摘" 要： 奶牛自身免疫反應是影響早期妊娠胚胎丟失的重要因素之一。妊娠的建立和胎盤的發(fā)育依賴于免疫細胞（Tregs細胞、巨噬細胞、NK細胞等）和免疫調(diào)節(jié)因子的共同作用，來實現(xiàn)子宮對胚胎的容受性、胚胎植入以及妊娠母體的免疫耐受性。因此，深入了解奶牛妊娠早期各個階段的免疫反應過程，對提高妊娠率至關重要。本文系統(tǒng)闡述了奶牛授精及妊娠早期的免疫調(diào)控機制，分析了母體促炎因子與抗炎因子之間的平衡及復雜的動態(tài)調(diào)節(jié)過程。這些研究為保證奶牛從受精、囊胚孵化、妊娠識別到胚胎著床等關鍵階段的妊娠順利提供理論支持，皆在推動奶牛繁育效率的提升。

關鍵詞： 奶牛；受精；囊胚孵化；妊娠識別；圍著床期

中圖分類號：S823.91

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）12-5391-07

doi： 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.12.006

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

收稿日期：2024-06-03

基金項目：寧夏回族自治區(qū)重點研發(fā)項目（2022BBF03022）

作者簡介：鄭" 浩（2001-），男，河南濟源人，碩士，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：1571893591@qq.com

*通信作者：陶金忠，主要從事動物繁殖技術和繁殖障礙的研究，E-mail：tao_jz@nxu.edu.cn

Research Progress on Immune Regulatory Mechanisms of Early Pregnancy in Dairy Cows

ZHENG" Hao， SUN" Guohan， FU" Yu， YANG" Zhuo， TAO" Jinzhong*

（College of Animal Science and Technology， Ningxia University， Yinchuan 750021，" China）

Abstract： The immune response of dairy cows is one of the key factors influencing early pregnancy embryonic loss. The establishment of pregnancy and placental development rely on the coordinated actions of immune cells （such as Tregs， macrophages， and NK cells） and immune regulatory factors， which regulate the uterine receptivity to the embryo， embryo implantation， and maternal immune tolerance. Thus， a comprehensive understanding of the immune response processes at various stages of early pregnancy in cows is essential for improving pregnancy success rates. This paper provides a detailed analysis of the immune regulation mechanisms during artificial insemination and early pregnancy in cows. It examines the balance and complex dynamic regulation between pro-inflammatory and anti-inflammatory factors in the maternal system.This research offer theoretical support for ensuring successful pregnancy through key stages including fertilization， blastocyst hatching， pregnancy recognition， and embryo implantation， aiming to enhance reproductive efficiency in dairy cows.

Key words： cow; fertilization; blastocyst hatching; pregnancy recognition; peri-implantation period

*Corresponding author： TAO Jinzhong， E-mail：tao_jz@nxu.edu.cn

目前，奶牛人工授精（AI）的受精率在85%～90%之間，而經(jīng)產(chǎn)奶牛單次授精后的產(chǎn)犢率為40%～50%［1］。導致繁殖性能降低的一個主要因素是妊娠早期胚胎丟失率高。據(jù)統(tǒng)計，高達50%的妊娠失敗發(fā)生在胚胎發(fā)育的前4周，其中60%胚胎丟失發(fā)生在授精后第17天之前［2，3］。在奶牛繁殖過程中，成功懷孕與免疫系統(tǒng)的精細調(diào)節(jié)密切相關，母體免疫耐受和對胚胎的免疫平衡保持至關重要。這一過程中涉及內(nèi)分泌、免疫和生殖系統(tǒng)的復雜相互作用。奶牛圍著床期的早期階段包括受精、囊胚孵化、妊娠識別和胚胎植入。母體激素、免疫細胞和細胞因子的免疫動態(tài)平衡調(diào)節(jié)對于保證妊娠成功至關重要。特定的細胞因子，如白細胞介素（interleukin，IL）-10、生長轉(zhuǎn)化因子（TGF-β）等抗炎因子，有助于維持這一平衡，促進胚胎發(fā)育和植入。然而，胚胎發(fā)育過程中如果促炎反應過度激活，如腫瘤壞死因子（TNF-α）和IL-1β的過量分泌，則可能導致胚胎丟失。此外，全身性炎癥或免疫反應（如代謝應激和慢性炎癥）也可能通過干擾生殖道內(nèi)的免疫環(huán)境，降低繁殖效率。因此，通過深入了解奶牛妊娠早期免疫系統(tǒng)的調(diào)控機制，特別是調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）和細胞因子的作用機制，有助于降低胚胎丟失率，并為奶牛的高效繁殖提供理論依據(jù)。

1" 授精過程的免疫調(diào)節(jié)

精液進入母牛體內(nèi)后，會面臨母體的免疫防御系統(tǒng)，這一系統(tǒng)確保質(zhì)量最優(yōu)的精子能到達受精部位。雌性生殖道作為免疫系統(tǒng)的初始屏障，能夠有效地靶向并清除致病抗原，同時對含有外來遺傳物質(zhì)的精液保持耐受。在精液通過生殖道后，子宮內(nèi)膜和輸卵管內(nèi)還會發(fā)生一系列的細胞免疫和體液免疫反應［4］。在授精后，活躍的精子-子宮交叉反應會引發(fā)Th 1型淋巴細胞的產(chǎn)生，這是為了清除多余和死亡的精子及入侵病原體；與此同時，精子-輸卵管相互作用會引發(fā)Th 2型淋巴細胞的產(chǎn)生，以支持精子存活直到受精。研究表明，在AI過程中，添加精漿（seminal plasma，SP）可分別使奶牛和肉牛的妊娠率提高4.6%和6.7%［5］。這些變化是由于SP中存在的活性分子誘導的細胞因子和白細胞介導的免疫反應所致。在AI后，牛子宮內(nèi)膜上皮細胞（bovine endometrial epithelial cells，BEEC）與SP相互作用，其中轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β家族在SP中起著關鍵信號轉(zhuǎn)導作用，對BEEC的重塑至關重要。此外，IL-6和IL-8在病原體免疫反應發(fā)揮著關鍵作用［6］。

1.1" 精液與子宮免疫反應

在牛自然交配過程中，精液沉積在陰道內(nèi)，精子與SP一同進入子宮，觸發(fā)母體的免疫反應［7］。在AI后，精子、SP以及稀釋劑和冷凍保護劑等成分被直接注入子宮。精子與子宮的相互作用會誘導多形核中性粒細胞（polymorphonuclear neutrophils，PMNs）快速且短暫的浸潤子宮腔，在AI后3 h內(nèi)開始出現(xiàn)在子宮腔內(nèi)，6 h時達到最大值，并在AI后10 h完全消失［7，8］。PMNs通過吞噬、抗菌物質(zhì)分泌和中性粒細胞胞外陷阱（NET）的釋放清除病原體和質(zhì)量差的精子［9］。AI后6 h，大部分精漿和死精從子宮或陰道中排出，留下少量優(yōu)質(zhì)精子。這種快速且短暫的PMNs浸潤確保子宮為胚胎著床做好準備。

精子與牛子宮內(nèi)膜接觸引發(fā)了Th 1淋巴細胞介導的免疫反應，促使IL-8、TNF-α、IL-1β和前列腺素E合酶（prostaglandin E synthase，PTGES）的表達量增加，TGF-β1表達量降低［10］。Ibrahim等［11］研究表明，SP和精子可增加子宮內(nèi)膜上皮細胞和基質(zhì)細胞中IL-17A表達，這可能有助于細胞炎癥和吸引γδT細胞涌入子宮內(nèi)膜，這在反芻動物妊娠早期很重要；而且發(fā)現(xiàn)SP在奶牛子宮內(nèi)膜內(nèi)誘導24 h時，IL-1β的表達量會顯著增加（Plt;0.05）［12］。此外，精子是通過TLR2/4通路介導在BEEC發(fā)生炎癥反應［13］，而SP成分在高生育力公牛和低生育力公牛間存在差異。Nongbua等［14］體外研究發(fā)現(xiàn)，低生育力公牛的SP在BEEC上誘導的促炎因子如TGF-β家族、IL-6和IL-8等顯著高于高生育力公牛（Plt;0.05）。高生育力公牛的SP可能通過增加IL-10等抗炎因子的表達，促進子宮的免疫平衡，減少不必要的炎癥反應。

1.2" 精液與輸卵管免疫反應

輸卵管在哺乳動物繁殖中起著至關重要的作用，為卵母細胞成熟、精子獲能、受精以及配子和胚胎運輸提供了理想的環(huán)境［15］。黃體生成素（luteinizing hormone，LH）通過與牛輸卵管上皮細胞（bovine oviduct epithelial cells，BOEC）上的受體結(jié)合，調(diào)節(jié)牛輸卵管的增殖和分泌功能，進而促進前列腺素（prostaglandin，PG）的分泌，這一過程不僅通過前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的釋放調(diào)節(jié)局部微環(huán)境，還通過PI3K/Akt信號通路調(diào)節(jié)輸卵管的促分泌活動。在奶牛自然交配或AI后，少量的精子進入輸卵管進行獲能和激活［16］。獲能后的精子被輸送至受精部位，與局部免疫細胞相互作用，并通過上調(diào)BOEC中TGF-β1、IL-10的表達和下調(diào)TNF-α、IL-1β的表達來誘導抗炎免疫反應［17］。PMNs在排卵前階段通常存在于牛輸卵管液中，BOEC通過PGE2抑制PMNs的吞噬行為，創(chuàng)造了一個保護精子的微環(huán)境，使其免受吞噬，保持活力超過24 h，增加受精幾率。研究還表明，精漿微囊泡（EVs）在這一過程中發(fā)揮了關鍵作用，通過抑制活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生和IL-8誘導的PMNs遷移，進一步維持輸卵管內(nèi)的抗炎狀態(tài)［18］。

授精時免疫反應是由射精時固有的精子蛋白還是與精子表面結(jié)合的SP蛋白觸發(fā)？為了回答這個問題，Recuero等［19］研究表明，將小母牛與輸精管切除的公牛交配后，母牛的子宮內(nèi)膜和陰道的轉(zhuǎn)錄組變化不大，表明精子而非精漿是觸發(fā)免疫反應的主要因素［20］。精子通過激活子宮中的PMNs清除無效精子和病原體，并通過TLR信號通路觸發(fā)局部先天免疫反應。

2" 妊娠識別前的免疫調(diào)節(jié)

在胚胎植入前，胚胎與輸卵管及子宮之間會發(fā)生重要的免疫串擾。輸卵管是胚胎發(fā)育的最初場所，受精后的胚胎通常在輸卵管中度過約3～4 d的時間。在此期間，胚胎與輸卵管上皮細胞（BOEC）密切接觸，BOEC通過分泌生長因子和免疫調(diào)節(jié)因子來支持胚胎的發(fā)育并調(diào)控局部免疫環(huán)境。這種串擾在維持胚胎存活和發(fā)育過程中起著關鍵作用，同時避免母體免疫系統(tǒng)對胚胎的過度排斥反應。該階段胚胎經(jīng)歷了第一次有絲分裂，同時胚胎基因組激活［21］。第4～6天，桑椹期胚胎進入子宮，然后形成一個囊胚，囊胚內(nèi)形成內(nèi)細胞團，囊胚腔或中央腔被單層滋養(yǎng)外胚層細胞包圍；第7～8天，從透明帶孵化后，在第9～10天囊胚發(fā)育成原腸胚，然后被稱為孕體［22］。孵化的囊胚在第12～14天之間形成卵圓形孕體，在第13天只有約2 mm長，到第14天，孕體約為6 mm，到第16天達到約60 mm的長度，到第19天它的長度為20 cm或更長。在第9～16天之間，牛囊胚/孕體的長度每天增加一倍，在第12～19天之間生長顯著增加（Plt;0.05）［23］。在奶牛懷孕的早期階段，由于胚胎的作用，無論是在母牛生殖道還是全身血液都要耐受半同種異體的胚胎，以保持胚胎正常發(fā)育和著床，胚胎不僅調(diào)節(jié)母牛生殖道的局部免疫，而且還調(diào)節(jié)全身的抗炎免疫反應。多項體內(nèi)和體外的試驗研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)育中的胚胎會調(diào)節(jié)牛輸卵管和子宮免疫因子［24］。

2.1" 胚胎與輸卵管免疫反應

研究表明，早期發(fā)育中的胚胎通過直接接觸或以旁分泌的方式影響牛輸卵管的免疫反應。Maillo等［25］對含有多個胚胎和單個胚胎的牛輸卵管峽部上皮細胞進行了轉(zhuǎn)錄組測序，研究發(fā)現(xiàn)，受精后第3天（D3），當輸卵管內(nèi)存在多個胚胎時會下調(diào)牛體內(nèi)免疫功能相關的基因，如下調(diào)炎癥基因NFkB2、CXCL2、CCL20和抗原呈遞基因CD74、TAPBP的表達；而在僅有單個胚胎的輸卵管中未觀察到這些差異表達基因。Talukder等［26］在體外胚胎-輸卵管共培養(yǎng)試驗中發(fā)現(xiàn)，受精后D4的胚胎通過上調(diào)BOEC中PTGES的表達來增加PGE2分泌，并通過下調(diào)NFkB的表達來誘導抗炎免疫反應。此外，發(fā)育中的胚胎分泌的干擾素-τ（IFN-τ）與BOEC之間的相互作用能上調(diào)干擾素刺激基因（ISGs：ISG15、OAS1、MX2），并且增加STAT1和TGF-β1的表達，同時下調(diào)外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中IL-17的表達，從而進一步促進輸卵管中的抗炎反應。

2.2" 胚胎與子宮免疫反應

在第5～9天桑椹期胚胎進入子宮并逐漸發(fā)育成囊胚，這一階段胚胎對子宮的免疫環(huán)境具有重要影響。Talukder等［27］通過體外桑椹期胚胎與BEEC共培養(yǎng)的研究發(fā)現(xiàn)，D5～D9胚胎能夠上調(diào)ISGs：ISG15、OAS1和MX2，同時下調(diào)促炎因子NFkB2、NFkBIA、TNF-α和IL-1β的表達。此外，胚胎還刺激BEEC中的PTGES和PGE2的分泌，表明胚胎在進入子宮的最初4 d內(nèi)能夠誘導抗炎反應。Passaro等［28］研究顯示，無論是體內(nèi)還是體外培養(yǎng)的D8囊胚，都能激活牛子宮內(nèi)膜外植體中的IFN-τ信號通路，F(xiàn)iorenza等［29］則發(fā)現(xiàn)奶牛AI后D7的胚胎主要通過IFN-τ上調(diào)PMNs和PBMCs中ISGs的表達，從而誘導抗炎反應。值得注意的是，外周血液中的PMNs對IFN-τ的反應更為敏感，ISG15、OAS1和IL-10的表達量上調(diào)，同時促進母體產(chǎn)生Th 2淋巴細胞［30，31］。

3" 妊娠識別過程中的免疫調(diào)節(jié)

在奶牛AI后15天左右，母體開始經(jīng)歷大約2～3 d的妊娠識別，此時胚胎通過釋放IFN-τ信號延長卵巢黃體（corpus luteum，CL）的壽命，并確保其存在，該過程取決于孕體在子宮角內(nèi)的延伸率［32，33］。IFN-τ作為I型干擾素，在妊娠識別、預防感染以及胚胎-母體相互作用中起到重要的免疫調(diào)節(jié)作用。擴張和伸長的囊胚通過分泌足夠的IFN-τ確保信號傳遞至子宮內(nèi)膜，并進一步穿過子宮進入母體循環(huán)系統(tǒng)。最新研究發(fā)現(xiàn)，IFN-τ不僅在子宮靜脈和卵巢中發(fā)揮作用，還能輸送到PBMCs、CL、肝臟中，研究發(fā)現(xiàn)在牛懷孕第16天之后在肝細胞［34］、骨髓［35］、淋巴結(jié)［36］、脾［37］和胸腺［38］檢測到大量ISGs，進一步調(diào)節(jié)母體的全身免疫反應［39］。值得注意的是，PBMCs中ISG15和MX2的表達量與子宮內(nèi)IFN-τ含量呈正相關，妊娠奶牛比未妊娠奶牛在第18和20天的ISG15和MX1的表達量更高、第16、18和20天的MX2基因表達更高［40，41］。

在子宮內(nèi)，IFN-τ通過抑制雌激素受體和催產(chǎn)素受體的表達，減少前列腺素（PGF）2α的分泌，從而阻止CL溶解，促進黃體壽命的延長，并增強子宮的容受性［42］。在AI后16～17 d，IFN-τ與孕酮（P4）協(xié)同作用，促進胚胎的伸長和胚胎附植相關基因的表達，增加子宮腔內(nèi)調(diào)控胚胎存活和發(fā)育的物質(zhì)。IFN-τ和P4還調(diào)節(jié)了母體的免疫反應，使其從促炎性的Th 1反應偏向抗炎性的Th 2反應，同時Tregs的參與進一步增強了母體對胚胎的免疫耐受［43］。這一協(xié)同作用對于成功的妊娠維持至關重要。說明在妊娠識別前母體產(chǎn)生的P4和胚胎產(chǎn)生的IFN-τ協(xié)同作用，抑制子宮和輸卵管促炎因子的產(chǎn)生，促進抗炎因子的產(chǎn)生。

4" 圍著床期免疫調(diào)節(jié)

在奶牛早期妊娠過程中，Tregs淋巴細胞等免疫細胞共同作用，形成一個高度調(diào)控的免疫環(huán)境，以確保胚胎成功植入和發(fā)育。在奶牛受孕后17～18天左右，胚胎滋養(yǎng)層細胞和子宮附著細胞會發(fā)生顯著變化（Plt;0.05），單核滋養(yǎng)層細胞增殖驅(qū)動滋養(yǎng)外胚層長度的指數(shù)增加［44］。而IFN-τ調(diào)節(jié)下的IL-10和吲哚胺2，3-雙加氧酶（IDO）的活性升高，是胚胎與母體免疫系統(tǒng)之間平衡的重要因素［45］。

Tregs細胞通過抑制母體免疫系統(tǒng)對胎兒的免疫攻擊，支持胚胎的植入和早期發(fā)育。奶牛在妊娠的前幾周，外周血中的Tregs細胞數(shù)量顯著增加，特別是在子宮局部積累。它們分泌抑制性細胞因子，如IL-10和TGF-β，幫助胚胎逃避母體免疫系統(tǒng)的攻擊，確保母體免疫系統(tǒng)處于“免疫容受”狀態(tài)，避免攻擊半同種異體的胎兒。研究表明，在受孕后的奶牛子宮內(nèi)膜中IL-10的上調(diào)不僅下調(diào)組織相容性復合體（MHC）Ⅱ的表達，抑制Tregs合成促炎細胞因子，還減弱巨噬細胞和樹突狀細胞的抗原呈遞能力［46］。此外，圍著床期子宮中的淋巴細胞減少，變性細胞增加，表明Tregs細胞與這些免疫細胞共同調(diào)節(jié)局部的免疫耐受環(huán)境，以支持胚胎的植入。Groebner等［47］研究發(fā)現(xiàn)，在奶牛妊娠的第18天，IDO活性增加18倍，表明色氨酸代謝通路的啟動。色氨酸代謝影響毒性T細胞的活性，IDO通過耗盡色氨酸促進母體對胎兒的免疫耐受。自然殺傷（NK）細胞在這個過程中也發(fā)揮著重要作用，通過識別外來MHC I分子［48，49］，NK細胞的調(diào)節(jié)功能對于胚胎的存活至關重要［50］。Vasudevan等［51］研究發(fā)現(xiàn)，妊娠第17～20天，懷孕奶牛子宮內(nèi)表達NK標志物的細胞顯著增加，抑制性分子如CD274、細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4（CTLA4）和淋巴細胞激活基因3（LAG3）的表達上調(diào)，誘導了淋巴細胞耐受性，以支持妊娠和胎盤的建立。

早期妊娠期間，Kamat等［52］發(fā)現(xiàn)奶牛子宮內(nèi)膜中出現(xiàn)大量髓系細胞（如巨噬細胞），這些細胞的MHCII、分化簇（CD）80、CD86、CD163和IDO1的轉(zhuǎn)錄物增多，外周循環(huán)血液中的CD14+和CD11c+細胞增加。研究表明，巨噬細胞通過分泌IL-10、PGF2α等抗炎因子，參與了M2表型的免疫耐受機制［53，54］。M2型巨噬細胞緩解炎癥并促進組織重塑，對胚胎和胎盤的發(fā)育有益［55］。相反，產(chǎn)生促炎因子如TNF-α、IL-6和趨化因子（CCL-2）的巨噬細胞則可能引發(fā)更強的免疫反應，影響妊娠進展。Tregs細胞的失調(diào)與妊娠失敗密切相關。如果Tregs細胞無法正常調(diào)控母體免疫系統(tǒng)，可能導致母體對胚胎的免疫排斥，引發(fā)胚胎死亡。因此，Tregs細胞的調(diào)控功能對于妊娠的維持至關重要。

5" 結(jié)論與展望

奶牛的繁殖性能在妊娠早期受到免疫系統(tǒng)的精細調(diào)控，涉及精子、胚胎與母體免疫系統(tǒng)的復雜相互作用，Tregs細胞、巨噬細胞和NK細胞等免疫細胞共同作用，確保母體對胚胎的耐受性，減少胚胎丟失率。相關研究處于初期階段，最終目的是了解妊娠早期這些階段所有免疫互作，這對奶牛養(yǎng)殖與生產(chǎn)中解決繁殖障礙，減少胚胎丟失意義重大。未來可通過Tregs細胞、巨噬細胞和NK細胞的活性，或使用免疫調(diào)節(jié)劑來提高奶牛的妊娠成功率。然而，仍需要很長時間獲得整個繁殖周期完整的免疫調(diào)控機制，未來的研究必須創(chuàng)新實驗設計，將實驗模型中的研究結(jié)果轉(zhuǎn)化到育種方向和管理方案上。這將有助于推動奶牛健康養(yǎng)殖和科學繁育，促進畜牧生產(chǎn)和獸醫(yī)領域的發(fā)展與應用。

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（編輯" 郭云雁）