摘" 要： 本研究旨在建立一種可同時(shí)檢測(cè)非洲馬瘟病毒（African horse sickness virus， AHSV）和西尼羅病毒（West Nile virus， WNV）的雙重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)方法。根據(jù)AHSV VP7基因序列和WNV Poly Protein基因的高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針，優(yōu)化反應(yīng)條件及體系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)其特異性、敏感性和重復(fù)性進(jìn)行測(cè)定，并采用該方法對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證。結(jié)果顯示：該方法能夠同時(shí)檢測(cè)AHSV和WNV，且特異性良好，與馬動(dòng)脈炎病毒、馬皰疹病毒1型、馬傳染性貧血病毒、馬腺疫鏈球菌、馬流感病毒等馬病核酸均無交叉反應(yīng)；敏感性高，AHSV和WNV最低檢測(cè)限均為10 copies·μL-1；組內(nèi)變異系數(shù)為0.04%～0.93%，組間變異系數(shù)為0.17%～4.83%，重復(fù)性良好；使用該方法對(duì)30份馬全血樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均為陰性。本試驗(yàn)建立的檢測(cè)方法對(duì)馬屬動(dòng)物檢疫、非洲馬瘟和西尼羅熱的監(jiān)測(cè)與防控具有重要意義。

關(guān)鍵詞： 雙重?zé)晒舛縍T-PCR；非洲馬瘟病毒；西尼羅病毒

中圖分類號(hào)：S852.659.4;S852.659.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）12-5873-07

doi： 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.12.048

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

收稿日期：2023-12-12

基金項(xiàng)目：外來動(dòng)物疫病傳入溯源精準(zhǔn)診斷技術(shù)與產(chǎn)品研究（2022YFD1800503）

作者簡(jiǎn)介：錢佳豪（1998-），浙江金華人，主要從事人畜共患病研究，E-mail： 1318672013@qq.com

*通信作者：沈青春，主要從事動(dòng)物支原體、布魯氏菌病防控及其生物信息學(xué)研究，E-mail： shenqingchun@caas.cn；王春鳳，主要從事新型動(dòng)物微生態(tài)制劑研究，E-mail： wangchunfeng@jlau.edu.cn

Establishment and Application of Dual TaqMan Fluorescence RT-PCR Detection Method for African Horse Sickness Virus and West Nile Fever Virus

QIAN" Jiahao1，2， LIU" Dan1， ZHOU" Shizhong1， ZHANG" Boyuan1， GAO" Jianshuai1， JIANG" Hui1，

FAN" Xuezheng1， ZHANG" Guangzhi1， DING" Jiabo1， WANG" Chunfeng2*， SHEN" Qingchun1*

（1.Key Laboratory of Animal Biosafety Risk Prevention and Control （North）， Institute of

Animal Science， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193，" China;

2.College of Veterinary Medicine， Jilin Agricultural University， Changchun 130118，" China）

Abstract：" This study aimed to develop a dual-fluorescence quantitative RT-PCR detection method capable of simultaneously identifying African horse sickness virus （AHSV） and West Nile virus （WNV）. Specific primers and probes were designed based on highly conserved regions of the AHSV VP7 gene and WNV Poly Protein gene. The reaction conditions and system were optimized， standard curves were established， and the method's specificity， sensitivity， and reproducibility were assessed. Clinical sample testing was conducted to validate the method. Results demonstrated that the method could effectively detect both AHSV and WNV with excellent specificity. No cross-reactivity was observed with equine arteritis virus （EAV）， equid Herpesvirus-1 （EHV-1）， equine infectious anemia virus （EIAV）， Streptococcus equi subsp. zooepidemicus （SEZ）， equine influenza virus （EIV） and other equine nucleic acids. The method exhibited high sensitivity， with the lowest detection limits for AHSV and WNV both at 10 copies·μL-1. Intra-assay coefficients of variation ranged from 0.04% to 0.93%， inter-assay coefficients of variation ranged from 0.17% to 4.83%， demonstrating good reproducibility. Testing 30 equine whole blood samples using this method yielded negative results. The detection method established in this study holds significant importance for equine animal quarantine， monitoring， and control of African horse sickness and West Nile fever.

Key words： duplex real-time RT-PCR; African horse sickness virus; West Nile virus

*Corresponding authors： SHEN Qingchun， E-mail： shenqingchun@caas.cn; WANG Chunfeng， E-mail： wangchunfeng@jlau.edu.cn

非洲馬瘟（African horse sickness， AHS）是由非洲馬瘟病毒（African horse sickness virus， AHSV）引起的馬屬動(dòng)物急性或亞急性的蟲媒傳染病，死亡率可達(dá)95%，主要通過蚊蟲叮咬傳播，感染馬通常表現(xiàn)出呼吸急促、發(fā)熱、浮腫、出血，甚至死亡。1987—1991年，AHSV在歐洲暴發(fā)對(duì)歐洲馬業(yè)產(chǎn)生了不可估量的損失［1-4］。AHS主要在非洲地區(qū)廣泛流行，近年來已擴(kuò)散到亞洲等地區(qū)，給多個(gè)國(guó)家的馬產(chǎn)業(yè)造成了巨大的損失［5-9］。西尼羅熱（West Nile Fever， WNF）是一種由西尼羅病毒（West Nile virus， WNV）引起的人畜共患傳染性疾病，也主要通過蚊蟲叮咬傳播，人類、鳥類、馬及其他哺乳類動(dòng)物感染后，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、腦炎等癥狀。該病具有宿主范圍大、流行性強(qiáng)、致病性高的特點(diǎn)，最初在非洲地區(qū)流行，后來擴(kuò)散到其他地區(qū)，包括亞洲、歐洲、北美和澳大利亞等地，每次暴發(fā)均能對(duì)人類與動(dòng)物造成嚴(yán)重危害［10-15］。2012年，美國(guó)多個(gè)州出現(xiàn)了歷史性的大規(guī)模西尼羅熱暴發(fā)，據(jù)統(tǒng)計(jì)當(dāng)年共確診了5 674例西尼羅病毒病例，其中2 873例報(bào)告為西尼羅病毒，死亡人數(shù)達(dá)286人［16，17］。

我國(guó)目前還未出現(xiàn)非洲馬瘟和西尼羅的感染病例，但隨著國(guó)際交流的日益頻繁，面臨的風(fēng)險(xiǎn)逐漸加大。我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部印發(fā)的關(guān)于《國(guó)家動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)與流行病學(xué)調(diào)查計(jì)劃（2021—2025年）》的通知中強(qiáng)調(diào)要對(duì)馬屬動(dòng)物其中的這兩種疫病進(jìn)行嚴(yán)格監(jiān)測(cè)。當(dāng)前針對(duì)這兩種疫病仍沒有有效的治療藥物，主要依靠預(yù)防為主，為此有效快速的診斷技術(shù)是防止疫病傳播的前沿防線［8，18］。

AHSV和WNV均為RNA病毒，都可感染馬屬動(dòng)物，且均通過蚊蟲傳播。本研究基于熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，針對(duì)AHSV的VP7基因和WNV多聚蛋白（poly protein）基因設(shè)計(jì)并合成檢測(cè)引物和探針，建立了一種能夠檢測(cè)非洲馬瘟和西尼羅病毒雙重TaqMan 熒光定量 RT-PCR 方法，旨在提高非洲馬瘟和西尼羅病毒感染的診斷和監(jiān)測(cè)水平，有望為疫情控制和研究提供技術(shù)支持。

1" 材料與方法

1.1" 材料

1.1.1" 病毒與臨床樣本

病毒包括馬動(dòng)脈炎病毒（equine arteritis virus， EAV）、馬皰疹病毒1 型（equid Herpesvirus-1， EHV-1）、馬傳染性貧血病毒（equine infectious anemia virus， EIAV），馬腺疫鏈球菌（Streptococcus equi subsp. zooepidemicus， SEZ）、馬流感病毒 H3N8（equine influenza virus， EIV） 由新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所提供，30份馬血樣本采集自天津某馬場(chǎng)。

1.1.2" 主要試劑

Hifair V one-step RT-gDNA digestion SuperMix for qPCR （11142ES60" Yeasen）購(gòu)自翌圣生物科技（上海）股份有限公司，質(zhì)粒小量提取試劑盒（D6943-01 Omegabiotek）購(gòu)自廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司，PCR八連管購(gòu)自北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司。

1.1.3" 主要儀器

熒光定量 PCR 儀（Applied BiosystemsTM 7500）購(gòu)自賽默飛世爾科技公司，Qubit 4 熒光計(jì)購(gòu)自Thermo Fisher Scientific有限公司，Milli-Q IQ 7000 超純水凈化系統(tǒng)購(gòu)自Millipore美國(guó)，-40 ℃冰箱購(gòu)自松下電器（中國(guó)）有限公司，離心機(jī)和移液器均購(gòu)自德國(guó) Eppendorf公司。

1.2" 方法

1.2.1" 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中收錄的AHSV所有VP7基因序列和近三年世界范圍內(nèi)流行的WNV全序列，應(yīng)用SnapGene（V6.0.2）軟件進(jìn)行序列比對(duì)，分析共有序列并設(shè)計(jì)AHSV和WNV的特異性引物和探針，熒光修飾選擇FAM以及VIC熒光基團(tuán)，引物和探針均由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，引物、探針序列見表1。

1.2.2" 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)在NCBI搜集到AHSV以及WNV的序列，針對(duì)AHSV的VP7基因以及WNV的多聚蛋白（poly protein）基因，選擇可以覆蓋熒光定量擴(kuò)增區(qū)域的基因片段序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，并連接至pUC57 載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，測(cè)序鑒定序列正確。重組質(zhì)粒分別命名為pAHSV-VP7、pWNV-Poly。使用Qubit4測(cè)定pAHSV-VP7、pWNV-Poly重組質(zhì)粒的濃度均為40 μg·mL-1，根據(jù)公式：6.02×1023copies·mol-1×（濃度）/［MW（g·mol-1）］=copies·mL-1。其中，平均分子質(zhì)量（MW）：dsDNA=堿基數(shù)×660道爾頓/堿基，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pAHSV-VP7、pWNV-Poly濃度分別為1.2×1010、1.0×1010 copies·μL-1。

1.2.3" 反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，制備總體積為20μL的反應(yīng)體系，并分別對(duì)各引物濃度（0.1～1.0 μmol·L-1）、探針濃度（50～250 nmol·L-1）、退火溫度（56～60 ℃）進(jìn)行優(yōu)化。反應(yīng)程序：50 ℃ 15 min，95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，退火 30 s（采集FAM以及VIC熒光信號(hào)），45 個(gè)循環(huán)。

1.2.4" 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別將2種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍倍比稀釋后，取101～108稀釋度，即含1.2×108～1.2×101 copies·μL-1 pAHS-VP7、1.0×108～1.0×101 copies·μL-1 pWNV-POLY的質(zhì)粒以及二者混合物分別作為模板，采用優(yōu)化的TaqMan熒光定量RT-PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增，以不同濃度的質(zhì)粒拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值 lg（X）為 X軸，以與其所對(duì)應(yīng)的 Ct值作為 Y 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算擴(kuò)增效率，E=［10-（1/slope）-1］×100%。

1.2.5" 特異性測(cè)試

分別以 EAV、EHV-1、EIAV、 SEZ、EIV的病毒核酸作為樣本，采用上述優(yōu)化好的方法進(jìn)行 RT-PCR擴(kuò)增，檢測(cè)該方法的特異性。

1.2.6" 敏感性檢驗(yàn)

取濃度為1.0×108～1.0×101 copies·μL-1的兩種重組質(zhì)?；旌虾笞鳛槟０澹凑战⒌碾p重RT-PCR方法擴(kuò)增，每個(gè)陽性質(zhì)粒做3次重復(fù)，確定本研究建立的方法的敏感性以及最低檢出限。

1.2.7" 重復(fù)性試驗(yàn)

分別用1.0×108～1.0×101 copies·μL-1的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品混合物稀釋液，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算組內(nèi)和組間的標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)，評(píng)價(jià)方法的重復(fù)性。

1.2.8" 臨床樣本檢測(cè)

提取30份馬血樣本中的核酸，并用已優(yōu)化的雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)該方法的敏感性、特異性進(jìn)行驗(yàn)證。

2" 結(jié)" 果

2.1" 最佳反應(yīng)條件

經(jīng)過對(duì)引物、探針濃度及退火溫度分別進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳反應(yīng)體系：2×Hifair Ⅲ P buffer 10 μL，Hifair UH Ⅲ Enzymes 1 μL ，Hieff 50×Low Rox 0.4 μL ，AHS（10 μmol·L-1上、下游引物各1 μL，10 μmol·L-1探針0.5 μL），WNV（10 μmol·L-1上、 下游引物各1 μL，10 μmol·L-1探針0.5 μL），AHS、WNV模板各1 μL，ddH2O 1.6μL；最佳退火溫度為58 ℃。

2.2" 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

AHS以及WNV的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。結(jié)果顯示，兩組拷貝數(shù)與Ct值均有良好的線性關(guān)系，擴(kuò)增效率較高：AHS（R2=0.999 6，E=95.49%），WNV（R2=0.998 9，E=97.43%）。

2.3" 敏感性試驗(yàn)

根據(jù)敏感性測(cè)試結(jié)果并結(jié)合檢測(cè)臨界值判定，AHSV、WNV最低檢測(cè)限可達(dá)到10 copies·μL-1，結(jié)果如圖2。

1～8. 1×108～1×101 copies·μL-1 WNV 陽性質(zhì)粒；9～16. 1×108～1×101 copies·μL-1 AHSV 陽性質(zhì)粒

1-8. 1×108-1×101 copies·μL-1 WNV positive plasmid; 9-16. 1×108-1×101 copies·μL-1 AHSV positive plasmid

2.4" 重復(fù)性試驗(yàn)

以1×108～1×101copies·μL-1的兩種重組質(zhì)?；旌虾笞鳛槟０?，進(jìn)行組內(nèi)和組間的重復(fù)性試驗(yàn)，重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。AHSV組內(nèi)變異系數(shù)為0.04%～0.41%，組間變異系數(shù)為0.17%～4.83%；WNV組內(nèi)變異系數(shù)為0.09%～0.93%，組間變異系數(shù)為1.94%～4.36%。以上數(shù)據(jù)表明，本方法檢測(cè)AHSV以及WNV病毒具有良好的穩(wěn)定性及重復(fù)性。

2.5" 特異性試驗(yàn)

分別以 EAV、EHV-1、EIAV、 SEZ、EIV的病毒核酸作為樣本，采用上述優(yōu)化好的方法進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，檢測(cè)該方法的特異性。特異性試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明該方法特異性良好。

2.6" 臨床樣本檢測(cè)

用已優(yōu)化的雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法對(duì)天津某馬場(chǎng)采集的30份馬血樣品核酸進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖4。結(jié)果顯示，30份臨床樣本的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，符合率為100%。

3" 討" 論

非洲馬瘟和西尼羅熱是均能夠以蚊蟲為媒介傳

播的重要傳染病，在全球多個(gè)地區(qū)出現(xiàn)流行，對(duì)馬屬動(dòng)物的危害極大，隨著全球一體化的進(jìn)程加快，非洲馬瘟與西尼羅病毒傳播擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)加大，每次暴發(fā)都對(duì)當(dāng)?shù)伛R產(chǎn)業(yè)造成巨大損失，尤其是西尼羅病毒能引起人類感染，是一種嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生安全的蟲媒病毒，近年來多次導(dǎo)致重大的人類傳染?。?7］。雖然我國(guó)沒有出現(xiàn)AHS以及WNV的感染病例，但隨著國(guó)內(nèi)賽馬及馬術(shù)俱樂部的開始發(fā)展，國(guó)內(nèi)外馬匹的貿(mào)易逐漸興盛，加大了傳入風(fēng)險(xiǎn)，及時(shí)有效地對(duì)這兩種疫病進(jìn)行檢測(cè)至關(guān)重要［19-20］。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法能夠從各種樣品中檢測(cè)AHSV和WNV，包括血清、腦脊液、蚊子等樣品，與傳統(tǒng)的病毒分離或免疫學(xué)檢測(cè)等診斷方法相比，該方法縮短了診斷時(shí)間，并且具有靈敏度高，特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，能夠檢測(cè)極低濃度的核酸，從而迅速和準(zhǔn)確的定量微量的目標(biāo)核酸，此外該技術(shù)還能實(shí)現(xiàn)高通量的樣本處理和分析，更有助于批量地進(jìn)行樣本檢測(cè)［17，21］。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)被廣泛用于多種疫病的聯(lián)合診斷，大幅度提高了診斷的效率。趙文華等［22］開發(fā)了一種針對(duì)AHSV的TaqMan探針熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，最小檢出量為102copies·μL-1，并且需要兩套引物才能對(duì)AHSV所有的血清型進(jìn)行鑒定。吳江等［23］建立的WNV的RT-RPA檢測(cè)方法，最小檢出量為5.25×102 copies·μL-1，檢測(cè)時(shí)間僅需20 min。

本研究根據(jù)AHSV和WNV基因組序列的特點(diǎn)，建立了一種能夠同時(shí)檢測(cè)AHSV和WNV的TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，最小檢出量可達(dá)10 copies·μL-1，經(jīng)組內(nèi)與組間重復(fù)試驗(yàn)、特異性驗(yàn)證和臨床樣本檢測(cè)，結(jié)果表明本方法對(duì)于檢測(cè)AHSV以及WNV具有較好的敏感性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。

4" 結(jié)" 論

本研究建立的雙重?zé)晒釸T-PCR方法具有靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性強(qiáng)的特點(diǎn)，能在短時(shí)間內(nèi)同時(shí)檢測(cè)AHSV和WNV，為非洲馬瘟與西尼羅病的病原監(jiān)測(cè)與防控提供重要技術(shù)手段。

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（編輯" 白永平）