪寧德市南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)相關(guān)情況，發(fā)現(xiàn)大部分養(yǎng)殖戶管理房中存放的投入品種類較多，主要為各種微生態(tài)制劑，養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)較少發(fā)現(xiàn)抗生素。當(dāng)前國(guó)內(nèi)許多專家學(xué)者認(rèn)為應(yīng)對(duì)南美白對(duì)蝦病害應(yīng)堅(jiān)持“預(yù)防為主，綜合防治”原則，通過提高養(yǎng)殖管理水平，注意養(yǎng)殖過程水質(zhì)調(diào)控和投餌管理，營(yíng)造良好的養(yǎng)殖環(huán)境[4，17]，降低養(yǎng)殖病害發(fā)生率。因此，在養(yǎng)殖過程添加適當(dāng)微生態(tài)制劑也可以起到改善養(yǎng)殖環(huán)境、抑制病原微生物、提高機(jī)體免疫力等作用[18]。

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