摘" 要： 旨在探究奶源大腸桿菌是否存在異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象，對(duì)異質(zhì)性耐藥大腸桿菌及其耐藥亞群的生物學(xué)特性進(jìn)行研究，探究其可能的異質(zhì)性耐藥機(jī)制。本研究采用微量肉湯稀釋法測(cè)定從生牛乳中分離得到的1 株大腸桿菌 D1的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），采用 K-B 紙片擴(kuò)散法對(duì)大腸桿菌的異質(zhì)性耐藥情況進(jìn)行初篩，采用菌落譜型分析（population analysis profile，PAP）進(jìn)行確證，并通過耐藥穩(wěn)定性測(cè)試和生物膜試驗(yàn)探究大腸桿菌的異質(zhì)性耐藥特征，最后通過全基因組測(cè)序和重測(cè)序分析產(chǎn)生異質(zhì)性耐藥的機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該株大腸桿菌對(duì)多黏菌素E表現(xiàn)為中介，對(duì)磺胺異惡唑耐藥，對(duì)其余抗生素表現(xiàn)為敏感，K-B 紙片擴(kuò)散法篩出 2 種大腸桿菌-抗菌藥物異質(zhì)性耐藥組合。PAP 確證顯示，D1-阿莫西林-克拉維酸的 MIC/最高非抑菌濃度（maximum noninhibitory concentration，MNIC）的比值為 8 ，耐藥亞群的發(fā)生頻率為 2.45×10-6，確證為多西環(huán)素異質(zhì)性耐藥菌株。傳代穩(wěn)定性表明耐藥亞群不能穩(wěn)定遺傳，而生長(zhǎng)試驗(yàn)不存在生長(zhǎng)滯后現(xiàn)象，耐藥亞群的生物膜產(chǎn)量極顯著大于親本菌株。全基因組測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，耐藥亞群與親本菌株之間存在基因突變，而突變基因 txR 是一種特定的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可能導(dǎo)致大腸桿菌對(duì)多西環(huán)素產(chǎn)生異質(zhì)性耐藥。奶源大腸桿菌存在多西環(huán)素異質(zhì)性耐藥的現(xiàn)象，提示臨床中應(yīng)合理使用多西環(huán)素抗生素，因此在使用多西環(huán)素進(jìn)行臨床治療時(shí)應(yīng)更加注意異質(zhì)性耐藥的發(fā)生，需采用有效的檢測(cè)方法，為臨床防控和合理使用抗生素提供指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞： 奶源大腸桿菌；異質(zhì)性耐藥；耐藥亞群；全基因組

中圖分類號(hào)：S852.612

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）12-5813-12

doi： 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.12.043

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

收稿日期：2024-06-04

基金項(xiàng)目：自治區(qū)天山英才項(xiàng)目（2023TSYCCX0034）；國家自然科學(xué)基金（32060797）；自治區(qū)重大科技專項(xiàng)資助項(xiàng)目（2022A02006-3-2）

作者簡(jiǎn)介：高姣姣（1999-），女，陜西榆林人，碩士生，主要從事乳品病原微生物研究，E-mail：2816996289@qq.com

*通信作者：趙艷坤，主要從事奶及奶制品營養(yǎng)與安全研究，E-mail：yankunzhao90@163.com

Characterization of Heterogeneous Drug-resistant Escherichia coli and Its Drug-resistant Subpopulations from Milk Sources

GAO" Jiaojiao1，2， ZHENG" Nan3， SHAO" Wei1， CHEN" He2， MA" Xianlan2， ZHAO" Yankun1，2，3*

（1.Xinjiang Meat and Milk Herbivore Nutrition Laboratory， College of Animal Science， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830052， China;

2.Ministry of Agriculture and Rural Affairs Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Agro-Products， Key Laboratory of Agro-Products Quality and Safety of Xinjiang， Institute of Quality Standards amp; Testing Technology for Agro-Products， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences， Urumqi 830091，" China;

3.Key Laboratory for Quality amp; Safety Control for Milk and Dairy Products of Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Institute of Animal Science， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193，" China）

Abstract：" The aim of this study was to investigate whether heteroresistance exists in milk-derived Escherichia coli， and to characterize the biology of heteroresistance E. coli and its resistant subgroups， in order to explore possible heteroresistance mechanisms.The minimum inhibitory concentration （MIC） of one E. coli strain named D1 which isolated from raw cow's milk was determined by micro broth dilution method. The heteroresistance of E. coli was initially screened by the K-B paper diffusion method， and confirmed by the population analysis profile （PAP）， and the heteroresistance characteristics of E. coli were investigated by resistance stability test and biofilm assay， finally， the mechanism of heterogeneous resistance was analyzed by whole genome sequencing and resequencing. The results showed that this E. coli was intermediary to polymyxin E， resistant to sulfisoxazole， and showed sensitivity to the rest of the antibiotics， and two E. coli-antimicrobial heteroresistance combinations were screened out by K-B paper diffusion assay.PAP confirmation showed that the MIC/maximum noninhibitory concentration （MNIC） ratio of E. coli was 8， and the occurence frequency of the resistant subgroups was 2.45×10-6， confirming D1 to be a heteroresistance doxycycline-resistant strain. The stability of transmission showed that the resistant subpopulation could not be inherited stably， while there was no growth lag in the growth test， and the biofilm production of the resistant subpopulation was significantly greater than that of the parental strain. Whole genome sequencing revealed that there was a gene mutation between the resistant subpopulation and the parental strain， and the mutant gene txR is a specific transcriptional regulator that may lead to heteroresistance to doxycycline in E. coli. In conclusion， the existence of heteroresistance to doxycycline in E. coli from milk sources suggests that doxycycline antibiotics should be used rationally in the clinic， therefore， more attention should be paid to the occurrence of heteroresistance when using doxycycline in clinical treatment， and effective detection methods need to be used to provide guidance for clinical prevention and control and rational use of antibiotics.

Key words： milk-derived Escherichia coli; heteroresistance; resistant subgroups; whole genome

*Corresponding author： ZHAO Yankun，E-mail：yankunzhao90@163.com

大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli），又叫大腸埃希菌，是腸桿菌科埃希菌屬的一個(gè)物種。E.coli 是一種革蘭陰性的條件致病菌，主要引起奶牛乳腺炎和犢牛瀉腹［1-2］。在臨床實(shí)踐中，抗生素通常用來治療E. coli疾病，其中治療E. coli感染的常用抗生素有氟苯尼考、氨芐西林、多西環(huán)素等，多西環(huán)素是使用較為廣泛的四環(huán)素類藥物［3-4］。但由于抗菌藥物的不合理使用，導(dǎo)致E. coli的耐藥性增加，使得抗菌藥物治療效果降低，對(duì)E. coli疾病的控制和公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了重大威脅［5］。同時(shí)抗菌藥物的殘留對(duì)奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［6］。此外，已有報(bào)道E. coli對(duì)磷霉素［7］、黏菌素［8］、β-內(nèi)酰胺類/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑［9-10］存在異質(zhì)性耐藥（heteroresistance，HR）。

異質(zhì)性耐藥是指在一個(gè)細(xì)菌菌群中的一個(gè)亞群能夠在抗生素濃度至少比最低抑菌濃度高8倍的情況下生長(zhǎng)，且不影響優(yōu)勢(shì)亞群的生長(zhǎng)［11-13］。當(dāng)選用根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦的肉湯稀釋法篩選的“敏感”藥物治療時(shí)，會(huì)導(dǎo)致HR細(xì)菌中的部分耐藥細(xì)菌亞群無法徹底清除，進(jìn)而發(fā)展成為完全耐藥菌株［14］。HR是抗藥性發(fā)展到臨床耐藥性的中間階段，也是臨床抗菌藥物治療失敗的主要原因之一。近年來，越來越多的試驗(yàn)證明，細(xì)菌群中存在少量耐藥亞群會(huì)導(dǎo)致抗生素治療失敗，并可能與疾病治療失敗有關(guān)［12，15］。然而，對(duì)四環(huán)素類大腸桿菌異質(zhì)性耐藥的研究較少，大多研究集中在大腸桿菌對(duì)于黏菌素類抗生素的異質(zhì)性耐藥［16-18］。對(duì)于奶源中 E. coli的異質(zhì)性耐藥流行情況的相關(guān)報(bào)道較少，其異質(zhì)性耐藥機(jī)制也尚不明確。因此，深入分析奶源E. coli的異質(zhì)性耐藥流行情況對(duì)于有效預(yù)防和控制奶牛源大腸桿菌感染尤為重要。

為探究奶源中E. coli的HR現(xiàn)象和相關(guān)耐藥特征，本研究選取從生牛乳中分離的1株E. coli進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，采用紙片擴(kuò)散法對(duì)E. coli進(jìn)行HR的初篩，PAP法進(jìn)行確證，并開展耐藥穩(wěn)定性測(cè)定和生物膜試驗(yàn)探究E. coli的HR特征，通過全基因組測(cè)序分析HR菌株，為臨床治療E. coli感染提供有效的借鑒和幫助。

1" 材料與方法

1.1" 材料

1.1.1" 試驗(yàn)菌株

標(biāo)準(zhǔn)菌株：大腸桿菌 ATCC25922；試驗(yàn)菌株：大腸桿菌 D1 由本實(shí)驗(yàn)室2022年在湛江燕塘澳新牧業(yè)采集的生鮮乳樣本中分離鑒定并保存。

1.1.2" 主要試劑與儀器

麥康凱培養(yǎng)基、LB 肉湯、Mueller-Hinton 瓊脂培養(yǎng)基（MHA）、0.85% 生理鹽水（每支9 mL）均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；藥敏板、Kirby-Bauer（K-B）藥敏紙片購自一諾康（天津）生物科技有限公司；一次性接種環(huán)、培養(yǎng)皿、“L”型涂布棒、離心管、移液槍、購自新疆鼎峰生物科技有限公司。電子天平、濁度儀、電熱恒溫培養(yǎng)箱、立式壓力蒸汽滅菌鍋、臺(tái)式高速離心機(jī)等。

1.2" 方法

1.2.1" 藥物敏感性試驗(yàn)

根據(jù) CLSI［19］測(cè)試 D1 菌株對(duì) 16 種抗菌藥物的敏感性。用麥?zhǔn)蠞岫葍x調(diào)整菌液至 0.5 麥?zhǔn)蠞岫?，接種至含有不同濃度藥物的 96 孔板中，測(cè)試以下抗菌藥物：氨芐西林（ampicillin，AMP）、阿莫西林-克拉維酸（amoxicillin/clavulanic acid，AMC）、頭孢噻吩（cephalothin，CEP）、頭孢噻呋（ceftiofur，CET）、美羅培南（meropenem，MEC）、鏈霉素（straptomycin，S）、卡那霉素（kanamycin，K）、慶大霉素（gentamicin，CN）、四環(huán)素（tetracycline，TET）、多西環(huán)素（doxycycline，DO）、氟苯尼考（florfenicol，F(xiàn)FC）、多黏菌素E（polymyxinE，PE）、利福昔明（Rifaximin，RIF）、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、磺胺異惡唑（sulfisoxazole，SIZ）和復(fù)方新諾明（sulfamethoxazole，SXT）。將藥敏板放置于 35 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 18～20 h，凡細(xì)菌生長(zhǎng)的小孔中，呈彌散狀渾濁或圓形沉淀，在無細(xì)菌生長(zhǎng)的孔內(nèi)所含最低抗菌藥物濃度即最低抑菌濃度（MIC），空白對(duì)照孔應(yīng)無細(xì)菌生長(zhǎng)。測(cè)量 MIC 值，判定結(jié)果分為敏感、中介或耐藥，折點(diǎn)判定參照 CLSI。

1.2.2" K-B 藥敏試驗(yàn)

用無菌接種環(huán)挑取新鮮菌落接種到0.85%的生理鹽水中，震蕩均勻，調(diào)制成0.5麥?zhǔn)蠞岫龋?×108 CFU·mL－1）的菌懸液，吸取 100 μL 菌懸液接種于 MHA 平板上，用“L”型涂布棒將培養(yǎng)基表面涂均勻，至培養(yǎng)基表面完全干燥，用無菌鑷子夾取藥敏紙片貼到平板中心位置。將貼有藥敏紙片的平板倒置于培養(yǎng)箱內(nèi)，控制溫度范圍為 37± 1 ℃，培養(yǎng) 18～24 h后，觀察結(jié)果。如果培養(yǎng)基表面抑菌圈內(nèi)出現(xiàn)明顯的菌落生長(zhǎng)則判定為疑似異質(zhì)性耐藥。

1.2.3" 菌落譜型分析（population analysis profile，PAP）

利用 PAP 法，依次制備抗生素濃度為 0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256 μg·mL－1 的 MHA 平板，用無菌接種環(huán)挑取新鮮菌落接種于0.85%的生理鹽水中，震蕩均勻，調(diào)制成0.5麥?zhǔn)蠞岫龋?×108 CFU·mL－1）的菌懸液，然后進(jìn)行梯度稀釋，分別稀釋成 103、104、105、106、107 和 108 的菌懸液。將不同梯度的菌懸液分別接種到不同抗生素濃度的 MHA 平板上，用“L”型涂布棒涂布均勻，每個(gè)梯度設(shè)置兩個(gè)平行。將接種菌懸液并涂布均勻的 MHA 平板倒置于 37 ℃± 1 ℃ 的培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24～48 h。從培養(yǎng)箱取出抗生素平板，對(duì)每個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，再根據(jù)之前的稀釋倍數(shù)換算成實(shí)際生長(zhǎng)的菌落數(shù)，以抗生素濃度（μg·mL－1）為橫坐標(biāo)，lg（CFU·mL－1）為縱坐標(biāo)進(jìn)行作圖，若 MIC 與最高非抑菌濃度（MNIC）的比值大于 8，且耐藥亞群頻率大于 1×10-7，則可以確認(rèn)為是HR菌株［12］。對(duì)照菌株為大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 ATCC25922。

1.2.4" 耐藥亞群穩(wěn)定性測(cè)試

將最高抗生素濃度下生長(zhǎng)的菌落接種在不含抗生素的 MHA 平板上，傳代 30代，每傳代5代測(cè)一次最低抑菌濃度。觀察耐藥亞群穩(wěn)定性的變化情況，若仍然保持耐藥表型即為穩(wěn)定異質(zhì)性耐藥菌株，若恢復(fù)敏感即為不穩(wěn)定異質(zhì)性耐藥菌株。

1.2.5" 生長(zhǎng)曲線測(cè)試

生長(zhǎng)試驗(yàn)是為了觀察親本菌株與耐藥亞群在相同培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)速度是否存在顯著差異，以此來鑒別異質(zhì)性耐藥亞群是否存在生長(zhǎng)滯后的現(xiàn)象。將異質(zhì)性耐藥菌株及其亞群的單菌落接種到 LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r·min－1 培養(yǎng)過夜。先制備濃度為1×107 CFU·mL－1 的菌懸液，吸取10 μL加入每孔含有100 μL LB肉湯的96孔板中，37 ℃、180 r·min－1搖床上孵育，每隔1 h測(cè)1次OD600值，共測(cè)定24 h，根據(jù)OD600值繪制生長(zhǎng)曲線，比較生長(zhǎng)速率，重復(fù)3次。

1.2.6" 生物膜試驗(yàn)

分別取培養(yǎng)過夜的異質(zhì)性耐藥親本菌株和亞群，稀釋 50 倍后，接種到含有 LB 肉湯的玻璃試管中，LB 肉湯為陰性對(duì)照，設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)，37 ℃ 靜置培養(yǎng) 24 h。使用酶標(biāo)儀測(cè)量 OD600，以確定總生物量。使用 PBS 緩沖液洗滌3次，倒置晾干，結(jié)晶紫草酸銨染色 15 min，單蒸水沖洗后晾干；每孔加入 150 μL 95% 酒精，室溫反應(yīng) 30 min，并測(cè)定每個(gè)樣品的 OD570。將生物膜形成確定為 OD570/OD600 比率，以此測(cè)試樣品之間的生長(zhǎng)差異最小化。試驗(yàn)每組設(shè)置3個(gè)平行。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P≤0.05）通過獨(dú)立 t 檢驗(yàn)，以 P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.7" 全基因組測(cè)序

將大腸桿菌在麥康凱平板上進(jìn)行劃線，挑取菌落接種到 LB 肉湯中 37 ℃ 培養(yǎng) 16 h，5 000 r·min－1 室溫離心 5 min 收集菌體，棄上清保留沉淀菌體，加入無菌水清洗1～2次，然后轉(zhuǎn)移到離心管。將菌體送至美吉生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

將基因的氨基酸序列與各數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，得到對(duì)應(yīng)的功能注釋信息。對(duì)大腸桿菌分離株進(jìn)行基礎(chǔ)注釋分析，包括 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）數(shù)據(jù)庫、Gene Ontology（GO）數(shù)據(jù)庫、Cluster of Orthologous Groups of proteins（COG）數(shù)據(jù)庫；進(jìn)行特定基因功能分析，包括 Virulence Factors of Pathogenic Bacteria（VFBD）毒力因子注釋分析、The Comprehensive Antibiotic Resistance Database（CARD）綜合性抗菌藥物耐藥性數(shù)據(jù)庫注釋、Transporter Classification Database（TCDB）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分類數(shù)據(jù)庫分析、Pathogen Host Interactions（PHI）病原與宿主互作數(shù)據(jù)庫注釋、Carbohydrate-Active enZYmes Database（CAZy）碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫；進(jìn)行比較基因組分析、SNP 和 InDel 注釋分析、遺傳進(jìn)化分析。

2" 結(jié)" 果

2.1" 藥物敏感性測(cè)定結(jié)果

對(duì)E. coli D1 菌株進(jìn)行16 種抗菌藥物的藥物敏感性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)D1菌株對(duì)氨芐西林、阿莫西林-克拉維酸、頭孢噻呋、美羅培南、卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、氟苯尼考、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明表現(xiàn)為敏感，對(duì)多黏菌素 E 表現(xiàn)為中介，對(duì)磺胺異惡唑表現(xiàn)為耐藥，結(jié)果見表1。

2.2" 異質(zhì)性耐藥初篩結(jié)果

根據(jù)耐藥性的判定結(jié)果，選擇 D1 菌株對(duì)抗菌藥物表現(xiàn)為敏感的抗生素進(jìn)行異質(zhì)性耐藥的初篩。結(jié)果共計(jì)篩出2種大腸桿菌-抗菌藥物異質(zhì)性耐藥組合，即 E.coli D1 對(duì)多西環(huán)素和阿莫西林-克拉維酸疑似異質(zhì)性耐藥（圖1）。

2.3" 異質(zhì)性耐藥確證結(jié)果

將異質(zhì)性耐藥疑似菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸桿菌 ATCC25922 同時(shí)用 PAP 法驗(yàn)證菌株是否為異質(zhì)性耐藥，結(jié)果如圖 2，D1-多西環(huán)素的MIC為128，MNIC為 16，MIC/MNIC的比值為8，且在多西環(huán)素濃度為128 μg·mL－1（最高濃度且有菌落生長(zhǎng)）平板上的菌落數(shù)與無抗生素平板上的菌落數(shù)相比得到耐藥亞群的發(fā)生頻率為 2.45×10-6，大于 1.0×10-7，判定 D1 為多西環(huán)素異質(zhì)性耐藥菌株；D1-阿莫西林克拉維酸的 MIC 為16，MNIC為8，比值為2，所以判定 D1-阿莫西林克拉維酸不是異質(zhì)性耐藥菌株。

2.4" 異質(zhì)性耐藥菌株的耐藥穩(wěn)定性

挑取最高抗菌藥物濃度平板上生長(zhǎng)的菌，即為耐藥亞群，在無抗菌藥物濃度的平板上傳代30次，每5代測(cè)定1次MIC值，耐藥亞群D1-R的第一代從128 μg·mL－1多西環(huán)素培養(yǎng)基上挑取，在無抗生素的培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)。結(jié)果顯示耐藥亞群D1-R的初始MIC值為 2 μg·mL－1，D1-R在第一代就恢復(fù)為敏感表型，表現(xiàn)出極不穩(wěn)定的異質(zhì)性耐藥表型，但MIC值仍為親本菌株D1的8倍。

2.5" 生長(zhǎng)適應(yīng)性代價(jià)

生長(zhǎng)曲線試驗(yàn)結(jié)果表明，親本菌株 D1 與耐藥亞群 D1-R 的生長(zhǎng)速率無顯著差異（圖3）。本結(jié)果表明該現(xiàn)象并非緩慢生長(zhǎng)的持留菌現(xiàn)象，耐藥亞群較其親本菌株未表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)滯后現(xiàn)象。

2.6" 生物被膜測(cè)定

生物被膜的產(chǎn)生量也是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥的主要原因之一，因此，明確異質(zhì)性耐藥菌株和其亞群的生物被膜生成能力是否發(fā)生變化，可以提供有關(guān)的耐藥性的信息。通過生物被膜的產(chǎn)量的定量分析，耐藥亞群 D1-R 的生物膜產(chǎn)量極顯著大于親本菌株 D1（圖 4）。

2.7" 全基因組測(cè)序分析

2.7.1" 基因組基本特征分析結(jié)果

D1 株基因組大小為 5 088 075 bp，基因組 GC 含量為50.84%，預(yù)測(cè)到編碼基因有4 816 個(gè)，編碼基因總長(zhǎng)度為4 440 414 bp，串聯(lián)重復(fù)序列有 53 個(gè)，tRNA 基因有89個(gè)，rRNA基因有22個(gè)，還預(yù)測(cè)到D1存在24個(gè)基因島和7個(gè)前噬菌體，并且繪制了D1的基因組圈圖（圖5）。

2.7.2" 基因功能注釋分析

2.7.2.1" COG數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果：將D1的基因編碼蛋白序列與COG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，總共注釋到24種功能的4 042個(gè)基因，有COG注釋的基因占所有基因的83.93%。編碼碳水化合物的運(yùn)輸和代謝（Carbohydrate transport and metabolism）相關(guān)功能基因是最多的，有417個(gè)；編碼氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝（Amino acid transport and metabolism）相關(guān)功能基因有381個(gè)；編碼轉(zhuǎn)錄（Transcription）相關(guān)功能基因有334個(gè)，具體結(jié)果如圖6A所示。

2.7.2.2" GO數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果：將D1的基因編碼蛋白序列與GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，D1中共有3 825個(gè)基因得到注釋，占所有基因的79.42%。其中生物過程中調(diào)控DNA觸發(fā)的轉(zhuǎn)錄（regulation of DNA-templated transcription）和磷酸化（phosphorylation）是基因富集程度最高的2個(gè)途徑；細(xì)胞組成中膜的組成部分（integral component of membrane）和質(zhì)膜（plasma membrane）是基因富集程度最高的2個(gè)途徑；分子功能中的DNA結(jié)合（DNA binding）和ATP結(jié)合（ATP binding）是基因富集程度最高的2個(gè)途徑，具體結(jié)果如圖6B所示。

2.7.2.3" KEGG數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果：將D1的基因編碼蛋白序列與KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，總共有3 394個(gè)編碼基因得到注釋，分為細(xì)胞學(xué)過程（Cellular processes）、環(huán)境信息處理（Environmental）、遺傳信息處理（Genetic）、人類疾?。℉uman diseases）、新陳代謝（Metabolism）、以及有機(jī)系統(tǒng)（Organismal systems）這6個(gè)KEGG一級(jí)功能類別上，進(jìn)一步可細(xì)分為42個(gè)KEGG二級(jí)功能類別。其中，注釋到的最多編碼基因類別是全球地圖和概覽地圖（Global and overview maps）和碳水化合物代謝（Carbohydrate metabolism）分別是 966 341 個(gè)，具體結(jié)果如圖6C所示。

2.7.3" 特定基因功能注釋

2.7.3.1" TCDB數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果：轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分類數(shù)據(jù)庫（Transporter Classification Database，TCDB），通過比對(duì)TCDB數(shù)據(jù)庫（http：//www.tcdb.org/）獲得每個(gè)樣本中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因。TCDB 數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)移系統(tǒng)以5個(gè)級(jí)別進(jìn)行分類，D1菌株共有1 204個(gè)基因在TCDB中得到注釋，注釋到最多的分別是初級(jí)活性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Primary Active Transporter）（392個(gè)基因）和電化學(xué)電位驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Electrochemical Potential-driven Transporters）（318個(gè)基因），如圖7A所示。

2.7.3.2" PHI數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果：PHI全稱為Pathogen Host Interactions，即病原與宿主互作數(shù)據(jù)庫。通過PHI數(shù)據(jù)庫注釋，獲得D1菌株中包含1 056個(gè)病原與宿主互作相關(guān)基因的信息。其中，有691個(gè)基因突變后毒力減弱，318個(gè)基因突變后不受影響，83個(gè)基因突變后可能會(huì)增加毒力，80個(gè)基因突變后喪失致病性，26個(gè)突變成效應(yīng)子，18個(gè)突變后致死，3個(gè)突變后有化學(xué)耐藥性，另有2個(gè)突變后有化學(xué)敏感性，如圖7B所示。

2.7.3.3" CAZy數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果：碳水化合物在很多生物學(xué)功能中具有重要地位，通過研究碳水化合物相關(guān)酶可以得到大量有意義的生物學(xué)信息。碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫（Carbohydrate-Active enZYmes Database， CAZy）主要包含：糖苷水解酶（Glycoside Hydrolases，GHs），糖基轉(zhuǎn)移酶（GlycosylTransferases，GTs），多糖裂合酶（Polysaccharide Lyases，PLs），碳水化合物酯酶（Carbohydrate Esterases，CEs），碳水化合物結(jié)合模塊（Carbohydrate-Binding Modules，CBMs），輔助氧化還原酶（Auxiliary Activities，AAs）等六大類蛋白質(zhì)家族。通過 CAZy 數(shù)據(jù)庫（http：//www.cazy.org/）比對(duì)，CAZy 分析的結(jié)果統(tǒng)計(jì)如圖7C所示。

2.7.3.4" VFDB數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果：D1 基因組中注釋到的毒力基因數(shù)共616個(gè)，其中注釋到營養(yǎng)/代謝因素毒力因子最多，這說明菌株D1可能通過調(diào)控營養(yǎng)/代謝毒力因子來抑制病原菌的生長(zhǎng)（圖8）。

2.7.3.5" CARD數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果：D1基因組共預(yù)測(cè)有11余類331個(gè)耐藥基因，包括氨基香豆素類抗菌藥物、膦酸抗菌藥物、氟喹諾酮類抗菌藥物、頭孢菌素抗菌藥物、噁唑烷酮類抗菌藥物、肽抗菌藥物、氨基糖苷類抗菌藥物、四環(huán)素抗菌藥物、碳青霉烯類、核苷類抗菌藥物（表2）。在各類耐藥基因中，以抗生素外排機(jī)制涉及的耐藥基因最多，涉及耐藥結(jié)節(jié)分化家族（RND）、主要易化子超家族（MFS）、ATP結(jié)合盒家族超家族（ATP）等41個(gè)基因（表3）。

2.7.4" 比較基因組分析

2.7.4.1" 基因組基本特征比較分析：

將親本菌株 D1 與耐藥亞群 D1-R 菌株進(jìn)行了基本特征信息比較，D1 基本特征與 D1-R 相似，在同源基因上存在差異（圖9）。

2.7.4.2" SNP和 InDel 注釋分析：經(jīng)全基因測(cè)序分析 gene1615（txR）是一種特定的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，使四環(huán)素類抗生素產(chǎn)生耐藥性，參與 tet 35 的正常運(yùn)作。耐藥亞群 D1-R 與親本菌株 D1 參考基因組比對(duì)發(fā)現(xiàn)在 gene1615 基因的下游1 651 655位置處發(fā)生非同義突變，堿基T突變?yōu)閴A基G，影響了氨基酸的排列順序，可能導(dǎo)致了多西環(huán)素的異質(zhì)性耐藥。此外，未發(fā)現(xiàn)基因上存在插入和缺失突變。

2.7.4.3" 遺傳進(jìn)化分析：進(jìn)化樹在生物學(xué)中，用來表示物種之間的進(jìn)化關(guān)系，它給出的分支層次或拓?fù)鋱D形是分化或享有共同祖先的一種反映，樹枝的長(zhǎng)度反映當(dāng)這些事件發(fā)生時(shí)物種間的進(jìn)化距離。親本菌株 D1 與耐藥亞群 D1-R 處于同一分枝上，與華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2024年提交的豬腎源分離得到的 E. coli ExPEC A338 菌株同源性最高［20］（圖10）。

3" 討" 論

目前，在臨床治療由 E.coli 感染時(shí)首選的是抗生素［21］。在治療中遇到異質(zhì)性耐藥 E.coli 時(shí)，會(huì)導(dǎo)致異質(zhì)性耐藥細(xì)菌中的耐藥亞群無法徹底清除，從而導(dǎo)致異質(zhì)性耐藥 E.coli 感染治療失敗，會(huì)出現(xiàn)病程延長(zhǎng)、反復(fù)感染，給臨床有效防控造成困擾，并影響?zhàn)B殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益和健康發(fā)展［22］。因此，研究奶源 E.coli 異質(zhì)性耐藥尤為重要。

本研究通過采用微量肉湯稀釋法的藥敏試驗(yàn)對(duì)分離出的1株 E.coli 進(jìn)行敏感性測(cè)定，結(jié)果顯示，分離株對(duì)頭孢噻吩、利福昔明、磺胺異惡唑耐藥，對(duì)其余抗生素表現(xiàn)為敏感。使用對(duì)該菌株敏感的藥物進(jìn)行藥敏紙片擴(kuò)散試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)阿莫西林-克拉維酸和多西環(huán)素紙片抑菌圈內(nèi)有散落的菌株出現(xiàn)。利用 PAP 法進(jìn)行確證，結(jié)果表明菌株 D1 的 MIC/MNIC 的比值為 8 ，且耐藥亞群的發(fā)生頻率為 2.45×10-6，大于 1.0×10-7，判定 D1 為多西環(huán)素異質(zhì)性耐藥菌株。Kuang等［18］研究豬源 E.coli 對(duì)黏菌素異質(zhì)性耐藥的發(fā)生頻率介于 4.26×10-7～5.57×10-5。Liao等［16］研究 E.coli 對(duì)黏菌素異質(zhì)性耐藥耐藥亞群發(fā)生頻率為 4.0×10-7～4.0×10-6。與本研究對(duì)比發(fā)現(xiàn)，E.coli 對(duì)黏菌素異質(zhì)性耐藥的發(fā)生頻率相對(duì)較高。根據(jù)異質(zhì)性耐藥菌的形成機(jī)制可分為穩(wěn)定性耐藥亞群和不穩(wěn)定性耐藥亞群［23］。本試驗(yàn)中耐藥亞群 D1-R在第一代就恢復(fù)為敏感表型，表現(xiàn)出不穩(wěn)定的異質(zhì)性耐藥，但MIC值仍為親本菌株D1的8倍。趙冰［24］在研究雞源 E.coli 對(duì)磷霉素異質(zhì)性耐藥中得到的6株耐藥亞群，除1株耐藥亞群 XBH1在無抗生素下培養(yǎng)10 d后對(duì)磷霉素的耐藥相對(duì)穩(wěn)定外，其他5株耐藥亞群的敏感性均有不同程度的恢復(fù)，耐藥亞群對(duì)磷霉素的MIC值升高了2～8倍。鄺啟紅［25］在動(dòng)物源E.coli對(duì)黏菌素和頭孢噻呋異質(zhì)性耐藥的特性研究中篩選出的17株異質(zhì)性耐藥亞群在不含多黏菌素的 LB 肉湯中連續(xù)培養(yǎng) 3 代后經(jīng)藥敏檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)除 EPF42 菌對(duì)多黏菌素仍然耐藥外，其余 10 株菌對(duì)多黏菌素又重新恢復(fù)高度敏感。這些研究結(jié)果與本試驗(yàn)是一致的。這表明耐藥亞群很少能達(dá)到臨床耐藥水平，盡管如此，這種現(xiàn)象不應(yīng)被忽視，因?yàn)檫@些耐藥亞群的耐藥水平在持續(xù)的抗生素壓力下可能達(dá)到或超過臨床耐藥水平。

細(xì)菌生物被膜由微生物群落和自身分泌的胞外物質(zhì)構(gòu)成，大腸桿菌通過形成生物被膜加強(qiáng)了對(duì)宿主免疫系統(tǒng)和抗菌藥物的耐受性，是造成細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的原因之一［26-27］。生物被膜的自發(fā)突變、外部刺激因素、內(nèi)部微環(huán)境和種間相互作用等過程導(dǎo)致生物被膜層內(nèi)形成廣泛不同的亞群，生物被膜生物量越高［28-29］。通過生物膜的產(chǎn)量的定量分析，耐藥亞群 D1-R 的生物膜產(chǎn)量極顯著大于親本菌株 D1，因此生物膜產(chǎn)生量的增加可能是造成D1菌株產(chǎn)生異質(zhì)性耐藥的原因之一。

利用全基因組測(cè)序分析E. coli D1菌株的分子生物學(xué)特性，結(jié)果顯示D1菌株基因組大小為5 088 075 bp，基因組GC含量為50.84%，預(yù)測(cè)到編碼基因有4 816個(gè)，編碼基因總長(zhǎng)度為4 440 414 bp。在COG數(shù)據(jù)庫中注釋到24種功能的4 042個(gè)基因，有COG注釋的基因占所有基因的83.93%。與GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，其中生物過程中調(diào)控DNA觸發(fā)的轉(zhuǎn)錄和磷酸化是基因富集程度最高的2個(gè)途徑；細(xì)胞組成中膜的組成部分和質(zhì)膜是基因富集程度最高的2個(gè)途徑；分子功能中的DNA結(jié)合和ATP結(jié)合是基因富集程度最高的2個(gè)途徑。在KEGG分析中注釋到的最多編碼基因類別是全球地圖和概覽地圖和碳水化合物代謝相關(guān)基因。還在TCDB數(shù)據(jù)庫、PHI數(shù)據(jù)庫和CAZy數(shù)據(jù)庫中獲得注釋。在VFDB數(shù)據(jù)庫和CARD數(shù)據(jù)庫中D1共預(yù)測(cè)到616個(gè)毒力基因和331個(gè)耐藥基因。

異質(zhì)性耐藥的機(jī)制在基因?qū)用孢€有可能是抗菌藥物耐藥相關(guān)基因突變導(dǎo)致的［29］。遺傳進(jìn)化分析表示親本菌株D1與耐藥亞群D1-R處于同一分枝上，與華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2024年提交的豬腎源分離得到的E.coli ExPEC A338菌株一致性最高［20］。通過比較基因組分析發(fā)現(xiàn)親本菌株D1和耐藥亞群D1-R的基本特征相似，在同源基因上存在差異。李聰聰?shù)龋?1］在銅綠假單胞菌對(duì)環(huán)丙沙星的異質(zhì)性耐藥的研究中通過全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn) 11 株耐藥亞群中，有8株發(fā)生mexS突變，2株發(fā)生gyrA突變；除此之外，基因fleQ、PA2632和PAKAF_02255均分別在1株菌株中發(fā)生突變。Liao 等［16］研究E. coli對(duì)黏菌素異質(zhì)性耐藥時(shí)發(fā)現(xiàn)，DC 8243的pmrB（L14R）發(fā)生突變和 DC 8471的 pmrB（P95L）發(fā)生突變。本研究中耐藥亞群D1-R與大腸桿菌D1參考基因組比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在 gene1615 基因的染色體上1 651 655位置處發(fā)生非同義突變，堿基T突變?yōu)閴A基G，這可能導(dǎo)致了D1產(chǎn)生異質(zhì)性耐藥。而gene1615（txR）是一種特定的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，使四環(huán)素類抗生素產(chǎn)生耐藥性，參與tet 35的正常運(yùn)作。所以推測(cè) D1 菌株產(chǎn)生異質(zhì)性耐藥的機(jī)制還可能與轉(zhuǎn)錄有關(guān)。本試驗(yàn)中的菌株數(shù)量有限，存在一定的局限性，后續(xù)將在會(huì)更大范圍內(nèi)進(jìn)行 E. coli異質(zhì)性耐藥菌株篩查，并繼續(xù)從轉(zhuǎn)錄以及翻譯等層面，探索 D1 菌株的異質(zhì)性耐藥的機(jī)制。

此外，異質(zhì)性耐藥在金黃色葡萄球菌［32］、肺炎克雷伯菌［33］、鏈球菌［34］等都有被報(bào)道。目前對(duì)異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象的關(guān)注越來越多，更多的研究試圖闡明這種特別的耐藥機(jī)制［35］。盡管異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象很早就有發(fā)現(xiàn)，但是，由于其各亞群的組成在不同條件下是動(dòng)態(tài)變化的，所以目前國內(nèi)外有關(guān)動(dòng)物源 E. coli 異質(zhì)性耐藥的研究較少，大多都集中在人類醫(yī)學(xué)。然而人類的食物大都追溯到動(dòng)物身上，所以研究動(dòng)物源異質(zhì)性耐藥是必行趨勢(shì)。

4" 結(jié)" 論

本研究中的大腸桿菌D1確證為多西環(huán)素異質(zhì)性耐藥菌株，但耐藥亞群D1-R不能穩(wěn)定遺傳，而D1-R的生物膜產(chǎn)量極顯著大于D1，通過全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)大腸桿菌D1與耐藥亞群D1-R之間存在基因突變（txR）。因此，生物膜產(chǎn)生量的增加和抗菌藥物耐藥相關(guān)基因突變可能是大腸桿菌D1產(chǎn)生異質(zhì)性耐藥的原因。

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（編輯" 范子娟）