摘" 要： 藍(lán)舌病病毒（bluetongue virus，BTV）是一種嚴(yán)重危害綿羊等反芻動物的蟲媒病毒，而綿羊微血管內(nèi)皮細(xì)胞（sheep lung microvascular endothelial cells，SLMECs）構(gòu)成肺半選擇性屏障，為研究BTV感染與SLMECs干擾素抗病毒免疫應(yīng)答的分子機(jī)制。本研究通過BTV噬斑試驗以感染復(fù)數(shù)（MOI）為1的BTV誘導(dǎo)18、24、36 h的SLMECs，通過實時熒光定量PCR分析干擾素相關(guān)通路基因mRNA表達(dá)特征，以及 Western blot分析MDA5、TRAF3、RIG-I和 TBK1蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，在誘導(dǎo)36 h時，干擾素信號通路基因mRNA表達(dá)的變化最明顯，RIG-I、MDA5、IKKε、IFN-β、TBK1和TRAF6基因mRNA上調(diào)表達(dá)，差異極顯著；而IFN-α、VISA、USP18基因mRNA下調(diào)表達(dá)，差異極顯著；在蛋白水平上 MDA5、TBK1、RIG-I和TRAF3蛋白都上調(diào)表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)BTV可感染SLMECs誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素免疫應(yīng)答，為進(jìn)一步分析IFN-I信號通路的激活在抗BTV感染天然免疫應(yīng)答中的作用機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 藍(lán)舌病病毒；Ⅰ型干擾素；綿羊肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞

中圖分類號： S852.659.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）12-5631-10

doi： 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.12.026

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

收稿日期：2024-01-23

基金項目：重慶市自然科學(xué)面上項目基金（CSTB2022NSCQ-MSX0419）;重慶市基礎(chǔ)研究與前沿探索專項項目基金（cstc2018jcyjAX0615）

作者簡介：羅世美（1998-），女，云南昭通人，碩士生，主要從事獸醫(yī)臨床感染與免疫研究，E-mail： 1918239281@qq.com；陳韻伊（2000-），女，云南麗江人，碩士生，主要從事獸醫(yī)臨床感染與免疫研究，E-mail： 2249029810@qq.com。羅世美和陳韻伊為同等貢獻(xiàn)作者

*通信作者：馬鮮平，主要從事獸醫(yī)病原微生物學(xué)研究，E-mail：124520096@qq.com；易華山，E-mail：dyxyihuashan@swu.edu.cn

Effect of Bluetongue Virus Infection on Type Ⅰ Interferon Responses in Sheep Lung Microvascular Endothelial Cells

LUO" Shimei1， CHEN" Yunyi1， LI" Qisha1， ZHOU" Yanmei1， HU" Xuerou1， LI" Mingyue1， WEI" Ziyu1， LI" Fang2， MA" Xianping1*， YI" Huashan1*

（1.College of Veterinary Medicine， Southwest University， Chongqing 402460，" China;

2.Dazu Center for Animal Disease Prevention and Control， Chongqing 402360，" China）

Abstract：" Bluetongue virus （BTV） is an arbovirus that seriously harms ruminants such as Sheep， while sheep lung microvascular endothelial cells （SLMECs） constitute a semi-selective barrier in order to study the molecular mechanism of interferon antiviral immune response in BTV infection and SLMECs. In this study， BTV plaque assay was used to induce SLMECs at 18 h， 24 h and 36 h with multiple infection （MOI） 1. The mRNA expression characteristics of interferon-related pathway genes were analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR， and the protein expressions of MDA5， TRAF3， RIG-I and TBK1 were analyzed by Western blot. The results showed that the changes of interferon signaling pathway gene expression were most obvious， and the mRNA expressions of RIG-I， MDA5， IKKε， IFN-β， TBK1 and TRAF6 genes were up-regulated， and the differences were extremely significant （Plt;0.01） at 36 h of BTV induction， while the mRNA expressions of IFN-α， VISA and USP18 genes were significantly downregulated （Plt;0.01）. At the protein level， the protein expressions of MDA5， TBK1， RIG-I and TRAF3 were mainly upregulated. This study found that BTV infection can induce an IFN immune response of SLMECs， which lays a foundation for further analysis of the mechanism of IFN-Ⅰ signaling pathway activation in the innate immune response against BTV infection.

Key words： bluetongue virus; type Ⅰ interferon; sheep lung microvascular endothelial cells

*Corresponding authors：" MA Xianping， E-mail： 124520096@qq.com; YI Huashan， E-mail：" dyxyihuashan@swu.edu.cn

藍(lán)舌病病毒（bluetongue virus，BTV）是呼腸孤病毒科（Reoviridae）的環(huán)狀病毒，其基因組由10個節(jié)段的雙鏈RNA組成［1-3］。BTV由媒介昆蟲庫蠓叮咬傳播，也通過直接接觸感染動物的分泌物或血液傳播，主要影響牛、綿羊等家畜及野生反芻動物［4-5］。BTV感染綿羊常引致其發(fā)熱、流鼻液、白細(xì)胞減少和嚴(yán)重的口腔和胃腸道黏膜炎癥和呼吸系統(tǒng)癥狀的藍(lán)舌?。╞luetongue，BT）［6-7］。綿羊等易感動物被感染BTV的庫蠓叮咬后，BTV進(jìn)入附近的淋巴結(jié)開始最初的復(fù)制增殖，然后侵染到全身其他組織，在單核吞噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中復(fù)制增殖［7］。宿主細(xì)胞對入侵的病毒通過模式識別受體（pattern-recognition receptors，PRRs）如維甲酸誘導(dǎo)基因I（retinoic acidinducible gene I，RIG-I）與黑色素瘤分化相關(guān)蛋白5（melanoma differentiation associated protein 5，MDA5）等識別并激活TANK結(jié)合激酶1（tank binding kinase 1，TBK1）等，從而產(chǎn)生具有啟動與增強(qiáng)抗原遞呈、抑制病毒復(fù)制等廣泛生物學(xué)活性的干擾素（inteferon，IFN）［8-9］ 。隨著全球變暖加劇，BT的分布更加廣泛，主要集中于全球北緯40°～南緯35°之間的熱帶和亞熱帶地區(qū)，近年來還在向更高緯度地區(qū)蔓延流行，因此加強(qiáng)對BT發(fā)病機(jī)制及其防控研究對畜牧業(yè)發(fā)展具有重要意義［10］。

研究表明，肺是反芻動物變態(tài)反應(yīng)的休克器官，而BTV能在單核吞噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制從而誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)和細(xì)胞凋亡，BTV感染肺組織引起肺微血管通透性障礙及誘導(dǎo)微血管損傷［11-13］。肺內(nèi)皮細(xì)胞（lung endothelial cells ， LECs）炎癥被認(rèn)為是肺部炎癥或損傷的重要致病特征；例如BTV可以感染綿羊肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（sheep lung microvascular endothelial cells，SLMECs），導(dǎo)致感染細(xì)胞凋亡或壞死及血管滲透性增加、 出血、液體滲出、血栓形成和組織梗死等［11，14-17］。干擾素作為一類重要的免疫調(diào)節(jié)因子，在機(jī)體抵御病毒感染方面發(fā)揮重要作用，而BTV感染SLMECs及其細(xì)胞內(nèi)IFN信號通路的影響仍不清楚。本研究以BTV誘導(dǎo)SLMECs，研究BTV誘導(dǎo)對SLMECs中Ⅰ型IFN信號分子表達(dá)的影響，為深入理解BTV誘導(dǎo)宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答及揭示病毒逃逸免疫監(jiān)視分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1" 材料與方法

1.1" 材料

BHK-21細(xì)胞、原代綿羊肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞、BTV-1株由本實驗室保存。

1.2" 主要試劑與儀器

胎牛血清購自美國Gibco公司；內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基購自賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)板購自Corning公司；MDA5、TRAF6、RIG-I兔單克隆抗體，CD31鼠單克隆抗體、CoraLite488標(biāo)記羊抗鼠 IgG（H+L）購自武漢三鷹生物公司；TBK1兔多克隆抗體、RIG-I、β-Actin鼠單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG（H+L）、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）等購自杭州碧云天生物科技公司；24孔板圓形細(xì)胞爬片購自上海臥宏生物科技公司，DAPI、Triton X-100購自Solarbio；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix購自Vazyme公司，TRIzolTMReagent購自Thermo Fisher公司，其余所用試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。倒置熒光顯微鏡 LEICA DMi8購自LEICA公司，QuantStudio 3 Quantita- tive RT-PCR儀為ABI公司，超高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測儀FUSION FX-XT 為VILBER 公司產(chǎn)品。

1.3" 藍(lán)舌病病毒滴度測定

37 ℃水浴復(fù)蘇SLMECs，1 000 r·min-1離心5min，用含5%胎牛血清、1%三抗（100X青霉素-鏈霉素-兩性霉素B溶液）、1%內(nèi)皮細(xì)胞營養(yǎng)因子、90% 內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，均勻鋪于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到1.2×105 cells·mL-1以上后進(jìn)行傳代時，鋪于24孔培養(yǎng)板。在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板接種已在BHK-21細(xì)胞上增殖一次后的BTV毒株，通過噬斑法測定病毒的含量并以“PFU·mL-1”表示。

1.4" SLMECs的免疫熒光分析

取爬片置于24孔板中，每孔加入培養(yǎng)基1 mL，加入細(xì)胞0.02 million個·孔-1。置培養(yǎng)箱2 h或過夜。吸出培養(yǎng)基，用PBS洗1遍，加入4% PFA于4 ℃固定30 min。用1×PBS洗3×5 min·次-1，取100 μL破膜封閉液（0.5% Trition X-100與PBS 1∶1混合，再加10% 羊血清）2 h后，吸出破膜封閉液；加200 μL一抗CD31（1∶200），4 ℃，2 h后，用1×PBS洗3×5 min·次-1；加200 μL二抗 CoraLite488標(biāo)記羊抗鼠 IgG（H+L）（1∶3 000）室溫避光孵育1 h，PBS洗3×5 min·次-1，染DAPI（DAPI：PBS=1∶1 000）5 min，PBS洗3×5min·次-1。取出爬片置于新干凈玻片上加1滴Fluoromount-G熒光封片劑后熒光顯微鏡觀察。

1.5" SLMECs的復(fù)蘇及BTV誘導(dǎo)釋放Ⅰ型干擾素

對“1.3”中復(fù)蘇培養(yǎng)的SLMECs，待細(xì)胞密度達(dá)到1.2×105 cells·mL-1以上后進(jìn)行傳代時，鋪于12孔、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，以感染復(fù)數(shù)（MOI）為1的BTV-1誘導(dǎo)SLMECs 18、24、36 h，分別設(shè)置感染組與對照組（control），進(jìn)行3次重復(fù)試驗。

1.6" 引物的設(shè)計與合成

參照NCBI中β-Actin（NM_007393.5）、RIG-Ⅰ（XR_004673265.1）、MDA5（NM_022168.4）、VISA（NM_001206491.2）、TBK1（KU_182750.1）、IKKε（DQ_667176.1）、TRAF3（NM_001199427.2）、TRAF6（XM_035012591.1）、USP18（NM_017414.4）、IFN-α（NM_024013.3）、IFN-β（NM_002176.4）序列應(yīng)用Primer-Blast程序設(shè)計，VP7（M63417.1）應(yīng)用Primer -Premier 5.0設(shè)計的qRT-PCR引物由重慶華大生物有限公司合成，引物序列見表1。

1.7" 實時熒光定量PCR檢測Ⅰ型干擾素通路基因的mRNA表達(dá)水平

分別收集3次按“1.5”方法處理的Control及BTV感染18、24和36 h 的SLMECs，吸棄培養(yǎng)基，用1×PBS清洗3次，用TRIzolTM Reagent提取細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板，以β-Actin、RIG-Ⅰ、MDA5、VISA、TBK1、IKKε、TRAF3、TRAF6、USP18、IFN-α、IFN-β基因引物參照Vazyme公司的ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測，反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件為95 ℃ 1 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共45個循環(huán)。

1.8" Western blot檢測Ⅰ型干擾素通路基因蛋白表達(dá)水平

將生長良好的SLMECs鋪于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時，添加感染復(fù)數(shù)（MOI）為1的BTV-1分別誘導(dǎo)細(xì)胞18、24和36 h，Control組不做處理，取處理的SLMECs，用1×PBS清洗2次，每孔用120 μL細(xì)胞裂解液（含PMSF）裂解提取細(xì)胞總蛋白，隨后各取10 μL（復(fù)孔各5 μL）加上15 μL的1×PBS用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定每個樣本的濃度，通過計算將濃度均一化，加上樣緩沖液，渦旋15 s后沸水浴10 min，12 000 r·min-1離心3 min。

1.9" 統(tǒng)計與分析

使用2－ΔΔＣt法計算qRT-PCR所得數(shù)據(jù)，采用Student t測驗進(jìn)行差異顯著性分析，統(tǒng)計學(xué)分析每組試驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，每組為三次重復(fù)，使用單因素方差分析，P lt;0.01差異極顯著，P lt;0.05差異顯著。

2" 結(jié)" 果

2.1" BTV-1滴度測定

噬斑試驗分析結(jié)果顯示，病毒滴度隨著時間延長而不斷增長，感染60～86 h后，出現(xiàn)明顯的病毒噬斑（圖1）。細(xì)胞上清BTV-1毒株的病毒滴度（2.6×105 PFU·mL-1）。

2.2" SLMECs的IF分析

IF檢測結(jié)果顯示，CD31抗體經(jīng) 1∶200 稀釋后能檢測到強(qiáng)的綠色熒光信號（圖2），這一結(jié)果表明SLMECs純度達(dá)到90%以上。

2.3" BTV-1在SLMECs的增殖特性

BTV-1感染SLMECs后，顯微鏡觀察，試驗組24 h后開始出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變（CPE），而對照組未出現(xiàn)CPE（圖3A）。BTV-1 感染后試驗感染組和對照組細(xì)胞樣品通過 RT-PCR 擴(kuò)增 BTV VP7基因，電泳結(jié)果顯示，對照組樣品未出現(xiàn)目的電泳條帶，而在試驗組不同時間點(diǎn)的樣品出現(xiàn)了預(yù)期大小特異的目的條帶（圖3B）。PCR 產(chǎn)物經(jīng)測序比對為BTV-1 VP7 基因，說明BTV-1可以在SLMECs細(xì)胞中復(fù)制增殖。

A. BTV-1誘導(dǎo)后SLMECs的形態(tài)變化；B. RT-PCR分析BTV-1 VP7 基因；M. DNA 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～3. BTV感染后VP7基因擴(kuò)增產(chǎn)物；4～6.對照組VP7基因擴(kuò)增產(chǎn)物

A. Morphological changes of SLMECs infected by BTV-1；B. RT-PCR analysis VP7 gene of BTV-1; M. DL 2000 marker; 1-3. PCR production of VP7 gene infected BTV-1；4-6. PCR production of VP7 gene in the control group

2.4" BTV-1誘導(dǎo)對干擾素通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

以1 MOI BTV誘導(dǎo)18、24和36 h的SLMECs試驗組和對照組SLMECs（Control）cDNA為模板，以β-Actin（內(nèi)參基因）、RIG-I、VISA、TBK1、IKKε、MDA5、TRAF3、TRAF6、IFN-α、IFN-β、USP18基因引物進(jìn)行qRT-PCR分析。結(jié)果顯示：Control組與18、24和36 h誘導(dǎo)組細(xì)胞結(jié)果比較，RIG-I在BTV誘導(dǎo)18、24 h時表達(dá)水平明顯下調(diào)（Plt;0.001，Plt;0.01），但在36 h時明顯上調(diào)，差異極顯著（Plt;0.001）；MDA5、IKKε、IFN-β、TBK1和TRAF6基因在BTV誘導(dǎo)18、24 h后mRNA表達(dá)水平上調(diào)，其中MDA5和IFN-β差異極顯著（Plt;0.01或Plt;0.001），TRAF6差異不顯著（Pgt;0.05），36 h時表達(dá)水平除了MDA5都顯著下調(diào)（Plt;0.05，或Plt;0.01，或Plt;0.001），MDA5表達(dá)水平顯著上調(diào)，差異極顯著（Plt;0.001），TBK1差異顯著（Plt;0.05）；IFN-α、VISA、USP18基因在BTV誘導(dǎo)18、24和36 h后mRNA表達(dá)水平下調(diào)，USP18差異極顯著（Plt;0.01），IFN-α和VISA在24～36 h時差異顯著（Plt;0.05）或極顯著（Plt;0.01）；TRAF3在BTV誘導(dǎo)18 h時下調(diào)（Plt;0.05），在24和36 h上調(diào)，36 h時差異顯著（Plt;0.05）（圖4）。

2.5" BTV-1誘導(dǎo)的BTV-NS4、MDA5、TRAF3、RIG-I和 TBK1的蛋白表達(dá)的影響

對BTV誘導(dǎo)18、24及36 h的細(xì)胞樣品用BTV-NS4、MDA5、TRAF3、RIG-I、TBK1、β-Actin（內(nèi)參）抗體進(jìn)行Western blot。結(jié)果表明，與對照組相比，BTV-NS4在BTV誘導(dǎo)18、24、36 h后蛋白表達(dá)水平上調(diào)，差異極顯著（Plt;0.001）；RIG-I蛋白在24、36 h后上調(diào)表達(dá)，差異極顯著（Plt;0.01，Plt;0.001）；TRAF3蛋白在24 h時下調(diào)表達(dá)，差異不顯著（Pgt;0.05），而BTV誘導(dǎo)18、36 h后蛋白表達(dá)水平上調(diào)，差異極顯著（Plt;0.001）；MDA5、TBK1蛋白在BTV誘導(dǎo)18、24 h時上調(diào)表達(dá)，差異極顯著（Plt;0.01或Plt;0.001），而在36 h時兩者都下調(diào)表達(dá)，差異極顯著（Plt;0.001）（圖5）。上述結(jié)果表明，BTV誘導(dǎo)SLMECs不同時間內(nèi)對TRAF3、RIG-I、MDA5和TBK1蛋白呈上調(diào)表達(dá)。

3" 討" 論

本文探究藍(lán)舌病病毒感染是否對SLMECs中Ⅰ型IFN表達(dá)和信號通路產(chǎn)生影響。研究表明，BTV感染多種細(xì)胞誘導(dǎo)強(qiáng)烈的Ⅰ型IFN效應(yīng)，如BTV-1 在感染PST細(xì)胞后能顯著誘導(dǎo)干擾素刺激基因1（interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1，IFIT1）的轉(zhuǎn)錄及其蛋白表達(dá)［18-20］。在非造血細(xì)胞中，BTV誘導(dǎo)IFN-β基因的表達(dá)依賴于RNA解旋酶RIG-I和MDA5的激活，BTV感染還會觸發(fā)A549細(xì)胞中IFN刺激基因（ISGs）的表達(dá)［21］。而BTV-16的RNA與巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR3結(jié)合后，可活化下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而上調(diào)細(xì)胞內(nèi)IFN-Ⅰ的表達(dá)［22］。目前認(rèn)為，BTV在綿羊細(xì)胞中可變復(fù)制動力學(xué)主要通過消除細(xì)胞IFN-Ⅰ反應(yīng)而被消除［23］。本研究發(fā)現(xiàn)BTV-1可在SLMECs中復(fù)制增殖，BTV誘導(dǎo)試驗表明在SLMECs中MDA5、IFN-α、TRAF3、IFN-β、TBK1基因mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，而感染24 h后，IFN-β、IKKε、TRAF6、USP18基因的mRNA表達(dá)水平下調(diào)，表明在BTV病毒感染早期誘導(dǎo)SLMECs內(nèi)IFN-Ⅰ干擾素免疫應(yīng)答，在感染后36 h時IFN-Ⅰ干擾素免疫應(yīng)答通路中IFN-β、TRAF6、USP18基因的下調(diào)表達(dá)而促進(jìn)BTV-1在SLMECs中復(fù)制增殖。

天然免疫是機(jī)體抵抗病毒感染的第一道防線，宿主細(xì)胞為了應(yīng)對各種病原體的感染而表達(dá)分泌不同類型的 IFN而增強(qiáng)宿主的抗病毒應(yīng)答反應(yīng)［24］。研究表明，BTV感染宿主細(xì)胞后可通過NS3/NS4拮抗細(xì)胞內(nèi)IFN信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而抑制IFN-Ⅰ的產(chǎn)生，其中NS3作為拮抗宿主細(xì)胞反應(yīng)的病毒蛋白，而NS4蛋白在BTV逃逸宿主天然免疫的過程中發(fā)揮重要作用，如顯著抑制IFN-β啟動子活性，BTV NS3和NS4協(xié)同靶向STAT1的SH2結(jié)構(gòu)域，抑制其磷酸化、異二聚化、核易位以及JAK-STAT通路下游基因的激活及STAT1磷酸化［20，25-30］。本研究發(fā)現(xiàn)BTV-1感染SLMECs，干擾素信號通路蛋白MDA5、TRAF3、RIG-I和 TBK1蛋白都上調(diào)表達(dá)，表明BTV-1感染誘導(dǎo)IFN-Ⅰ信號通路基因在蛋白水平的表達(dá)；揭示BTV-1感染宿主細(xì)胞后，病毒dsRNA被病原體模式識別受體（pathogen associated molecule patterns，PAMPs）識別（如RIG-I、MDA5和cGAS），進(jìn)一步激活后結(jié)合IPS-1（也稱MAVS）蛋白形成RIG-I/MDA5-IPS-1復(fù)合物，觸發(fā)MAVS-TBK1-IRF3等信號通路，使磷酸化的IRF3 （p-IRF3）易位到細(xì)胞核中，誘導(dǎo)IFN-Ⅰ（如IFN-α和IFN-β）基因的轉(zhuǎn)錄抗BTV免疫應(yīng)答。

研究表明，環(huán)狀GMP-AMP （cGAMP）合成酶（cGAS）與dsDNA結(jié)合后，招募ATP和GTP生成cGAMP，作為第二信使，cGAS從基因組DNA損傷中識別出胞質(zhì)病原體衍生的DNA（例如病毒DNA）或自身DNA，然后激活STING，被激活的STING招募TBK1磷酸化IRF3而調(diào)控IFN-β的產(chǎn)生［31］。有研究通過293T細(xì)胞結(jié)合重組試驗發(fā)現(xiàn)MAVS通過TRAFs-TBK1/IKKε復(fù)合物招募TBK1/IKKε再通過磷酸化使TBK1/IKε活化，其中TBK1/IKKε對IRF3的磷酸化是誘導(dǎo)IFN-Ⅰ響應(yīng)病毒感染的關(guān)鍵［32］。TRAF3作為NF-κB信號通路的負(fù)調(diào)控因子可抑制NF-κB信號通路及凋亡產(chǎn)物的表達(dá)［33］。TBK1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白，其在哺乳動物中高度保守，屬于非經(jīng)典的IκB激酶（IKK）家族，包括IKKε和TBK1［32-35］。本研究中，BTV-1誘導(dǎo)SLMECs MDA5、TBK1、TRAF3和RIG-I蛋白表達(dá)呈上調(diào)趨勢，表明這四個蛋白在BTV誘導(dǎo)SLMECs抗病毒免疫中具有重要作用，但SLMECs抗病毒活性與病毒侵襲力之間的關(guān)系及與BTV病毒dsRNA識別及其IFN信號通路蛋白分子調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究，以深入揭示BTV感染與宿主細(xì)胞IFN-Ⅰ信號通路關(guān)鍵調(diào)控蛋白間分子機(jī)制，為BTV感染、致病機(jī)理及其防控策略提供基礎(chǔ)。

4" 結(jié)" 論

本研究通過BTV-1誘導(dǎo)SLMECs，發(fā)現(xiàn)RIG-I、MDA5、IKKε、IFN-β、TBK1和TRAF6基因mRNA上調(diào)表達(dá)，IFN-α、VISA、USP18基因mRNA下調(diào)表達(dá)；在蛋白水平上 MDA5、TBK1、RIG-I和TRAF3蛋白呈上調(diào)表達(dá)，說明BTV感染SLMECs后，激活宿主細(xì)胞Ⅰ型干擾素通路基因的表達(dá)，在不同時間段表達(dá)水平不同，表明BTV感染和宿主細(xì)胞抗病毒免疫應(yīng)答及其病毒蛋白拮抗宿主免疫應(yīng)答間的復(fù)雜關(guān)系，為進(jìn)一步探究BTV感染與宿主細(xì)胞抗病毒免疫應(yīng)答機(jī)制提供參考。

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（編輯" 白永平）