摘" 要： 為了解綿羊源哺乳動物正呼腸孤病毒（mammalian orthoreovirus， MRV）的生物學(xué)特性及全基因組特征，本研究從綿羊腹瀉病料中分離了一株MRV，命名為MRV-XJ23株，經(jīng)RT-PCR、電鏡觀察和間接免疫熒光試驗（IFA）鑒定后，擴(kuò)增病毒全基因組進(jìn)行同源性及遺傳進(jìn)化分析。研究結(jié)果表明，MRV-XJ23分離株可在MDBK細(xì)胞穩(wěn)定傳代，產(chǎn)生特異的細(xì)胞病變，病毒滴度為106 TCID50·mL-1。MRV感染細(xì)胞經(jīng)IFA檢測可觀察到特異熒光，電鏡可觀察到直徑約70 nm的無囊膜病毒粒子。經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增和測序獲得MRV全基因組，該毒株共10個節(jié)段，全長23 534 bp。序列對比及遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，MRV-XJ23株為MRV-1血清型，其在韓國蝙蝠源BatMRV2/SNU1/Korea/2021毒株基礎(chǔ)上，與日本的人源Homo sapiens/Osaka2005株L3、M2、S4基因、印度牛源C/bovine/Indiana/MRV00304/2014株S1基因重配，形成一株新的MRV。本研究首次從腹瀉綿羊肛拭子中分離獲得一株MRV-1型重配毒株，證明綿羊可感染MRV，拓寬了病毒感染宿主譜，且感染毒株為蝙蝠源、人源和牛源MRV重配毒株，證明這些毒株跨物種感染后發(fā)生了復(fù)雜的重配。本研究揭示了MRV在各物種中循環(huán)傳播對公共衛(wèi)生的風(fēng)險，提升了深入研究MRV在綿羊乃至家畜中的流行病學(xué)、重配規(guī)律和致病性的重要性。

關(guān)鍵詞： 哺乳動物正呼腸孤病毒；綿羊；分離鑒定；重配；進(jìn)化分析

中圖分類號： S852.659.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）12-5641-10

doi： 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.12.027

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

收稿日期：2024-02-04

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（2023YFD1801302）；江蘇省重點研發(fā)計劃（BE2022330）；獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室開放基金（SKLVBF202106）

作者簡介：李" 霞（1999-），女，四川三臺人，碩士生，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究，E-mail：2858768331@qq.com

*通信作者：索朗斯珠，主要從事高原動物傳染病疫病防控研究，E-mail：xzslsz@163.com; 毛" 立，主要從事牛羊病毒病研究，E-mail： mao-li@live.cn

Isolation， Identification and Whole Genome Analysis of Mammalian Orthoreovirus from Sheep

LI" Xia1， 2， HE" Yi3， CAI" Xuhang2， 4， LUO" Runbo1， GUO" Rongli2， SUOLANG" Sizhu1*， MAO" Li1， 2*， LI" Bin1， 2

（1.Tibet Agricultural and Animal Husbandry University， Linzhi 860000，" China;

2.Institute of Veterinary Medicine， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Engineering Technology of Veterinary Biological Products， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Nanjing 210014，" China;

3.Chengguan Agriculture （Animal Husbandry） Development Service Center of Fukang City， Fukang 831500， China;

4.Northwest Aamp;F University， Xianyang 712100， China）

Abstract：" In order to understand the biological and genome characteristics of mammalian orthoreovirus （MRV） from sheep， a MRV strain named MRV-XJ23 was isolated from sheep suffering diarrhea， and identified by RT-PCR， electron microscopy and indirect immunofluorescence assay （IFA）， respectively. The whole genome of the isolated strain was amplified by RT-PCR and the homology and genetic evolution were analyzed further. The results showed that the MRV-XJ23 strain cultured stably in MDBK cells and performed specific cytopathic effect with a virus titer of 106 TCID50·mL-1. Specific fluorescence was observed in MRV-infected MDBK cells by IFA detection， and electron microscope detection showed that the virus was purified by ultracentrifugation with a diameter of about 70 nm. The whole MRV genome was obtained by RT-PCR， MRV-XJ23 contained 10 segments with the length of 23 534 bp. Nucleotide sequence alignments and genetic evolution analysis showed that the MRV-XJ23 isolate was belonged to MRV-1 serotype. Results of sequence and phylogenetic trees indicate that the novel MRV isolate was a novel reassortant among three MRV strains of BatMRV2/SNU1/Korea/2021， C/bovine/Indiana/MRV00304/2014 strain and Homo sapiens/Osaka2005. In this study， a reassorting strain of MRV-1 type originated from sheep was isolated and identified for the first time， which proved important evidence that sheep could be infected with MRV and broadened the host species. Moreover， the reassortant strain was derived from bat， bovine and homo sapiens-MRV， which indicated that these strains were infected the new host and reassortment was present after possible cross-species infection. This study revealed the risk of MRV transmission circle in various species to public health， and the importance to study the epidemiology， reassortment and pathogenicity of MRV in sheep and even livestock.

Key words： mammalian orthoreovirus; sheep; isolation and identification; reassortment; evolutionary analysis

*Corresponding authors：" SUOLANG Sizhu， E-mail：xzslsz@163.com; MAO Li， E-mail： mao-li@live.cn

哺乳動物正呼腸孤病毒（mammalian orthoreovirus，MRV）屬于呼腸病毒科（Reoviridae）棘突呼腸病毒亞科（Spinareovirinae），可感染人、豬、牛、羊、貓、犬、猴、水貂、小鼠與蝙蝠等多種哺乳動物［1-4］。MRV由分節(jié)段的10個基因片段組成，約23 500 bp，包括L1～L3三個大片段、M1～M3三個中片段和S1～S4四個小片段。S1基因編碼σ1和σ1s兩個蛋白，σ1為結(jié)構(gòu)蛋白，決定MRV的血清型，與受體結(jié)合、組織嗜性以及血凝反應(yīng)密切相關(guān)。根據(jù)中和試驗和血凝抑制試驗的結(jié)果，MRV分為4種血清型，代表株分別為Lang-T1L（MRV-1）、Jones-T2J（MRV-2）、Dearing-T2D（MRV-3）與Ndelle-T4N（MRV-4）［5］。由于不同血清型的MRV在S1基因編碼的σ1蛋白中包含特定的氨基酸插入和缺失，導(dǎo)致不同血清型的MRV S1序列相似性較低，因此也可采用S1基因序列通過進(jìn)化分析進(jìn)行基因分型，其結(jié)果與中和試驗和血凝抑制試驗分型結(jié)果一致［6-8］。

MRV可引起輕度的腸胃炎和不同程度的呼吸道疾病，在馬來西亞急性呼吸道感染患者中發(fā)現(xiàn)了MRV，表明MRV存在人與人之間互相傳播的潛在可能［8-10］。在豬群中，MRV2或MRV3是亞洲、歐洲和北美部分豬腹瀉、發(fā)燒和呼吸道疾病的病原［3，11-13］。與腸道和呼吸道疾病相比，MRV引起的神經(jīng)性疾病相對較少，但在歐洲和美國，少數(shù)病例記錄了人感染MRV2或MRV3后引起壞死性腦病和腦膜炎［2，6］。此外也發(fā)現(xiàn)，MRV1和MRV3都可通過不同途徑感染小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)［14-15］。以上證據(jù)表明，MRV可能導(dǎo)致除輕度腸胃炎和呼吸道疾病以外更嚴(yán)重的疾病。

國內(nèi)暫無羊源MRV分離和鑒定的報道，本文從綿羊肛拭子中分離到一株MRV毒株，通過對分離株的全基因組序列進(jìn)行同源性及遺傳進(jìn)化分析，為我國MRV毒株的感染宿主譜、遺傳多樣性、致病性研究及其相應(yīng)診斷方法的建立等奠定了基礎(chǔ)。

1" 材料與方法

1.1" 樣品

2023年6月，從新疆維吾爾自治區(qū)哈密地區(qū)采集的腹瀉綿羊肛拭子，凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2" 主要材料及試劑

牛腎細(xì)胞（MDBK）保存于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，DMEM購自上海源培生物科技股份有限公司，胎牛血清、Trans5α感受態(tài)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄酶、Green Taq Mix均購自南京諾唯贊生物科技有限公司，瓊脂糖購自北京擎科生物科技有限公司，pMD-19T購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3" 病毒的分離及培養(yǎng)

將樣品用無菌PBS稀釋后，12 000 r·min-1離心10 min，取上清用0.22 μm濾器過濾，將濾液接種于生長密度為80%的單層MDBK細(xì)胞，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h后，加入維持液。每天觀察細(xì)胞病變情況，5 d后收取細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次，按照上述操作盲傳3代。

1.4" 分離物RT-PCR擴(kuò)增

以MRV L1基因為靶基因［16］，合成MRV特異性檢測引物（MRV-F/R，表1），引物由擎科生物股份有限公司（南京）合成。

參照說明書提取總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，cDNA凍存于-80 ℃冰箱備用。取2 μL cDNA為模板，以MRV L1基因特異性引物MRV-F和MRV-R進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)完成后，取10 μL PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將目的片段切膠并送至擎科生物股份有限公司（南京）測序。

1.5" 病毒電鏡觀察

取70 mL病毒培養(yǎng)液反復(fù)凍融三次，10 000 r·min-1離心30 min；將上清液轉(zhuǎn)入超速離心管中，30 000 g離心30 min；將上清液轉(zhuǎn)入新的超速離心管中120 000 g離心2 h，棄上清，用電鏡固定液重懸沉淀，經(jīng)磷鎢酸負(fù)染后進(jìn)行電鏡觀察。

1.6" 間接免疫熒光試驗（indirect immunofluorescence assay，IFA）

將MRV病毒液和培養(yǎng)液按照1∶10比例接種于單層MDBK細(xì)胞中，同時設(shè)置MDBK細(xì)胞作為空白對照，培養(yǎng)48～72 h后，70%細(xì)胞出現(xiàn)明顯CPE且未完全脫落時，棄上清，用PBST洗滌3次，加入100 μL 4%多聚甲醛固定液室溫固定30 min后棄固定液，PBST洗滌3次；加100 μL 1%的BSA置于37℃封閉1 h后，PBST洗滌3次；加入100 μL本實驗室制備的MRV兔多抗37 ℃孵育1 h后，用PBST洗滌3次；加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，37℃避光作用1 h，PBST洗滌3次后，置于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.7" MRV分離株基因組的擴(kuò)增

參照文獻(xiàn)［17］中引物序列設(shè)計并合成10對引物（L1～S4，表1），擴(kuò)增MRV分離株全基因組，PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收，連接至pMD19-T載體轉(zhuǎn)化入Trans5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)鑒定后，將陽性菌液送擎科生物股份有限公司（南京）測序，每個片段測序3次。

1.8" MRV S1基因序列同源性分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

利用DNAStar軟件中的SeqMan進(jìn)行序列拼接，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST在線工具（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）分析與該分離株各基因節(jié)段核苷酸序列同源性較高的毒株（表2），使用MEGA11軟件的鄰接法（Neighbor-Joining）繪制各基因節(jié)段的遺傳進(jìn)化樹并分析各節(jié)段來源。

2" 結(jié)" 果

2.1" 病毒分離培養(yǎng)

將腹瀉綿羊肛拭子處理后接種MDBK細(xì)胞，接毒后72 h觀察到明顯的細(xì)胞病變，部分細(xì)胞皺縮變圓、聚集、脫落，陰性對照組細(xì)胞未出現(xiàn)病變。連續(xù)傳代至第3代時，收獲病毒液，成功分離獲得1株MRV毒株，命名為MRV-XJ23，檢測病毒滴度為106 TCID50·mL-1。

2.2" MRV分離株RT-PCR鑒定

利用靶向MRV L1基因的特異性引物MRV-F和MRV-R對分離培養(yǎng)物核酸進(jìn)行RT-PCR檢測，經(jīng)電泳檢測獲得約559 bp的片段，與預(yù)期片段大小一致（圖略）。產(chǎn)物測序后經(jīng)BLAST比對分析其為MRV L1基因，證明成功分離獲得了國內(nèi)首株綿羊源MRV。

2.3" 病毒粒子形態(tài)觀察

通過超速離心純化病毒后，用磷鎢酸進(jìn)行負(fù)染，經(jīng)透射電鏡可觀察到直徑約70～80 nm、無囊膜的球形對稱結(jié)構(gòu)病毒粒子（圖1），與MRV典型形態(tài)特征相符。

2.4" 間接免疫熒光檢測MRV

MRV-XJ23株感染的MDBK細(xì)胞可觀察到特異綠色熒光（圖2A），而MDBK細(xì)胞陰性對照則無熒光（圖2B），進(jìn)一步說明成功分離到了綿羊源MRV。

2.5" MRV-XJ23分離株S1基因的分子特征

S1基因編碼的б1蛋白決定MRV的血清型，序列比對分析顯示MRV-XJ23株與MRV-1型毒株的序列相似度最高，基因相似性在73.23%～94.56%之間。MRV S1基因進(jìn)化分析表明，MRV毒株的4種血清型分別形成獨立的進(jìn)化分支，MRV-XJ23分離株與水貂、牛和豬中分離的MRV-1型分離株處于同一進(jìn)化分支，在遺傳進(jìn)化樹上歸集為一簇（圖3），且與印度水牛中分離的C/bovine/Indiana/MRV00304/2014毒株親緣關(guān)系最近，說明MRV-XJ23分離株為MRV-1血清型。

2.6" MRV-XJ23分離株全基因組擴(kuò)增和序列分析

用10對引物分段擴(kuò)增綿羊源MRV-XJ23分離株基因組，全長為23 534 bp，共10個節(jié)段，分別為L1 3 854 bp（1 267 aa）、L2 3 915 bp（1 289 aa）、L3 3 901 bp（1 275 aa）、M1 2 304 bp（736 aa）、M2 2 203 bp（708 aa）、M3 2 166 bp（721 aa）、S1 1 466 bp（471 aa）、S2 1 331 bp（418 aa）、S3 1 198 bp（366 aa）、S4 1 196 bp（365 aa），將序列上傳至GenBank， 獲得登錄號為PP235840～PP235849。分離毒株與參考毒株的核苷酸序列相似性在48.10%至99.14%之間，氨基酸序列相似性則處于25.30%～99.77%。

序列分析顯示，MRV-XJ23株的L1、L2、M1、M3、S2和S3基因片段與蝙蝠源MRV-2型BatMRV2/SNU1/Korea/2021毒株核苷酸相似性為98.15%～99.14%，均超過98%；氨基酸相似性為98.36%～99.77%，均超過98%。L3、M2和S4基因片段與人源MRV-2型Homo sapiens/Osaka2005毒株核苷酸序列相似性為98.41%～98.55%，均超過98%；氨基酸相似性為99.18%～99.72%，均超過99%。而MRV-XJ23株S1基因片段與牛源的MRV-1型C/bovine/Indiana/MRV00304/2014毒株核苷酸序列相似性為94.56%，氨基酸序列相似性為96.39%，C/bovine/Indiana/MRV00304/2014毒株S1基因可能是

MRV-XJ23株S1基因來源?；蜻M(jìn)化分析也顯示，MRV-XJ23株 L1、L2、M1、M3、S2和S3基因片段與蝙蝠源的MRV-2型BatMRV2/SNU1/Korea/2021毒株位于同一進(jìn)化分支，而MRV-XJ23株L3、M2、S4基因與人源MRV毒株Homo sapiens/Osaka2005基因具有更高的相似性，進(jìn)化關(guān)系更近（圖4）。其S1基因片段則與牛源的MRV-1型C/bovine/Indiana/MRV00304/2014毒株S1基因位于同一分支（圖3）。以上研究表明，MRV-XJ23分離株是在BatMRV2/SNU1/Korea/2021毒株基礎(chǔ)上，與人源MRV毒株Homo sapiens/Osaka2005毒株L3、M2、S4基因、C/bovine/Indiana/MRV00304/2014毒株的S1基因片段發(fā)生重配，形成新的MRV-XJ23株（圖5）。

3" 討" 論

由于MRV基因組分節(jié)段的特性，不同MRV毒株間極易發(fā)生重組。在田鼠、鷓鴣、蝙蝠和小牛等不同動物物種中均發(fā)現(xiàn)了重組MRV毒株［18-20］，根據(jù)序列和系統(tǒng)發(fā)育分析的研究表明，這些重組MRV的基因片段可能來自不同的宿主。當(dāng)MRV的多個毒株感染同一宿主時，分節(jié)段的MRV會出現(xiàn)重組和重配，產(chǎn)生新的毒株。這種重組和重配促進(jìn)了病毒的進(jìn)化和跨物種傳播，而重組病毒的致病力差異較大，不同重組和重配模式很可能影響病毒致病性。目前，有關(guān)MRV的重組和重配的具體機制仍不是非常明確，但重組和重配現(xiàn)象的發(fā)生勢必會改變病毒的諸多特性，從而對我國MRV疫情防控造成巨大挑戰(zhàn)。

我國云南、四川、上海、北京、廣東等地區(qū)均有MRV流行，目前已相繼從水貂、豬、樹鼩、蝙蝠、果子貍和牦牛等宿主中分離出MRV-1型病毒，但國內(nèi)暫無綿羊源MRV分離的報道［21-25］。本研究從腹瀉綿羊肛拭子中成功分離到一株MRV-1型毒株，這是國內(nèi)首次分離到的綿羊源MRV，并成功獲得了MRV-XJ23分離株的完整基因組，拓寬了MRV感染的宿主譜。各節(jié)段的序列同源性分析顯示，MRV-XJ23株與BatMRV2/SNU1/Korea/2021、Homo sapiens/Osaka2005和Mink/China/SD-14/2015的氨基酸相似性均較高，除S1蛋白外，均可達(dá)95%以上，但基因序列同源性和進(jìn)化分析都表明，該分離株可能是在韓國蝙蝠源BatMRV2/SNU1/Korea/2021毒株基礎(chǔ)上，與日本人源Homo sapiens/Osaka2005毒株、印度牛源C/bovine/Indiana/MRV00304/2014毒株發(fā)生基因重配，形成了一株全新的毒株，與現(xiàn)有毒株基因組均不相同。且該重配毒株在傳播過程發(fā)生了變異，基因片段與現(xiàn)有MRV參考毒株存在0.86%～5.44%差異，特別是S1基因，與現(xiàn)有毒株的基因序列和氨基酸序列相似性分別只有94.56%和96.39%。MRV-XJ23毒株L1～L3、M1～M3、S2～S4基因與國內(nèi)部分參考毒株相似性高達(dá)95%及其以上，但S1基因僅與國內(nèi)豬源SHR-A毒株（JX415469.1）的S1基因相似性在90%以上，提示了MRV跨國傳播及野生動物病毒跨物種傳播的風(fēng)險，對我國邊境地區(qū)、海關(guān)的動物疫病防控及公共衛(wèi)生提出了新的挑戰(zhàn)。

截至2022年末，新疆羊的存欄量及羊肉的產(chǎn)量均居全國第二［26］。本研究表明新疆地區(qū)羊群中可能存在MRV感染，但目前小反芻動物MRV流行情況的數(shù)據(jù)處于空白。且MRV的重組和重配可能加大監(jiān)測難度，新的毒株也有致病性改變的潛在可能，對養(yǎng)羊業(yè)健康發(fā)展造成威脅。MRV宿主譜廣，可感染多數(shù)哺乳動物，可能與其它家畜交叉感染，更加提示了MRV科學(xué)防控的重要性。

4" 結(jié)" 論

本研究從新疆腹瀉綿羊肛拭子中分離出國內(nèi)首株綿羊源MRV毒株，并對其生物學(xué)特性和全基因組序列進(jìn)行分析，該毒株可能是韓國蝙蝠源BatMRV2/SNU1/Korea/2021毒株、日本人源Homo sapiens/Osaka2005毒株與印度牛源C/bovine/Indiana/MRV00304/2014毒株重配形成，該毒株的發(fā)現(xiàn)提示了MRV跨國傳播及野生動物病毒跨物種傳播的風(fēng)險，為我國MRV毒株的感染宿主譜、遺傳多樣性、致病性研究及其相應(yīng)診斷方法的建立等奠定了基礎(chǔ)。

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（編輯" 白永平）