摘" 要： 為探究湖北荊州某生豬養(yǎng)殖企業(yè)育肥豬呼吸道疾病的致病原，采集病豬肺組織進(jìn)行病原的篩查和分離鑒定。本研究對(duì)分離菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化、16S rDNA基因序列測(cè)定、血清型分型、多位點(diǎn)序列分析、藥物敏感性試驗(yàn)、耐藥基因測(cè)序分析以及動(dòng)物致病性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，分離菌株P(guān)m0525為革蘭陰性短桿菌；生化試驗(yàn)、PCR和16S rDNA測(cè)序鑒定為多殺性巴氏桿菌。該菌為莢膜血清型A型，分子分型為ST201型，與ST1615型聚為一支；分離菌株對(duì)慶大霉素、卡那霉素、麥迪霉素等13種抗生素敏感，對(duì)氯霉素、克林霉素、頭孢呋辛、頭孢他啶和四環(huán)素耐藥；分離菌株具有中等生物被膜形成能力，攜帶SulⅠ、SulⅡ、tetA和bla-TEM四種耐藥基因，可通過產(chǎn)金屬 β-內(nèi)酰胺酶（MBL）方式發(fā)揮抗β-內(nèi)酰胺類抗生素的作用。中藥藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，該分離菌株對(duì)中藥黃連呈現(xiàn)明顯的敏感性。該分離株攜帶18種毒力基因，并對(duì)小鼠具有較強(qiáng)的致病性。本研究系統(tǒng)性分析了豬源多殺性巴氏桿菌的血清型、分子分型、藥物敏感性和致病性，為進(jìn)一步研究多殺性巴氏桿菌感染的致病機(jī)制、防控和精準(zhǔn)施治提供科學(xué)依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。

關(guān)鍵詞： 多殺性巴氏桿菌；金屬 β-內(nèi)酰胺酶；MLST分析；耐藥性；致病性

中圖分類號(hào)：S852.61

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）12-5692-14

doi： 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.12.032

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

收稿日期：2024-01-26

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技部“十四五”重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2021YFD1800405）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（32072823）

作者簡(jiǎn)介：楊榮榮（2001-），女，陜西寶雞人，碩士生，主要從事多殺性巴氏桿菌相關(guān)研究， E-mail：yangrr0702@163.com

*通信作者：張付賢，主要從事獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)研究， E-mail：zhangfuxian99@163.com

Analysis of Drug Resistance and Pathogenicity of Metallo-β-Lactamase-producing

Porcine ST201 Pasteurella multocida

YANG Rongrong1， ZHANG" Ting1， TANG Pingping2， HE Shuangfang3， ZHAO Miaomiao1， LEI Liancheng1，4， ZHANG" Fuxian1*

（1.College of Animal Science and Technology， Yangtze University， Jingzhou 434023，" China;

2.Qianjiang Bureau of Agriculture and Rural Affairs， Qianjiang 433199，" China;

3.Zhangjin Town for Animal Husbandry and Veterinary Technical Service， Qianjiang 433140，" China;

4.College of Veterinary Medicine， Jilin University， Changchun 130062，" China）

Abstract：" The study was design to investigate the pathogenic agents of respiratory tract diseases of fattening pigs in a pig breeding enterprise in Jingzhou， Hubei Province. The pathogen was screened and isolated from the diseased pig lung tissue. Morphological observation， physiological and biochemical analysis， 16S rDNA gene sequence， serotype typing， multilocus sequence typing， drug sensitivity test， drug resistance gene sequencing analysis and animal pathogenicity test were performed for the isolated strains. The results showed that the isolated strain Pm0525 was Gram-negative brevibacterium. It was identified as Pasteurella multocida by biochemical assay， PCR and 16S rDNA sequence analysis. The isolated strain was identified as Pasteurella multocida type A. Multilocus sequence typing analysis confirmed that the isolated strain is type ST201 and merged with type ST1615. The isolated strain was sensitive 13 kinds of antibiotics， such as gentamicin， kanamycin and medemycin， and resistant to chloramphenicol， clindamycin， cefuroxime， ceftazidime and tetracycline. The isolated strain showed moderate biofilm formation ability， carrying out four resistance genes， SulⅠ， SulⅡ， tetA and bla-TEM. The isolated strain may play the role of anti-β-lactam antibiotics by producing metal-beta-lactamase （MBL）. In addition， traditional Chinese medicine Coptis had obvious inhibitory effect on the isolated strain in vitro. The isolated strain carried 18 virulence genes， and showed strong pathogenicity to mice. This study systematically analyzed the serotype， molecular typing， drug sensitivity and pathogenicity of swine Pasteurella multocida， providing scientific basis and data reference for further research on the transmission， prevention and precise treatment of Pasteurella infection.

Key words： Pasteurella multocida; metallo-beta-lactamase; MLST analysis; drug resistance; pathogenicity

*Corresponding author：" ZHANG Fuxian，E-mail：zhangfuxian99@163.com

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）作為一種重要的人獸共患革蘭陰性病原菌，廣泛存在于全世界大部分地區(qū)，可引起包括人在內(nèi)的多種動(dòng)物的呼吸道疾病和出血性疾?。?-2］。Pm感染造成的損失和危害仍然是困擾公共安全和畜禽養(yǎng)殖業(yè)的主要問題之一。多殺性巴氏桿菌莢膜血清型眾多，不同血清型之間的交叉保護(hù)力差異顯著，且不同血清型引起動(dòng)物的臨床癥狀也不盡相同。Pm罕見的莢膜型的出現(xiàn)以及可能存在莢膜型的轉(zhuǎn)變和跨種傳播問題，引發(fā)廣泛關(guān)注［3］。多殺性巴氏桿菌病的病型、致病性、宿主特異性和免疫性等，均與其血清型密切相關(guān)。Pm通常依據(jù)菌株攜帶毒力因子的血清學(xué)反應(yīng)差異進(jìn)行分型。根據(jù)Pm莢膜抗原與血清發(fā)生的被動(dòng)凝集試驗(yàn)，可分為A、B、D、E和F 5種莢膜血清型［4-5］；基于Pm脂多糖的差異性，利用瓊擴(kuò)試驗(yàn)可將Pm分為16種血清型［6-7］；多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST）是近年來發(fā)展很快的分子生物學(xué)分析方法，也常被用于Pm的分子分型和溯源分析［8］。近年來由于抗生素的濫用，造成臨床致病菌對(duì)抗生素的耐藥情況日趨嚴(yán)重，而產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrum β-lactamases，ESBLs）和金屬β-內(nèi)酰胺酶（metallo-β-lactamases，MBLs）細(xì)菌一直是臨床上公認(rèn)的多重耐藥病原體。其中產(chǎn)ESBLs和MBLs是導(dǎo)致細(xì)菌耐β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的主要機(jī)制之一，使細(xì)菌對(duì)大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥性。Pm菌株的流行病學(xué)調(diào)查、溯源、血清型和耐藥性分析等生物學(xué)特性研究是探索Pm感染多個(gè)宿主致病機(jī)制的有效途徑。

豬是巴氏桿菌病的自然宿主，感染后引起豬巴氏桿菌肺炎和傳染性萎縮性鼻炎等急性流行性或散發(fā)性和繼發(fā)性傳染病，危害嚴(yán)重［9-10］。本研究從患呼吸道疾病豬肺組織中分離到一株P(guān)m，經(jīng)鑒定為莢膜A型多殺性巴氏桿菌，MLST為ST201型。對(duì)分離菌株進(jìn)行致病性試驗(yàn)、耐藥基因測(cè)序分析和抗生素、中藥敏感性試驗(yàn)，以期為豬源多殺性巴氏桿菌的溯源、流行病學(xué)調(diào)查和巴氏桿菌病的防控以及藥物精準(zhǔn)施治提供參考依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1" 病料來源

湖北省荊州市某生豬養(yǎng)殖企業(yè)育肥豬出現(xiàn)減食、體溫升高、咳嗽、鼻孔有黏性分泌物和呼吸困難等臨床癥狀，抗生素治療后病情好轉(zhuǎn)，但時(shí)有反復(fù)。剖檢病死豬的肺、淋巴結(jié)和鼻咽拭子進(jìn)行病原的篩查以及細(xì)菌的分離培養(yǎng)。

1.2" 培養(yǎng)基與試劑

TSA和TSB購買自青島海博生物科技有限公司；革蘭染色劑和四季青新生牛血清購自北京索萊寶科技有限公司；藥敏紙片和細(xì)菌生化微量鑒定管購買自杭州微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒，病毒基因組提取試劑盒，購自北京天根生物科技有限公司，Taq酶，反轉(zhuǎn)錄試劑購自北京聚合美生物科技有限公司。

1.3" 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和供試菌株

SPF級(jí)昆明雌性小鼠50只，6～8周齡，購自湖北實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。豬圓環(huán)病毒2型（porcine circovirus type 2，PCV2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、豬鏈球菌2型（Streptococcus suis type 2，SS2）、多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS）和肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，Kp）的陽性毒株和陽性菌株由長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物重要病原分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.4" 豬呼吸道疾病病原檢測(cè)

取病死豬的肺、淋巴結(jié)等病變組織研磨勻漿后用300 μL無菌PBS稀釋，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，按照組織基因組提取試劑盒操作說明書提取病料的DNA和RNA，RNA以M5 Super plus qPCR RT kit with gDNA remover試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。合成豬呼吸道疾病病原引物［11-13］，以提取的DNA與反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，通過PCR方法分別檢測(cè)PCV2、PRRSV、SS2、Pm、HPS和Kp的特異性基因，PCR法檢測(cè)患病豬的致病原。

1.5" 病原菌的分離及純化培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)生理生化鑒定

取病原檢測(cè)為陽性的豬肺病料，在超凈工作臺(tái)中無菌條件下劃開肺組織，接種環(huán)蘸取組織并劃線接種于TSA固體平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14 h；選取單菌落接種于含5%血清的TSB培養(yǎng)基，37 ℃純化培養(yǎng)12 h。觀察TSA平板上單菌落的形態(tài)，挑取疑似巴氏桿菌典型菌落，均勻涂布于載玻片上，革蘭染色后鏡檢觀察。分離菌株的純培養(yǎng)物接種至含5％血清的TSB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，制樣用于掃描電鏡觀察。

取分離菌株的純培養(yǎng)物接種至含5％血清的TSB液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)12 h，接種細(xì)菌微量生化管，按照細(xì)菌生化微量鑒定管說明書進(jìn)行結(jié)果判定。

1.6" PCR鑒定16S rDNA基因序列鑒定

合成多殺性巴氏桿菌kmt1基因的引物（F：5′-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3′，R：5′-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3′），以細(xì)菌基因組提取試劑盒提取的分離菌株DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增［14］；反應(yīng)體系（20 μL）：2×Taq PCR Master Mix酶 10 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，ddH2O 7 μL，模板1 μL；PCR擴(kuò)增后以1.2％凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。

合成細(xì)菌16S rDNA基因通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′與1492R：5′-TACGCTACCTTGTTACGACTT-3′，PCR反應(yīng)體系為20 μL：2×PCR mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，dd H2O 7 μL，模板1 μL。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，使用NCBI BLAST對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，使用MEGA軟件來構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.7" 血清型鑒定

以提取的分離菌株DNA為模板，利用多殺性巴氏桿菌的莢膜分型引物（表1）對(duì)分離菌株進(jìn)行血清型分析，PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，確定分離菌株的血清型［14］。PCR反應(yīng)體系為20 μL：2×PCR mix 10 μL，上、下游引物1 μL，ddH2O 7 μL，模板1 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火時(shí)間30 s，退火溫度55 ℃，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次，72 ℃延伸3 min。PCR擴(kuò)增后以1.2％凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果利用NCBI BLAST工具進(jìn)行比對(duì)分析。

1.8" 多位點(diǎn)序列分析（Multi-locus sequence analysis，MLST）

根據(jù)MLST官網(wǎng)提供的多殺性巴氏桿菌信息，合成7個(gè)管家基因（adk、aroA、deoD、gdhA、g6pd、mdh和pgi）的引物，以分離菌株提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增［8］；PCR反應(yīng)體系為20 μL：2×PCR Mix 10 μL，上、下游引物1 μL，ddH2O 7 μL，模板1 μL；擴(kuò)增后的產(chǎn)物電泳并切下條帶送去測(cè)序，最后使用MLST網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫來獲取等位基因信息，使用eBURST程序分析繪圖。

1.9" 藥敏試驗(yàn)

1.9.1" 耐藥基因檢測(cè)

參考文獻(xiàn)合成18種常見耐藥基因的引物［15］，以提取的分離菌株的基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩查分離菌攜帶耐藥基因的情況。

1.9.2" 生物被膜形成能力檢測(cè)

采用96孔板結(jié)晶紫染色法分析分離菌株的生物被膜形成能力。取分離菌株的純培養(yǎng)物按1∶100的比例接種于含5％血清的TSB培養(yǎng)基，取200 μL的菌液加入到96孔板內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)24 h；棄去菌液，以無菌PBS緩沖液清洗3次，加入100 μL甲醇固定15 min；棄去甲醇，清洗、烘干后，結(jié)晶紫染色5 min；洗滌后，加入100 μL 33%（體積比）的冰醋酸。以液體培養(yǎng)基為對(duì)照，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的OD590 nm值，作為空白對(duì)照ODc（ODc為對(duì)照孔的平均值）；試驗(yàn)重復(fù)三次。判定標(biāo)準(zhǔn)：ODclt;OD≤2ODc，為弱成膜能力；2ODclt;OD≤4ODc，為中等成膜能力；ODgt;4 ODc，則判定被測(cè)菌株具有強(qiáng)的生物被膜形成能力。

1.9.3" 抗生素敏感性試驗(yàn)

采用Kirby-Bauer（K-B）紙片擴(kuò)散法，測(cè)量抑菌圈直徑（inhibition zone diameter，IZD），參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)分析多殺性巴氏桿菌分離菌株對(duì)常用抗菌藥物的敏感性［16］。

結(jié)合藥敏結(jié)果，根據(jù)CLSI推薦的雙紙片協(xié)同擴(kuò)散試驗(yàn)，分析分離菌株產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和金屬β-內(nèi)酰胺酶的情況。將分離菌株的純培養(yǎng)物調(diào)整為0.5麥?zhǔn)蠞岫?，均勻涂布于固體培養(yǎng)基表面，分別將含有頭孢他啶（30 μg）、頭孢他啶/克拉維酸（30 μg/10 μg）、頭孢噻肟（30 μg）及頭孢噻肟/克拉維酸（30 μg/10 μg）藥敏紙片貼于平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，觀察并記錄各抗生素的IZD。若頭孢他啶、頭孢噻肟分別與克拉維酸聯(lián)用時(shí)的抑菌圈比單獨(dú)使用時(shí)直徑增加5 mm以上，則表明分離菌株為ESBLs陽性。

使用EDTA-紙片協(xié)同擴(kuò)散試驗(yàn)，檢測(cè)分離菌株產(chǎn)MBLs情況。取分離菌株0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木壕鶆蛲坎加诠腆w培養(yǎng)基上，將兩片含亞胺培南（10 μg·片-1）的藥敏片貼于平板表面，兩紙片相距15 mm，向其中一片亞胺培南藥敏片上滴加10 μL 0.5 mol·L-1的EDTA，置于37℃持續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察并記錄藥敏片的抑菌情況。若兩個(gè)藥敏片抑菌圈的直徑差異超過5 mm，則判定檢測(cè)菌株產(chǎn)MBL［17-19］。

1.9.4" 中藥體外抑制試驗(yàn)

連翹、黃連、五倍子、肉桂、款冬花、金銀花、炒僵蠶、金蝎、桑皮、薄荷、蘇子、桑白皮、黃芩、茯苓、烏梅、秦皮、荊芥、五味子、蒲公英、枳殼、板藍(lán)根、羌活、炙白附子、魚腥草、貝川母、胖大海、首烏、羅漢果共28味中藥購自南京同仁堂大藥房，每種中藥各取50 g，加入100 mL蒸餾水浸泡、煮2 h后過濾藥液；再加入蒸餾水重復(fù)熬制，合并兩次藥液，小火濃縮后制成濃度為1 g·mL-1的中藥藥液［20］?？瞻姿幟艏埰菰? g·mL-1中藥提取液中，待浸透后風(fēng)干備用。取分離菌株純培養(yǎng)物均勻涂布在含 5％血清的TSA固體培養(yǎng)基表面，待菌液稍吸收后取含中藥藥液的藥敏片貼于平板上，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，測(cè)量IZD；設(shè)置3個(gè)平行，并計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.10" 致病性試驗(yàn)

1.10.1" 毒力基因檢測(cè)

合成Pm 23種毒力基因的引物，以分離菌株的基因組為模板，PCR法篩查分離菌株攜帶毒力基因情況［21］。

1.10.2" 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

取分離菌株的純培養(yǎng)物接種于含5％血清的TSB液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)12 h，無菌PBS梯度稀釋并經(jīng)平板計(jì)數(shù)，制備2×106、2×104、2×102和2×101 CFU·mL-1的菌懸液。小鼠于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)暫養(yǎng)一周，分成5組，每組10只，每組腹腔注射不同濃度的菌液，每只小鼠腹腔注射0.2 mL，對(duì)照組小鼠注射同等體積無菌PBS；攻毒后觀察記錄小鼠的精神狀態(tài)和死亡情況，剖檢死亡小鼠，記錄臟器病變情況，采集病變組織進(jìn)行病原菌的分離與測(cè)序鑒定。

2" 結(jié)" 果

2.1" 致病菌的分離和鑒定

患呼吸道疾病病豬剖檢時(shí)可見肺臟組織明顯病變，肺組織壞死、外周有纖維組織包裹。提取病豬病變組織的基因組進(jìn)行病原PCR篩查，結(jié)果如圖1A所示，多殺性巴氏桿菌的引物擴(kuò)增出460 bp大小的條帶，與多殺性巴氏桿菌參考菌株擴(kuò)增的條帶大小一致；PCV2、PRRSV、SS2、HPS和Kp的檢測(cè)均為陰性，推測(cè)該豬場(chǎng)病豬的呼吸道疾病可能與多殺性巴氏桿菌感染相關(guān)。無菌條件下取病變肺組織劃線培養(yǎng)，分離菌株在TSA固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出圓形露珠樣、有光澤的菌落（圖1B）；革蘭染色后，鏡檢可見紅色革蘭陰性短桿菌，兩極濃染，多呈單個(gè)存在（圖1C）；掃描電鏡下可見單在或成雙排列、兩端鈍圓的短桿狀菌（圖1D）。生化鑒定結(jié)果顯示，分離菌株能夠發(fā)酵葡萄糖、木糖、甘露醇、山梨醇和果糖，不能發(fā)酵衛(wèi)茅醇、阿拉伯糖、鼠李糖、麥芽糖、乳糖，肌醇、硫化氫、馬尿酸鈉、甲基紅和V-P試驗(yàn)為陰性，其生化特性與《伯杰手冊(cè)》中巴氏桿菌的生化特性一致。

2.2" 16S rDNA擴(kuò)增及進(jìn)化樹構(gòu)建

用提取的分離菌株DNA為模板，以Pm的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖2A所示，從病變組織中分離出的四株菌均擴(kuò)增出與Pm陽性對(duì)照大小一致的特異性條帶。通用引物擴(kuò)增分離菌株的16S rDNA并進(jìn)行同源序列分析，結(jié)果顯示，分離菌株與多殺性巴氏桿菌亞種CCUG 17978（NR.041811.1）基因序列的相似性最高，在系統(tǒng)發(fā)育樹中分離菌株與多殺性巴氏桿菌聚為一支（圖2B），確定分離菌株為多殺性巴氏桿菌，命名為Pm0525。

2.3" 血清型鑒定

多殺性巴氏桿菌莢膜分型引物的PCR結(jié)果顯示，分離菌株P(guān)m0525擴(kuò)增出1 044 bp左右的條帶，與多殺性巴氏桿菌A型的預(yù)期條帶大小一致（圖2C）；其它的血清型引物均無特異性條帶擴(kuò)增。分離菌株hyaD-hyaC基因的PCR產(chǎn)物測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，分離菌株P(guān)m0525的hyaD-hyaC基因與GenBank中其他A型多殺性巴氏桿菌hyaD-hyaC基因的序列相似性達(dá)99.7％；構(gòu)建進(jìn)化發(fā)育樹結(jié)果如圖2D所示，分離菌株與A型多殺性巴氏桿菌PM8-1等匯成一支，確定分離菌株P(guān)m0525為莢膜血清型A型。

2.4" MLST分型

對(duì)菌株P(guān)m0525的管家基因進(jìn)行PCR和測(cè)序，序列比對(duì)結(jié)果顯示：Pm0525的7個(gè)管家基因（adk、aroA、deoD、gdhA、g6pd、hmdh 和pgi）的編號(hào)分別為1、1、1、53、1、1和1，經(jīng)比對(duì)確定分離菌株P(guān)m0525為ST201型。數(shù)據(jù)收集發(fā)現(xiàn)，已有的Pm ST201型病例均來自國(guó)內(nèi)，主要來源于牛的鼻拭子（表2）。選擇Pm不同的ST型進(jìn)行分組聚類分析，結(jié)果如圖3所示，豬源ST201型多殺性巴氏桿菌與ST1615型聚為一支，兩者親緣關(guān)系最近。

2.5" 藥敏試驗(yàn)

2.5.1" 耐藥基因檢測(cè)

耐藥基因檢測(cè)結(jié)果如圖4A所示，在篩查的18中耐藥基因中，Pm0525攜帶SulⅠ、SulⅡ、tetA 和bla-TEM四種耐藥基因，表明分離菌株P(guān)m0525具有一定的耐藥性，為多重耐藥菌株。

2.5.2" 生物被膜形成能力測(cè)定

通過結(jié)晶紫染色法測(cè)得分離菌株P(guān)m0525的OD590 nm為0.2650，空白對(duì)照組的OD590 nm值為0.071（圖4B），分離菌株的OD590 nm值介于2ODc到4ODc之間，表明Pm0525具有中等生物被膜形成能力。

2.5.3" 抗生素敏感性測(cè)定

抗生素的敏感性試驗(yàn)結(jié)果如表3所示，Pm0525對(duì)慶大霉素、卡那霉素、麥迪霉素、新霉素、哌拉西林、頭孢氨芐、頭孢咪唑、頭孢拉定、頭孢哌酮、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、丁胺卡那、氧氟沙星13種抗生素敏感，對(duì)紅霉素、呋喃唑酮、羧芐西林、氨芐西林4種抗生素中度敏感，對(duì)氯霉素、克林霉素、頭孢呋辛、頭孢他啶和四環(huán)素5種抗生素呈現(xiàn)耐藥。

雙紙片協(xié)同擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌株對(duì)頭孢他啶及頭孢他啶/克拉維酸的IZD分別為24和25 mm，對(duì)頭孢噻肟及頭孢噻肟/克拉維酸的IZD分別為20和21 mm，頭孢他啶和頭孢噻肟分別與克拉維酸組合均未使IZD顯著增加，表明Pm0525為不產(chǎn)ESBLs細(xì)菌；EDTA-紙片協(xié)同擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌株對(duì)美羅培南及美羅培南/EDTA的IZD分別為13和23 mm（圖4C），進(jìn)一步判定Pm0525為MBL陽性菌株。雙紙片協(xié)同擴(kuò)散試驗(yàn)證實(shí)，分離菌株為一株產(chǎn)MBL的耐藥菌株。對(duì)分離菌株P(guān)m0525攜帶的β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥基因bla-TEM進(jìn)行測(cè)序分析，并將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST在線工具進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，分離菌株的bla-TEM基因與TEM-1（GenBank登錄號(hào)：JX268625.1）的基因序列一致；可確定分離菌株的bla-TEM基因?yàn)門EM-1型。從CARD耐藥基因數(shù)據(jù)庫下載所有bla-TEM基因分型序列，構(gòu)建進(jìn)化發(fā)育樹，分析耐藥分型之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其TEM-1與TEM-47、TEM-132有著相近關(guān)系（圖4D）。

2.5.4" 中藥抑制試驗(yàn)結(jié)果

中藥藥敏試驗(yàn)結(jié)果如表4所示，連翹、黃連和五倍子等28味中藥中，以黃連對(duì)Pm0525的抑菌效果最好，其IZD為19 mm，為高度敏感；五倍子以及荊芥的IZD分別為11和10 mm，為中度敏感；烏梅、連翹、肉桂、秦皮的IZD低于10 mm，均為低敏；其他中藥對(duì)分離菌株P(guān)m0525無顯著抑制作用。

2.6" 致病性試驗(yàn)

2.6.1" 毒力基因鑒定

毒力基因的篩查結(jié)果如圖5A、B所示，在23種毒力基因中，Pm0525攜帶18種：sodA、sodC、tadD、pfhA、Hsf-2、fimA、ptfA、pmHAS、plpB、omp87、ompH、ompA、Fur、tonB、exbD、exbB、hgbA和nanH，不攜帶毒力基因tbpA、toxA、hsf-1、hgbB和nanB。

2.6.2" 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

Pm0525經(jīng)腹腔注射試驗(yàn)組小鼠后，最高濃度組小鼠在攻毒后4 h開始出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、呼吸急促、被毛凌亂，抱團(tuán)取暖等臨床癥狀，感染后14 h死亡8只，死亡率為80%；2.0×104 CFU·mL-1組小鼠在攻毒后3 d死亡3只，死亡率為30%；對(duì)照組小鼠未見異常。根據(jù)攻毒后小鼠死亡情況，計(jì)算出分離菌株的半數(shù)致死量（LD50）為2.5×105 CFU。死亡小鼠剖檢發(fā)現(xiàn)，死亡小鼠的肺臟出血，以高劑量組的病變最為明顯；肝臟腫大、出血；脾臟和腎臟均有不同程度的出血和壞死（圖5C）；死亡小鼠的肝、肺、腦、脾、心和腎組織中的載菌量分別為3.08×109、5.23×108、1.29×108、3.64×108、5.68×108和1.1×109 CFU·g-1，其中肝臟中細(xì)菌載量最高（圖5D），表明分離菌株具有一定的組織嗜性。病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，感染組小鼠的肺泡隔毛細(xì)血管充血，肺泡內(nèi)可見大量纖維素和中性粒細(xì)胞滲出；脾臟的白髓有大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；肝中央靜脈中有中性粒細(xì)胞滲出（圖5E），表明分離株P(guān)m0525具有較強(qiáng)的致病性，可造成小鼠嚴(yán)重的臟器損傷。

3" 討" 論

多殺性巴氏桿菌病作為一種人獸共患病，多殺性巴氏桿菌是人和動(dòng)物呼吸道疾病重要的條件致病性病原菌，具有極強(qiáng)的致病性，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失和危害公共安全［22-24］。近年來，在豬群中不斷分離到不同血清型的Pm，臨床上常與多種病毒、細(xì)菌共同感染或繼發(fā)感染，引起高度重視［25-26］。本研究從患呼吸道疾病豬肺組織中分離到一株優(yōu)勢(shì)菌，經(jīng)電鏡觀察、生理生化和16S rDNA 基因測(cè)序分析，確定分離菌株為豬源多殺性巴氏桿菌。該養(yǎng)殖企業(yè)采集病豬肺組織進(jìn)行宏基因組測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示病豬肺組織檢測(cè)到了一定豐度的多殺性巴氏桿菌核酸序列。本研究病原分離結(jié)果與該養(yǎng)殖企業(yè)宏基因組測(cè)序和病原分析結(jié)果相一致。血清型鑒定分離菌株為莢膜血清型A型，這與國(guó)內(nèi)豬源多殺性巴氏桿菌流行的優(yōu)勢(shì)莢膜型為A型的流調(diào)結(jié)果相符［8，27］。MLST鑒定分離菌株的分子分型為ST201型菌株，該型主要分布在國(guó)內(nèi)，已報(bào)道的病例均來源于牛，未見該型在國(guó)外的報(bào)道。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國(guó)豬群中流行的基因型主要為ST11型、ST10型和ST3型［8］；本研究系首次分離到豬源多殺性巴氏桿菌ST201型菌株（莢膜血清型A型），提示Pm作為一種人獸共患病病原，對(duì)畜禽養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生安全具有潛在威脅。

毒力基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，分離菌株攜帶18種毒力基因，毒力型為sodA+/sodC+/tadD+/pfhA+/Hsf-2+/fimA+/ptfA+/pmHAS+/plpB+/omp87+/ompH+/ompA+/Fur+/tonB+/exbD+/exbB+/hgbA+/nanH+其中毒力基因fimA、hsf-2、tadD、pfhA與Pm的菌毛和黏附素相關(guān)，sodA和sodC與Pm的超氧化物歧化酶相關(guān)，nanH與Pm的唾液酸酶相關(guān)，plpB、omp87、ompH、ompA與外膜蛋白相關(guān)，F(xiàn)ur、tonB、exbD和exbB與鐵攝取相關(guān)；pmHAS與Pm的透明質(zhì)酸酶相關(guān)［8］；研究證實(shí)，pmHAS基因與莢膜血清A型顯著相關(guān)，pfhA 和 pmHAS 基因在莢膜血清A型的Pm菌株中的檢出率較高［28］。豬源多殺性巴氏桿菌ST201型菌株（莢膜血清型A型）攜帶毒力基因pfhA 和pmHAS，與前人的研究相一致［29］。動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示，攻毒劑量為2×106 CFU·mL-1時(shí)能夠?qū)е滦∈笤诠ザ竞?4 h 80%的死亡，并出現(xiàn)肺臟、脾臟和肝臟等臟器嚴(yán)重的病變，具有較強(qiáng)的致病性。Pm0525的耐藥基因檢測(cè)結(jié)果顯示，其攜帶SulⅠ、SulⅡ、tetA、bla-TEM四種耐藥基因，包括含有針對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥基因bla-TEM；雙藥敏片協(xié)同試驗(yàn)證實(shí)，Pm0525是通過產(chǎn)MBL的方式對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，其具體的耐藥機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究［30-32］；對(duì)氯霉素、克林霉素、頭孢呋辛、頭孢他啶、四環(huán)素五種藥物耐藥，屬于多重耐藥菌株；其對(duì)四環(huán)素耐藥可能與耐藥基因tetA相關(guān)，頭孢呋辛、頭孢他啶屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素，對(duì)其產(chǎn)生的耐藥性可能與耐藥基因bla-TEM有關(guān)。在生物被膜形成能力方面，分離株P(guān)m0525具有中等的生物被膜形成能力，這與分離菌株在藥敏試驗(yàn)中表現(xiàn)的多重耐藥性相符。結(jié)合分離株KP0123生物被膜形成能力、耐藥基因以及藥敏篩查結(jié)果，在一定程度解釋了該養(yǎng)殖場(chǎng)豬群Pm感染病情反復(fù)和抗生素治療不理想的原因。提示臨床在給予畜群使用抗菌藥物之前，應(yīng)監(jiān)測(cè)耐藥菌譜，減少耐藥性的產(chǎn)生和避免濫用抗生素［33］。

28味中藥的體外抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃連對(duì)分離菌株P(guān)m0525的抑菌效果最好；五倍子、荊芥、烏梅、連翹、肉桂、秦皮均為低敏，與李達(dá)怡等單味中藥對(duì)巴氏桿菌的抑菌效果一致［34］。研究表明，包括黃連堿、小檗堿、巴馬汀和表小檗堿組成的生物堿是黃連的主要活性成分，具有廣譜抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒的作用［35-36］。在黃連堿抑制禽多殺性巴氏桿菌的研究中發(fā)現(xiàn)，黃連堿可通過影響多殺性巴氏桿菌基因組、蛋白質(zhì)合成、呼吸代謝、細(xì)菌結(jié)構(gòu)的相關(guān)基因表達(dá)的方式發(fā)揮抑菌作用［37］。黃連中的黃連素可通過抑制肺炎克雷伯菌生物膜的形成與下調(diào)肺炎克雷伯菌的Ⅰ型和Ⅲ型菌毛結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的方式發(fā)揮抗菌活性［38］。同時(shí)，黃連素與抗生素的聯(lián)合使用可顯著增強(qiáng)抑菌效果［39］，這可為臨床上開展中藥黃連與抗生素聯(lián)合用藥治療豬多殺性巴氏桿菌感染提供借鑒，做到合理用藥和精準(zhǔn)施治。

豬多殺性巴氏桿菌常定殖在消化道或者呼吸道，在應(yīng)激或者長(zhǎng)途運(yùn)輸、氣候劇變、抵抗力降低時(shí)誘發(fā)Pm的感染，是重要的人畜共患條件致病菌［1，9］。對(duì)于該菌感染的防治首要是改善養(yǎng)殖環(huán)境，強(qiáng)化飼養(yǎng)管理，提高動(dòng)物機(jī)體免疫力，減少感染概率。在治療時(shí)，兼顧Pm的流行特點(diǎn)、致病性、耐藥性以及敏感抗生素和中藥的聯(lián)合用藥，嚴(yán)格控制病原的流行和傳播。因此，針對(duì)上述問題，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)Pm的流行病學(xué)調(diào)查和傳播機(jī)制研究，探究其多宿主感染和致病機(jī)制，為系統(tǒng)性、源頭防控該菌引發(fā)的感染奠定基礎(chǔ)。

4" 結(jié)" 論

本試驗(yàn)證實(shí)從患病豬肺組織中分離出一株巴氏桿菌（血清A型），ST型為ST201，攜帶sodA、sodC、tadD、pfhA、Hsf-2、fimA、ptfA、pmHAS、plpB、omp87、ompH、ompA、Fur、tonB、exbD、exbB、hgbA、nanH 18種毒力基因，具有一定的致病性，且對(duì)公共衛(wèi)生安全具有潛在威脅；分離菌株具有多重耐藥特性，攜帶SulⅠ、SulⅡ、tetA、bla-TEM四種耐藥基因，可通過產(chǎn)金屬 β-內(nèi)酰胺酶（MBL）方式發(fā)揮抗β-內(nèi)酰胺類抗生素的作用；對(duì)慶大霉素、卡那霉素、麥迪霉素等13種抗生素敏感，對(duì)氯霉素、克林霉素、頭孢呋辛、頭孢他啶和四環(huán)素耐藥；中藥黃連在體外試驗(yàn)中對(duì)分離菌株P(guān)m0525有顯著抑菌作用。相關(guān)結(jié)果旨在為ST201型巴氏桿菌（血清型A型）的研究提供科學(xué)參考。

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（編輯" 白永平）