摘" 要： 肌細(xì)胞（又名肌纖維）是組成骨骼肌的基本單位，約占畜禽機(jī)體的50%左右，與畜禽產(chǎn)肉性能、骨骼保護(hù)密切相關(guān)，對(duì)調(diào)節(jié)畜禽機(jī)體代謝和內(nèi)分泌有重要作用，同時(shí)也為畜禽的運(yùn)動(dòng)提供了動(dòng)力。骨骼肌是一種較為復(fù)雜的組織，而組成這些組織的基本單位是肌細(xì)胞，骨骼肌在發(fā)育時(shí)期需要多種類(lèi)型的單核和多核細(xì)胞相互作用，這是形成優(yōu)質(zhì)肉類(lèi)的關(guān)鍵。近些年，隨著科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，對(duì)鑒定骨骼肌發(fā)育相關(guān)細(xì)胞有了更多且全面的技術(shù)，而單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在其中運(yùn)用的最為廣泛，它的運(yùn)用對(duì)組成骨骼肌的細(xì)胞類(lèi)型和相關(guān)細(xì)胞發(fā)育異質(zhì)性的研究提供了技術(shù)支持，對(duì)肉品質(zhì)的研究有重大意義。本文綜述了通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察、分子標(biāo)記物、免疫組織化學(xué)、免疫熒光、原位雜交、單細(xì)胞測(cè)序的方法鑒定與骨骼肌發(fā)育過(guò)程相關(guān)的細(xì)胞，歸納與骨骼肌發(fā)育相關(guān)細(xì)胞的標(biāo)記基因，為了解骨骼肌的結(jié)構(gòu)和功能，為探索骨骼肌發(fā)育機(jī)制提供參考，為肉品質(zhì)的研究提供理論基礎(chǔ)，也在不同品種的個(gè)體選育中具有重要意義和實(shí)踐價(jià)值。

關(guān)鍵詞： 骨骼??；骨骼肌發(fā)育；細(xì)胞鑒定

中圖分類(lèi)號(hào)： S852.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）12-5325-15

doi： 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.12.001

收稿日期：2024-05-08

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021YFD1200901）；國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)項(xiàng)目（32060742）；北方農(nóng)牧業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心項(xiàng)目（BFGJ2022002）；內(nèi)蒙古自治區(qū)科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2020ZD0004）；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校青年科技英才支持項(xiàng)目（NJYT23012）；中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展資金（2022ZY0185）；內(nèi)蒙古自治區(qū)直屬高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目科研創(chuàng)新平臺(tái)能力建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)（BR221005）；內(nèi)蒙古自治區(qū)教育廳一流學(xué)科科研專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目（YLXKZX-NND-007）；內(nèi)蒙古自治區(qū)科技計(jì)劃（2023KYPT0021）；新疆動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題資助課題（2023SWS004）

作者簡(jiǎn)介：吳丹妮（2000-），女，內(nèi)蒙古巴彥淖爾人，碩士，主要從事動(dòng)物遺傳育種研究，E-mail： 2604879241@qq.com

*通信作者：劉志紅，主要從事羊功能基因組與育種研究，E-mail： Liuzh7799@163.com

Research Progress on Cell Types and Identification Methods Related to Muscle Fiber Development in Livestock and Poultry

WU" Danni1， XIE" Yuchun5， QIN" Qing1， ZHANG" Chongyan1， XU" Xiaolong1， ZHAO" Dan1， LAN" Mingxi1， YANG" Ji4， XU" Songsong4， LIU" Zhihong1，2，3*

（1.Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot 010018，" China;

2.Key Laboratory of Mutton Sheep amp; Goat Genetics and Breeding of Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Hohhot 010018，" China;

3.Inner Mongolia Key Laboratory of Sheep amp; Goat Genetics Breeding and Reproduction， Hohhot 010018，" China;

4.China Agricultural University， Beijing 100193，" China;

5.Hebei Normal University of Science amp; Technology， Qinhuangdao 066004，" China）

Abstract：" Muscle cells （also known as muscle fibers） are the basic unit of skeletal muscle， accounting for about 50% of the body of livestock and poultry， and are closely related to meat production performance and bone protection of livestock and poultry. They play an important role in regulating the metabolism and endocrine of livestock and poultry， and also provide power for the movement of livestock and poultry. Skeletal muscle is a relatively complex tissue， and the basic unit of these tissues are muscle cells. Skeletal muscle requires a variety of types of mononuclear and multinucleated cells to interact during development， which is the key to the formation of high-quality meat. In recent years， with the rapid development of science and technology， there are more and more comprehensive techniques for identifying skeletal muscle development-related cells， and single cell sequencing technology is most widely used. Its application provides technical support for the study of cell types and related cell development heterogeneity of skeletal muscle， and is of great significance for the study of meat quality. This paper reviews the identification of cells related to skeletal muscle development by cell morphology observation， molecular markers， immunohistochemistry， immunofluorescence， in situ hybridization， and single cell sequencing， and summarizes the marker genes of cells related to skeletal muscle development， in order to understand the structure and function of skeletal muscle. It provides a reference for exploring the mechanism of skeletal muscle development， provides a theoretical basis for the study of meat quality， and also has important significance and practical value in individual breeding of different varieties.

Key words： skeletal muscle; skeletal muscle development; cell identification

*Corresponding author： LIU Zhihong，E-mail：Liuzh7799@163.com

隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展和生活水平的不斷提高，人們對(duì)食品的健康需求也在逐步提升，對(duì)肉類(lèi)的要求不再僅僅關(guān)注數(shù)量，而更加注重質(zhì)量。因此，培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的肉類(lèi)新品種，已成為目前肉類(lèi)生產(chǎn)中的一個(gè)重要話(huà)題。對(duì)不同畜禽肉品質(zhì)的研究也越來(lái)越廣泛和普遍。然而影響肉類(lèi)品質(zhì)的因素有很多，其中，肌纖維的組織結(jié)構(gòu)特征不僅是影響肉品質(zhì)的重要因素，也是評(píng)價(jià)肉品質(zhì)的重要指標(biāo)［1］。

近些年，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在肌纖維發(fā)育研究中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）是基于不同發(fā)育階段的單細(xì)胞水平上對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析的一種技術(shù)。該技術(shù)評(píng)估了不同的細(xì)胞類(lèi)型和不同分化軌跡上所對(duì)應(yīng)細(xì)胞的狀態(tài)［2］。Xu等［3］使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)3個(gè)品種豬的骨骼肌細(xì)胞群進(jìn)行分析，鑒定出9種細(xì)胞類(lèi)型，有三個(gè)肌原細(xì)胞系，包括衛(wèi)星細(xì)胞、成肌細(xì)胞和肌細(xì)胞，纖維成脂祖細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、髓系細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，揭示了細(xì)胞異質(zhì)性，深入了解骨骼肌纖維細(xì)胞進(jìn)化趨勢(shì)，為提升肉類(lèi)品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。本文綜述了通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察、分子標(biāo)記物、免疫組織化學(xué)、免疫熒光、原位雜交、單細(xì)胞測(cè)序的方法鑒定與骨骼肌發(fā)育過(guò)程相關(guān)的細(xì)胞，對(duì)不同畜禽骨骼肌發(fā)育時(shí)間節(jié)點(diǎn)進(jìn)行總結(jié)，并歸納與骨骼肌發(fā)育相關(guān)細(xì)胞的標(biāo)記基因，為了解骨骼肌的結(jié)構(gòu)和功能，探索不同畜禽骨骼肌發(fā)育機(jī)制提供參考，為肉品質(zhì)的研究提供理論基礎(chǔ)，也在不同品種個(gè)體選育中具有重要意義和實(shí)踐價(jià)值。

1" 骨骼肌纖維概述

1.1" 骨骼肌纖維發(fā)育階段

從細(xì)胞結(jié)構(gòu)上，骨骼肌發(fā)育過(guò)程可分為兩個(gè)不同的階段，首先是在早期的胚胎時(shí)期，骨骼肌細(xì)胞數(shù)量的增加，其次是在生長(zhǎng)的后期，主要是肌纖維的肥大發(fā)育和肌纖維類(lèi)型的轉(zhuǎn)化［4-5］，從而促進(jìn)肌肉發(fā)育進(jìn)入細(xì)胞增生期，以絨山羊?yàn)槔鐖D1所示。其中的一些蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子作為調(diào)節(jié)因子，在胚胎骨骼肌的發(fā)育過(guò)程和肌肉分化中發(fā)揮重要作用。

從細(xì)胞組成上，骨骼肌是由中胚層間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)育而來(lái)，直到形成最成熟的肌肉組織，該過(guò)程是極為復(fù)雜的，此發(fā)育大致可分4個(gè)階段［6-7］：第一階段是中胚層間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）發(fā)生終末分化（terminal differentiation）而形成體節(jié)，體節(jié)成對(duì)排列在胚胎神經(jīng)管的兩側(cè)［8］，體節(jié)可分化為軟骨細(xì)胞、成血管細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及成肌細(xì)胞，成肌細(xì)胞是骨骼肌的前體細(xì)胞，單核成肌細(xì)胞（myoblast）的形成；第二階段是單核成肌細(xì)胞又發(fā)生融合，形成肌管（myotube），肌管是含有肌原纖維的長(zhǎng)圓柱狀的多核細(xì)胞［9］ ；第三階段是肌管進(jìn)一步分化而形成肌纖維［10］；最后一個(gè)階段為肌纖維繼續(xù)生長(zhǎng)直到最終發(fā)育為成熟的肌肉組織［11-12］，如圖2所示。

1.2" 不同物種骨骼肌發(fā)育階段

有研究表明，在不同畜禽中骨骼肌發(fā)育過(guò)程基本相似，不同的是，在發(fā)育階段的時(shí)間上，不同物種之間具有一定的特異性。雞在出生后第7胚齡肌纖維主要由慢肌纖維構(gòu)成，到第14胚齡左右快肌纖維開(kāi)始作為主導(dǎo)類(lèi)型，隨著胚齡的增加，發(fā)現(xiàn)其肌內(nèi)纖維直徑和橫截面積逐漸變大但纖維密度越來(lái)越小，且腿肌比胸肌發(fā)育更迅速［13］。還有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中可以被分成兩個(gè)階段：在10.5～12.5 d是初級(jí)期或早期胚胎期，第14.5～17.5 d是次級(jí)期或胎兒后期［14］。牛到180 d時(shí)，肌原細(xì)胞在第2代時(shí)分化結(jié)束，纖維總數(shù)定型。李雪嬌等［15］對(duì)德美羊和中美羊兩個(gè)品種的胎兒期骨骼肌發(fā)育進(jìn)行對(duì)比，確定105d是綿羊肌纖維從數(shù)量增多到增粗轉(zhuǎn)變的一個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。有文獻(xiàn)指出在綿羊、牛和人40%的妊娠期中檢測(cè)到了三代肌原細(xì)胞。所以從中可以推測(cè)出山羊出現(xiàn)三代肌原纖維的時(shí)期可能在57～64 d之間。豬的初級(jí)纖維形成發(fā)生在妊娠第35～55天，由前體成肌細(xì)胞向肌管整合完成：從55～90 d初級(jí)纖維周?chē)拇紊w維開(kāi)始增殖［16］。豬的三級(jí)肌纖維通常是在產(chǎn)后早期發(fā)育而成，其直徑往往小于初級(jí)和次級(jí)肌纖維。在末代肌纖維形成過(guò)程中，肌纖維總數(shù)基本沒(méi)有改變［17］。但動(dòng)物妊娠期無(wú)法準(zhǔn)確劃分骨骼肌發(fā)育階段，無(wú)法反映不同物種之間的差異［18］。如圖3所示繪制了不同物種肌原細(xì)胞發(fā)育時(shí)間線(xiàn)。

1.3" 組成肌纖維的類(lèi)型及轉(zhuǎn)化

肉品質(zhì)與肌纖維類(lèi)型密切相關(guān)，肌纖維類(lèi)型的組成是調(diào)控肉品質(zhì)的關(guān)鍵。畜禽隨著生長(zhǎng)發(fā)育階段的不同，肌纖維也會(huì)隨著年齡的增加逐漸成熟，體積增大，類(lèi)型也會(huì)隨之發(fā)生轉(zhuǎn)化，用以滿(mǎn)足機(jī)體的運(yùn)動(dòng)、代謝等生命活動(dòng)［19］。根據(jù)肌纖維收縮類(lèi)型分為慢收縮Ⅰ型（慢肌）和快收縮Ⅱ型（快?。?，慢肌多為紅肌纖維組成，又名氧化型肌纖維：而快肌多為白肌纖維組成，又名酵解型肌纖維［20］。在慢肌和快肌的基礎(chǔ)上，按MYHC亞型被分為I、IIa、IIx、IIb四類(lèi)，I（慢速氧化型）型即為慢肌，Ⅱ型為快肌，Ⅱ型又可分為IIa型（快速氧化糖酵解型）、IIb型（快速糖酵解）和IIx型（快速糖酵解）。IIx作為中間型，其功能及代謝能力介于IIa和IIb之間，收縮速率從大到小依次為IIb、IIx、IIa、I［21］。

已有研究表明［22］，I型纖維比IIb型纖維直徑細(xì)、剪切力小，說(shuō)明I型纖維具有良好的嫩度特性。同時(shí)I型纖維比Ⅱ型纖維含有更多脂質(zhì)和磷脂，肉質(zhì)風(fēng)味好。研究發(fā)現(xiàn)在不同肌肉群中具有不同比例的纖維類(lèi)型。楊玉瑩等［23］通過(guò)對(duì)不同部位牦牛肌纖維特性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)背最長(zhǎng)肌和半膜?、蛐图±w維比例較高，腰大肌I型肌纖維的比例較高。肌纖維類(lèi)型也隨畜禽不同發(fā)育階段有不同的組成。在出生時(shí)，肌肉主要由氧化型肌纖維組成；出生后生長(zhǎng)階段，氧化型肌纖維的比例減少同時(shí)酵解型肌纖維的比例增加［24］并遵循ⅠⅡaⅡxⅡb的變化規(guī)律［25］。同樣通過(guò)對(duì)蒙古馬胎兒期與成年期骨骼肌肌纖維類(lèi)型進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，胎兒期Ⅱ型肌纖維占比相較成年時(shí)期更大，并且發(fā)育到成年時(shí)期時(shí)，肌纖維由Ⅱ型（快型）纖維向Ⅰ型（慢型）纖維轉(zhuǎn)化［26］。周力等［27］對(duì)出生和12月黑藏羊背最長(zhǎng)肌肌纖維進(jìn)行分析得到，隨著發(fā)育時(shí)間的推移，其肌纖維類(lèi)型由氧化型開(kāi)始向酵解型轉(zhuǎn)化，這同時(shí)也在一定程度上影響著機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育。

2" 主要肌纖維細(xì)胞Marker基因的概述

組成骨骼肌的細(xì)胞有肌細(xì)胞（myocyte）、內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cell）、成纖維細(xì)胞（fibroblasts）、間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell）、免疫細(xì)胞［B細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞（macrophages）］、中性粒細(xì)胞（neutrophils）、衛(wèi)星細(xì)胞（satellite cell）、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（glial cell）、纖維/成脂祖細(xì)胞（fibro-adipogenic progenitors， FAPs）、平滑肌細(xì)胞（smooth muscle cell）等［28-29］。根據(jù)前人的大量研究可以將骨骼肌發(fā)育的主要細(xì)胞類(lèi)群歸納為內(nèi)皮細(xì)胞、骨骼肌肌源性亞群（成肌細(xì)胞、肌細(xì)胞、肌源性祖細(xì)胞等）、免疫細(xì)胞、纖維/成脂祖細(xì)胞等。

2.1" 內(nèi)皮細(xì)胞

內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，ECs）遍布血管中，它是氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)輸送、免疫細(xì)胞運(yùn)輸以及清除遠(yuǎn)組織廢物的重要管道［30］。ECs可以調(diào)節(jié)血流、血漿中大分子的傳遞和血管舒縮，防止血細(xì)胞的黏附和血栓形成，來(lái)維持血管屏障功能［31］。有研究表明，在胚胎細(xì)胞群中只有一小部分包括內(nèi)皮細(xì)胞和心肌中少于50%的心肌細(xì)胞群（包含肌細(xì)胞）［32］。血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1（PECAM1），也稱(chēng)為CD31，是一種參與淋巴細(xì)胞活化和跨內(nèi)皮遷移的細(xì)胞黏附分子，負(fù)責(zé)血管內(nèi)皮細(xì)胞單層的形成，PECAM1（CD31）是內(nèi)皮細(xì)胞的marker基因［33］。CD34也是標(biāo)記內(nèi)皮和血管周?chē)?xì)胞的特異性基因［34］，是用于識(shí)別各種組織中的血管祖細(xì)胞的基因，在維持組織穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用。

2.2" 免疫細(xì)胞

免疫細(xì)胞是指參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞。包括淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等。研究表明，在肌肉損傷后，免疫細(xì)胞的比例會(huì)增加，幫助清除壞死細(xì)胞并促進(jìn)再生。而在免疫細(xì)胞中，巨噬細(xì)胞扮演著中心角色，它們通過(guò)調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的組織恢復(fù)和重構(gòu)，有助于維持組織的穩(wěn)定性［35］。B細(xì)胞包括骨髓中的祖細(xì)胞，淋巴組織中處于發(fā)育狀態(tài)的B細(xì)胞以及淋巴和非淋巴組織中終末分化的記憶B細(xì)胞和漿細(xì)胞。它們通過(guò)產(chǎn)生針對(duì)特定身體部位的抗體，在體液免疫中發(fā)揮著核心作用，從而參與機(jī)體的免疫系統(tǒng)［36］。Xu等［37］使用scRNA-seq對(duì)新生仔豬骨骼肌細(xì)胞群進(jìn)行分析，一共定位到9個(gè)細(xì)胞群，其中用基因PTPRC和CD3G對(duì)淋巴細(xì)胞進(jìn)行了定位，揭示了細(xì)胞異質(zhì)性、新的細(xì)胞亞群及其相互作用的變化。Zhao等［38］通過(guò)利用癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)挖掘了9個(gè)B細(xì)胞標(biāo)記基因ZBP1、SEL1L3、CCND2、TNFRSF13C、HSPA6、PLPP5、CXCR4、GZMB和CCDC50。Coulis等［39］得到巨噬細(xì)胞的標(biāo)記基因有Folr2、Mt2、Lyvel和Gas6等。

2.3" 成纖維細(xì)胞

結(jié)締組織的主要細(xì)胞類(lèi)型是成纖維細(xì)胞，它在組織發(fā)育、穩(wěn)態(tài)、修復(fù)和疾病過(guò)程中分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分［40］。在正常情況下它們不表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle-actin，α-SMA）。成纖維細(xì)胞在皮膚真皮層中最為豐富，除此之外，還在腸、肺、心臟和肌肉等組織中存在。研究者們?yōu)閰^(qū)分不同的組織來(lái)源，一般把來(lái)自不同組織器官的成纖維細(xì)胞分別命名為 “組織名稱(chēng)+成纖維細(xì)胞”，例如皮膚成纖維細(xì)胞、結(jié)腸成纖維細(xì)胞、滑膜成纖維細(xì)胞、肺成纖維細(xì)胞、肌肉成纖維細(xì)胞等［41］。Fan等［42］對(duì)人的臍帶和包皮間充質(zhì)干細(xì)進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析了所有細(xì)胞亞群中常見(jiàn)成纖維細(xì)胞的標(biāo)記基因有ACTA2、FAP、PDGFRA、PDGFRB、COL1A1、POSTN、DCN、COL1A2、CDH11等。成纖維細(xì)胞的占比在不同種類(lèi)肌肉和不同發(fā)育階段有明顯差異，如表1所示。

2.4" 纖維/成脂祖細(xì)胞

纖維/成脂祖細(xì)胞（FAPs），也被稱(chēng)為肌肉常駐間充質(zhì)祖細(xì)胞，具有多種分化潛力，可用于脂肪形成、纖維化、成骨和軟骨形成。是肌肉內(nèi)穩(wěn)態(tài)和保持細(xì)胞完整性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器。纖維/成脂祖細(xì)胞通過(guò)協(xié)調(diào)肌肉干細(xì)胞（muscle stem cell，MuSCs）和免疫細(xì)胞之間的相互作用，在肌肉發(fā)育和修復(fù)中發(fā)揮重要作用。研究表明 ，F(xiàn)AP不僅在再生過(guò)程中促進(jìn)短暫的肌肉纖維化和脂肪形成，而且還調(diào)節(jié)衛(wèi)星細(xì)胞［43］。Wosczyna等［44］在小鼠上證明，體內(nèi)fap可防止衛(wèi)星細(xì)胞過(guò)早分化，從而促進(jìn)再生早期階段衛(wèi)星細(xì)胞的增殖。Chen等［45］研究表明，F(xiàn)APs已被認(rèn)為是維持肌肉內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子。FAPs有時(shí)也被稱(chēng)為成纖維細(xì)胞，“成纖維細(xì)胞”作為一個(gè)總括術(shù)語(yǔ)，用來(lái)描述包括分化細(xì)胞和成體祖細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)胞類(lèi)型的異質(zhì)群體。為了避免語(yǔ)義混淆，使用術(shù)語(yǔ)“肌成纖維細(xì)胞”來(lái)表示由成年祖細(xì)胞（如FAPs）產(chǎn)生的不同分化的細(xì)胞，該祖細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)［46］。有研究表明，PDGFRAα是纖維/成脂祖細(xì)胞的標(biāo)志物，PDGFRα＋細(xì)胞能夠有效的分化成脂肪細(xì)胞［47-48］。

2.5" 骨骼肌肌源性亞群

已有研究發(fā)現(xiàn)在牛胚胎期時(shí)，發(fā)育的骨骼肌肌源性亞群以MYF5+成肌細(xì)胞、MYOG+肌細(xì)胞為主，也觀(guān)察到少量表達(dá)PAX7的肌源性祖細(xì)胞亞群。在出生后階段，幾種類(lèi)型的肌纖維構(gòu)成了肌源性群體的大部分，沒(méi)有檢測(cè)到分化的肌源性細(xì)胞。在成年期，骨骼肌主要是由慢速肌纖維和快速肌纖維構(gòu)成的，這些纖維可以進(jìn)一步細(xì)分為I型纖維、IIA型纖維以及IIX型纖維［49］。肌肉衛(wèi)星細(xì)胞（satellite cells，SCs）又名成體干細(xì)胞，位于肌纖維基底板和肌膜之間，通常保持靜止?fàn)顟B(tài)，是維持骨骼肌穩(wěn)態(tài)的核心細(xì)胞。骨骼肌的再生和修復(fù)能力依賴(lài)于衛(wèi)星細(xì)胞和其他細(xì)胞如免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）、成纖維細(xì)胞等細(xì)胞之間的相互作用［50］。在穩(wěn)定的肌肉結(jié)構(gòu)中，靜止衛(wèi)星細(xì)胞的占比不足10%，并且在不同的肌肉組織中，靜止衛(wèi)星細(xì)胞的數(shù)Cattle背最長(zhǎng)肌胚胎期（懷孕后60 d）、哺乳期（出生后4月齡）和成年期（出生后24月齡）胚胎期成纖維細(xì)胞占比最多；哺乳期內(nèi)皮細(xì)胞占比最多，其次是IIX型肌纖維；成年期IIX型肌纖維占比最多10×Genomics單細(xì)胞RNA測(cè)序18個(gè)主要細(xì)胞類(lèi)型：脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、紅系細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、成肌細(xì)胞、肌細(xì)胞、肌源性祖細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、周細(xì)胞、雪旺氏細(xì)胞、腱細(xì)胞、I型纖維1、I型纖維2、IIA型纖維1、IA型纖維2和IIX 型纖維［102］

豬

Pig背最長(zhǎng)肌1日齡新生豬/10×Genomics單細(xì)胞RNA測(cè)序11種不同的細(xì)胞類(lèi)群，包括內(nèi)皮細(xì)胞（24.39%）、肌管（18.82%）、纖維成脂祖細(xì)胞（18.11%）、衛(wèi)星細(xì)胞（16.74%）、成肌細(xì)胞（3.99%）、肌細(xì)胞（5.74%）、雪旺細(xì)胞（3.81%）、平滑肌細(xì)胞（3.22%）、樹(shù)突狀細(xì)胞（2.99%）、周細(xì)胞（1.86%）和中性粒細(xì)胞（0.33%）［66］

雞

Chicken胸肌生長(zhǎng)早期（孵化后第5天）和快速生長(zhǎng)期（第100天）在生長(zhǎng)早期鑒定到了5個(gè)成肌細(xì)胞群和2個(gè)脂肪細(xì)胞群，在快速生長(zhǎng)期鑒定到了1個(gè)成肌細(xì)胞群和脂肪細(xì)胞群10×Genomics單細(xì)胞RNA測(cè)序生長(zhǎng)早期（孵化后第5天）鑒定出4種細(xì)胞類(lèi)型：成肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、紅細(xì)胞和其他細(xì)胞。快速生長(zhǎng)期（第100天）鑒定出6種細(xì)胞類(lèi)型：成肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、干細(xì)胞、紅細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和其他細(xì)胞［103］

量表現(xiàn)出明顯的差異性，在與慢肌纖維有關(guān)的衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量多，而與快肌纖維有關(guān)的衛(wèi)星細(xì)胞則相對(duì)較少［51］。但在損傷和再生過(guò)程中會(huì)增多。PAX7是衛(wèi)星細(xì)胞的特異性表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子，有研究表明，PAX7的產(chǎn)生使成人的衛(wèi)星細(xì)胞能夠進(jìn)行誘導(dǎo)性基因標(biāo)記和消融，并證明衛(wèi)星細(xì)胞對(duì)肌肉再生既是必要的，也是充分的［52］。

靜止的衛(wèi)星細(xì)胞通常表達(dá)諸如基因Pax7和Myf5等標(biāo)記物。肌肉損傷之后，衛(wèi)星細(xì)胞會(huì)被損傷環(huán)境所發(fā)出的多種信號(hào)所激發(fā)。然后，衛(wèi)星細(xì)胞向損傷部位遷移，并重新進(jìn)入細(xì)胞周期進(jìn)行增殖。在這個(gè)發(fā)展階段，共同生成的衛(wèi)星細(xì)胞被命名為成肌細(xì)胞，并且它們表達(dá)了肌原性標(biāo)記物Pax7和/或Myf5和/或MyoD。增殖期過(guò)后，成肌細(xì)胞從細(xì)胞周期中撤出并向成熟肌細(xì)胞分化。在這個(gè)分化過(guò)程中，基因Pax7和Myf5的表達(dá)水平下降，同時(shí)基因MyoG和Mrf4的水平也有所上升。如圖4所示。

骨骼肌纖維的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)而形成肌肉的過(guò)程需要成肌細(xì)胞的增殖和分化，而骨骼肌纖維的形成受肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化增殖等復(fù)雜過(guò)程調(diào)控，其中生肌調(diào)節(jié)因子（myogenic regulatory factors，MRFs）家族被認(rèn)為是啟動(dòng)和促進(jìn)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化增殖的關(guān)鍵調(diào)控因子，在骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。MRFs是由四種肌肉特異性蛋白組成的，包括MyoD、Myf5、MyoG、Mrf4［53］。

肌細(xì)胞生成素（MyoG）屬于生肌調(diào)節(jié)因子家族（MRFs）的一員，它是決定肌細(xì)胞終末端分化的核心因子，并在調(diào)節(jié)肌細(xì)胞生成過(guò)程中發(fā)揮中心角色，它的表達(dá)還能終止成肌細(xì)胞增殖并調(diào)控單核成肌細(xì)胞向多核肌細(xì)胞整合的進(jìn)程。MyoG作為生肌調(diào)節(jié)因子家族的主要成員之一，調(diào)節(jié)中胚層向肌纖維的分化過(guò)程，進(jìn)而通過(guò)成肌細(xì)胞向肌纖維的整合過(guò)程。MyoG基因是MRFs基因家族中唯一在所有骨骼肌肌細(xì)胞系中均可表達(dá)基因［54］。

2.6" SCX＋細(xì)胞

SCX＋的表達(dá)標(biāo)記了一個(gè)干細(xì)胞/祖細(xì)胞群體，產(chǎn)生軟肌骨骼細(xì)胞（肌細(xì)胞、半月板細(xì)胞、腱細(xì)胞）和硬肌骨骼細(xì)胞（軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞），對(duì)肌腱和韌帶的正常發(fā)育和成熟至關(guān)重要同時(shí)可能參與后肢骨骼肌發(fā)育［55］。SCX＋高表達(dá)肌腱細(xì)胞標(biāo)記物，通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)確定了兩個(gè)肌肉常駐細(xì)胞群，基因TNMD、THBS4和EGR1定位了間質(zhì)肌腱細(xì)胞［56］。成熟的肌腱由大量的胞外基質(zhì)組成， 胞外基質(zhì)由膠原纖維和蛋白聚糖構(gòu)成［57］。有研究發(fā)現(xiàn)，TNMD也名腱調(diào)蛋白，是一種II型跨膜糖蛋白，分布在肌腱、韌帶及骨骼肌的肌外膜中，是肌腱分化的特異性標(biāo)志。而肌腱標(biāo)記基因SCX能夠正向調(diào)控TNMD的表達(dá)。在雞骨骼肌發(fā)育的早期階段，基因SCX的表達(dá)早于TNMD，并且SCX的存在促進(jìn)了TNMD的表達(dá)［58］。這表明，SCX對(duì)多個(gè)胞外基質(zhì)成分具有調(diào)控作用。

3" 骨骼肌中不同類(lèi)型細(xì)胞相互作用

骨骼肌中不同細(xì)胞的相互作用是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過(guò)程。各類(lèi)細(xì)胞通過(guò)分泌多種信號(hào)分子和細(xì)胞間直接接觸，共同維持肌肉的健康與功能。間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是一種多能性組織干細(xì)胞，可分化為多種中胚層組織類(lèi)型，包括成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞［59］。周細(xì)胞（pericyte，PC）長(zhǎng)期以來(lái)被視為血管的結(jié)構(gòu)性細(xì)胞。然而，隨著對(duì)它們與內(nèi)皮細(xì)胞緊密接觸的識(shí)別，以及通過(guò)旁分泌信號(hào)與周?chē)?xì)胞的相互作用，逐漸揭示出周細(xì)胞在維持血管周?chē)h(huán)境穩(wěn)態(tài)方面的其他重要功能［60］。有研究表明，纖維/成脂祖細(xì)胞（FAPs）不僅在再生過(guò)程中促進(jìn)短暫的肌肉纖維化和脂肪形成，而且還調(diào)節(jié)衛(wèi)星細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，并且是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分泌信號(hào)的重要來(lái)源［61-62］。還有研究發(fā)現(xiàn)，在肌肉損傷中，免疫細(xì)胞（尤其是巨噬細(xì)胞）會(huì)被招募到受損區(qū)域，促炎M1巨噬細(xì)胞和抗炎M2巨噬細(xì)胞對(duì)衛(wèi)星細(xì)胞分別進(jìn)行調(diào)控。這種相互作用對(duì)于有效修復(fù)肌肉至關(guān)重要［63］。Ahmad等［64］研究得到牛肌肉組織中含有成纖維細(xì)胞的條件培養(yǎng)基可以增加培養(yǎng)中的成肌細(xì)胞的增殖，說(shuō)明成纖維細(xì)胞不僅可以通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)的形成來(lái)調(diào)節(jié)衛(wèi)星細(xì)胞的激活，還可以作為生長(zhǎng)因子的旁分泌來(lái)源。不同細(xì)胞之間通過(guò)細(xì)胞因子、化學(xué)信號(hào)和直接接觸進(jìn)行相互調(diào)節(jié)。研究表明，IGF-1和FGF等生長(zhǎng)因子在衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化中起重要作用，同時(shí)也激活PI3K/Akt信號(hào)通路來(lái)調(diào)控成肌細(xì)胞的增殖分化［65］。對(duì)這些相互作用的深入研究不僅有助于理解肌肉生物學(xué)，也為治療肌肉相關(guān)疾病提供了潛在的新方向。

4" 不同畜禽骨骼肌細(xì)胞類(lèi)型組成

骨骼肌發(fā)育相關(guān)的細(xì)胞類(lèi)型與不同畜禽、不同發(fā)育階段以及不同組織部位等因素密切相關(guān)。如表1所示。根據(jù)前人的研究表明，在牛胚胎期，成纖維細(xì)胞占比最多，肌細(xì)胞次之；在哺乳期，內(nèi)皮細(xì)胞占比最多，其次是IIX型肌纖維、I型肌纖維和周細(xì)胞；在成年期，IIX型肌纖維占比最多，其次是肌腱細(xì)胞、IIA型肌纖維［102］。在1日齡新生豬背最長(zhǎng)肌中發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞占比最多，其次是肌管、纖維成脂祖細(xì)胞和衛(wèi)星細(xì)胞［66］。在生長(zhǎng)早期（孵化后第5天）和快速生長(zhǎng)期（第100天）雞的胸肌中得到占比最多的成肌細(xì)胞，其次是脂肪細(xì)胞［103］。通過(guò)對(duì)不同細(xì)胞類(lèi)型的研究可以更好地解析不同畜禽發(fā)育機(jī)制。

5" 細(xì)胞鑒定方法

骨骼肌的發(fā)育是一個(gè)動(dòng)態(tài)且復(fù)雜的過(guò)程，從胚胎期到胎兒期再到出生后期，需要多種細(xì)胞相互作用，相互配合，共同完成。即對(duì)不同發(fā)育階段肌肉組織的細(xì)胞鑒定是更好的理解肌肉發(fā)育、再生以及疾病等生物過(guò)程中的關(guān)鍵。根據(jù)不同的研究階段和目的，研究者們采用多種細(xì)胞鑒定方法聯(lián)合分析，下面通過(guò)概述多種鑒定方法在肌肉發(fā)育中的應(yīng)用，如細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察、免疫細(xì)胞化學(xué)染色和一些高通量測(cè)序技術(shù)等，進(jìn)一步全面理解肌肉發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞類(lèi)型及其遺傳機(jī)制。

5.1" 細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定

細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析是最直接的細(xì)胞鑒定方法之一。通過(guò)觀(guān)察細(xì)胞的形態(tài)、大小、顏色、核形態(tài)等特征，可以初步確定細(xì)胞的類(lèi)型。在細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析中，可以使用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡來(lái)觀(guān)察和記錄細(xì)胞的形態(tài)特征。

石蠟切片和HE染色，是組織學(xué)中最基本的技術(shù)之一，至今已經(jīng)使用了一百多年［67］。石蠟切片是常規(guī)切片技術(shù)中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)之一，其優(yōu)點(diǎn)是切片的厚度容易控制（最薄可達(dá)0.15μm），清晰度較好，在顯微鏡下可以觀(guān)察到組織形態(tài)，從而判斷其細(xì)胞類(lèi)型［68］。蘇木精-伊紅（HE）染色作為組織學(xué)常用的染色技術(shù)，能夠突出細(xì)胞和組織的精細(xì)結(jié)構(gòu)，從而對(duì)細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行觀(guān)察與分析［69］。

HE是最常見(jiàn)且簡(jiǎn)單的染色方法，是因?yàn)樗m合多種固定物，并顯示出細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和細(xì)胞外基質(zhì)的普遍特征。蘇木精有一種深藍(lán)紫色，通過(guò)一種復(fù)雜的反應(yīng)來(lái)染色核酸。伊紅是粉紅色的，可以非特異性地染色蛋白質(zhì)。在組織中，細(xì)胞核被染成藍(lán)色，而細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)有不同程度的粉紅色［70］。石蠟切片結(jié)合HE染色可以更好地觀(guān)察到不同發(fā)育時(shí)期不同組織或細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)?？梢宰鳛檠芯坎煌M織和細(xì)胞形態(tài)最有效的工具。有很多研究將HE染色和其他免疫細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)結(jié)合起來(lái)用來(lái)鑒定細(xì)胞類(lèi)型。Chen等［71］通過(guò)HE和免疫熒光染色，檢測(cè)到了來(lái)自于脂肪組織中的微小神經(jīng)纖維細(xì)胞和雪旺細(xì)胞。Hao等［72］通過(guò)使用HE染色法，觀(guān)察到CV8穴位的形態(tài)學(xué)特征，將HE染色和免疫組化染色相結(jié)合鑒定了CV8穴位的細(xì)胞類(lèi)型。

5.2" 分子標(biāo)記物鑒定

生肌調(diào)節(jié)因子（myogenic regulatory factor，MRF），又稱(chēng)為MyoD家族。MRF只在骨骼肌中表達(dá)［73］。它可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞、衛(wèi)星細(xì)胞分化為成肌細(xì)胞，參與調(diào)控肌肉生長(zhǎng)發(fā)育［74］。它由四個(gè)家族成員組成，分別是MyoD、myogenin、Myf5和MRF-4（Myf-6或herculin）。Myf5能促進(jìn)肌纖維形成［75］，是衛(wèi)星細(xì)胞的關(guān)鍵細(xì)胞標(biāo)志物之一，在肌肉損傷再生中起著重要作用［76］，MyoG和Mrf4參與肌管融合及肌細(xì)胞分化［77］。在胚胎發(fā)育過(guò)程中MRF家族具有特定的時(shí)空表達(dá)模式，myf-5、myogenin、MRF4和MyoD分別于胚胎形成第8、8.5、9、10.5天表達(dá)［78］。

5.3" 免疫細(xì)胞化學(xué)染色

免疫細(xì)胞化學(xué)染色是一種常用的細(xì)胞鑒定方法。通過(guò)使用特異性抗體標(biāo)記目標(biāo)蛋白質(zhì)，可以在細(xì)胞中檢測(cè)到特定的抗原表達(dá)。這種方法可以用于確定細(xì)胞的類(lèi)型和功能，以及檢測(cè)細(xì)胞中特定蛋白質(zhì)的表達(dá)量和定位。主要可以分為免疫熒光和免疫組化兩方面。

5.3.1" 免疫熒光

免疫熒光（IF）是一種重要的免疫化學(xué)技術(shù)，可以檢測(cè)和定位各種細(xì)胞制劑的不同類(lèi)型組織中的各種抗原，根據(jù)實(shí)驗(yàn)的范圍或使用的特異性抗體不同，有兩種方法可用：直接（初級(jí)）或間接（次級(jí)）［79］。很多研究者在研究細(xì)胞的時(shí)候都會(huì)將免疫熒光作為后期的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。Feng等［80］通過(guò)使用Pax7基因針對(duì)小鼠肌肉組織且在斑馬魚(yú)肌肉研究的基礎(chǔ)上優(yōu)化了免疫熒光染色方案，對(duì)衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行了標(biāo)記。Dumont和Rudnicki［81］用Pax7、MyoG基因?qū)π∈笸炔考∪膺M(jìn)行免疫熒光試驗(yàn)，用來(lái)驗(yàn)證骨骼肌再生肌原細(xì)胞。

5.3.2" 免疫組織化學(xué)

免疫組織化學(xué)（IHC）是應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)之一。該技術(shù)的原理是基于特異性抗體與組織中匹配的特異性抗原的結(jié)合，使用一系列檢測(cè)技術(shù)使結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物可視化。IHC使用多種不同的酶標(biāo)記物（例如過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶）來(lái)檢測(cè)感興趣的抗原［82］。有研究表明，在某些情況下，這些組織化學(xué)染色被證明在特定的細(xì)胞鑒定中具有關(guān)鍵價(jià)值［83］。Cefis等［84］通過(guò)使用免疫組化技術(shù)研究大鼠比目魚(yú)肌（soleus，SOL）和腓腸?。╣astrocnemius，GAS）中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）在細(xì)胞中的定位。Kalbe等［85］通過(guò)進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，確定肌肽相關(guān)蛋白的細(xì)胞定位，研究肌肽對(duì)從糖酵解肌纖維和氧化肌纖維中分離出的成肌細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)的影響。

5.4" 熒光原位雜交

熒光原位雜交（FISH）為研究不同生物背景下基因和細(xì)胞的空間定位和表達(dá)水平提供了寶貴的工具。熒光原位雜交（FISH）廣泛用于特定DNA片段（和RNA片段）的視覺(jué)定位，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞周期任何階段的染色體或細(xì)胞核［86］。使用單分子RNA原位雜交的方法可以更好地理解特定基因在亞細(xì)胞中的定位［87］。

RNA FISH是一種能夠檢測(cè)和可視化細(xì)胞內(nèi)特定RNA分子的技術(shù)。隨著技術(shù)的進(jìn)步，RNA FISH的靈敏度和特異性得到了提高，可以檢測(cè)單個(gè)mRNA分子。使用一組熒光標(biāo)記的探針檢測(cè)RNA，這些探針與感興趣的基因?qū)?yīng)的特定核苷酸序列互補(bǔ)。這些探針與目標(biāo)RNA分子雜交，能夠同時(shí)檢測(cè)同一細(xì)胞或組織內(nèi)的多個(gè)RNA，鑒定基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況［88］。Lawrence等［89］通過(guò)對(duì)體外分化的雞骨骼肌成肌細(xì)胞進(jìn)行原位雜交，直接在單個(gè)細(xì)胞內(nèi)分析肌肉特異性mRNA的表達(dá)，獲得了關(guān)于這些基因在單個(gè)細(xì)胞中表達(dá)的精確信息。DNA FISH是一種常用的分子技術(shù)，用于可視化DNA序列的位置［90］。DNA FISH的核心原理是熒光標(biāo)記的DNA探針（雙鏈或單鏈DNA片段）在細(xì)胞或組織中原位結(jié)合其互補(bǔ)序列的能力，以熒光顯微鏡可檢測(cè)的熒光信號(hào)的形式揭示其靶標(biāo)的位置［91］。

5.5" 流式細(xì)胞術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)是一種高通量的細(xì)胞分析方法。通過(guò)標(biāo)記細(xì)胞表面和內(nèi)部的特定標(biāo)記物，如抗體或熒光染料，可以在流式細(xì)胞儀中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行快速準(zhǔn)確的分析和鑒定。流式細(xì)胞術(shù)可以用于細(xì)胞的多參數(shù)分析，如細(xì)胞大小、形態(tài)、表面標(biāo)記物等，可以快速鑒定不同細(xì)胞類(lèi)型。通過(guò)單染流式細(xì)胞計(jì)量分析檢測(cè)包括肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白和α-肌動(dòng)蛋白在內(nèi)的蛋白質(zhì)。而肌纖維類(lèi)型可以通過(guò)骨骼肌肌動(dòng)蛋白和不同肌球蛋白的雙重標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)來(lái)確定。流式細(xì)胞術(shù)能夠用多種抗體同時(shí)標(biāo)記整個(gè)肌肉樣本，在某些應(yīng)用中比傳統(tǒng)方法更具有優(yōu)勢(shì)［92］。

Kosmac等［93］通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證得出可以明確識(shí)別出人類(lèi)骨骼肌的巨噬細(xì)胞群體。Gattazzo等［94］使用流式細(xì)胞術(shù)概述了肌原細(xì)胞從出生到成年的異質(zhì)性和動(dòng)態(tài)，更好地理解肌原細(xì)胞在分化過(guò)程中的進(jìn)展，并證明了這一過(guò)程具有復(fù)雜的肌原細(xì)胞狀態(tài)多樣性的特征。ACˇGamernik和Zupan［95］提出使用流式細(xì)胞術(shù)來(lái)準(zhǔn)確定量間充質(zhì)干細(xì)胞/基質(zhì)細(xì)胞（MSCs）表面抗原。Krasniewski等［96］通過(guò)流式細(xì)胞儀分析證實(shí)了骨骼肌（skeletal muscle，SKM）中4個(gè)巨噬細(xì)胞亞群的存在。Montarras等［97］通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)從成年骨骼肌中直接分離出表達(dá)（Pax3）的肌肉衛(wèi)星細(xì)胞。Luk等［98］使用基于圖像的流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞微量染料來(lái)監(jiān)測(cè)衛(wèi)星細(xì)胞的增殖，并識(shí)別衛(wèi)星細(xì)胞分化的不同階段。Percopo等［99］通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)挖掘出一種可以用來(lái)定量和檢測(cè)嗜酸性粒細(xì)胞，并從受過(guò)敏原感染的野生型和未受感染的小鼠的骨髓、脾和肺組織中分離出嗜酸性粒細(xì)胞的方法。從前人研究可以得到，使用流式細(xì)胞術(shù)可以很好的將目的細(xì)胞與其他細(xì)胞分離開(kāi)，并可以監(jiān)控細(xì)胞分化的情況。

5.6" 單細(xì)胞測(cè)序

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（scRNA-seq）技術(shù)在對(duì)生物機(jī)體發(fā)育的分子機(jī)制和細(xì)胞程序的研究中，逐步達(dá)到從單細(xì)胞水平研究生物發(fā)育的目的。

Coulis等［100］通過(guò)利用單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對(duì)骨骼肌纖維化巨噬細(xì)胞進(jìn)行的研究，發(fā)現(xiàn)了6個(gè)不同巨噬細(xì)胞簇，確定了一種與纖維化相關(guān)的營(yíng)養(yǎng)不良肌肉巨噬細(xì)胞的獨(dú)特轉(zhuǎn)錄譜。Giordani等［101］使用單細(xì)胞RNA測(cè)序和大量細(xì)胞術(shù)的結(jié)合方法，精確地繪制了成年小鼠肌肉中10種不同的單核細(xì)胞類(lèi)型。發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)之前未被充分研究的細(xì)胞群。其中一種在體外表達(dá)轉(zhuǎn)化因子并在體外產(chǎn)生肌腱細(xì)胞。第二種表達(dá)平滑肌和間充質(zhì)細(xì)胞（smooth mesenchymal，MSCs）的標(biāo)記物。Cai等［102］在牛骨骼肌中，通過(guò)scRNA-seq和scATAC-seq分析，在三個(gè)發(fā)育階段發(fā)現(xiàn)了不同類(lèi)型的細(xì)胞類(lèi)型，如脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、周細(xì)胞和8個(gè)骨骼肌生成亞群。并預(yù)測(cè)了與肌肉發(fā)育相關(guān)的特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。Li等［103］利用scRNA-seq在雞的胸肌中鑒定出10個(gè)孵化后第5天發(fā)育階段的細(xì)胞簇和7個(gè)發(fā)育后期第100天的細(xì)胞簇。在第5天發(fā)現(xiàn)了5個(gè)肌細(xì)胞相關(guān)簇和2個(gè)脂肪細(xì)胞簇，在第100天發(fā)現(xiàn)了1個(gè)肌細(xì)胞簇和1個(gè)脂肪細(xì)胞簇。De Micheli等［104］使用scRNA-seq技術(shù)，通過(guò)無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)，一共解析了16種來(lái)源于免疫、血管和基質(zhì)的細(xì)胞，以及肌肉干/祖細(xì)胞（MuSCs）和一些肌纖維肌細(xì)胞核的兩個(gè)不同亞群，為研究人類(lèi)肌肉組織的異質(zhì)性和識(shí)別疾病環(huán)境中MuSCs的多樣性和失調(diào)的潛在靶點(diǎn)提供了參考。De Micheli等［105］一共鑒定了15種不同的細(xì)胞類(lèi)型，包括肌肉干和祖細(xì)胞的異質(zhì)群。通過(guò)配體-受體相互作用分析，確定了超過(guò)100對(duì)突變細(xì)胞和非肌原細(xì)胞之間與再生相關(guān)的旁分泌通信對(duì)，為研究肌肉再生過(guò)程中細(xì)胞通訊的相互作用提供了參考。通過(guò)利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，可以更好的對(duì)肌肉組織細(xì)胞類(lèi)群進(jìn)行分類(lèi)，對(duì)細(xì)胞異質(zhì)性有更好的研究，為進(jìn)一步研究肌纖維發(fā)育提供有力的支持。

6" 展" 望

隨著現(xiàn)代科技分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，對(duì)細(xì)胞類(lèi)型鑒定的方法多種多樣，在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的支持下用標(biāo)記基因來(lái)鑒定細(xì)胞類(lèi)群的方法運(yùn)用的最為廣泛且準(zhǔn)確。通過(guò)不同標(biāo)記基因的方法鑒定與肌纖維發(fā)育過(guò)程相關(guān)的細(xì)胞，可以大致將骨骼肌分為12多種細(xì)胞類(lèi)型。肌纖維發(fā)育和分化是影響肉品質(zhì)最重要的因素，深入探究其在不同發(fā)育階段的細(xì)胞組成與變化是必要的。尋找與肌纖維數(shù)量、面積和脂肪沉積方面相關(guān)的細(xì)胞類(lèi)型，發(fā)現(xiàn)與之相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控因子，為進(jìn)一步更好的了解肌纖維發(fā)育提供理論依據(jù)。

隨著人們生活水平的提高，追求好吃且健康的肉類(lèi)成為趨勢(shì)，根據(jù)不同畜禽骨骼肌發(fā)育的差異，在未來(lái)可以通過(guò)整合多組學(xué)的方法，將不同組學(xué)如代謝組、蛋白組、表型組和空間轉(zhuǎn)錄組等互相組合的方式，更好地揭示在不同狀態(tài)或者形態(tài)下畜禽骨骼肌發(fā)育情況，得到影響不同畜禽肉品質(zhì)差異的分子調(diào)控機(jī)制。同樣可以運(yùn)用多組學(xué)的方法分析影響肌纖維發(fā)育相關(guān)的細(xì)胞通訊網(wǎng)絡(luò)及通路，為進(jìn)一步探究不同畜禽肉品質(zhì)提供方向。也可以通過(guò)機(jī)器算法，代入育種模型中，將理論與實(shí)踐相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)新的肌肉細(xì)胞標(biāo)記和調(diào)控機(jī)制，為未來(lái)選育新品種提供參考。

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（編輯" 郭云雁）