摘" 要： 本研究旨在獲得腸舌狀絳蟲線粒體基因組全序列，了解其序列的結(jié)構(gòu)特征，探究腸舌狀絳蟲系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)信息。從麥穗魚中獲得腸舌狀絳蟲，提取基因組DNA，通過Illumina測序技術(shù)對腸舌狀絳蟲的線粒體全基因組進(jìn)行測序、組裝和注釋，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析；從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載8個(gè)科34種絳蟲的線粒體基因組序列，運(yùn)用最大似然法和貝葉斯法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，腸舌狀絳蟲線粒體基因組全長為13 655 bp，A+T含量為67.6%，其堿基組成具有明顯的AT偏向性。腸舌狀絳蟲線粒體基因組包括12個(gè)蛋白編碼基因（protein-coding genes， PCGs）、22個(gè)tRNA基因、2個(gè)rRNA基因和2個(gè)非編碼控制區(qū)。在12個(gè)PCGs中，除cox3基因使用TTG作為起始密碼子外，其余11個(gè)PCGs均使用ATG作為起始密碼子；終止密碼子方面，5個(gè)PCGs使用TAA，5個(gè)PCGs使用TAG，而cox3基因和nad3基因均沒有終止密碼子。PCGs使用密碼子頻率最高的是UUA，最低的是CGA。22個(gè)tRNA基因總長為1 272 bp，大多數(shù)tRNA能形成典型的三葉草結(jié)構(gòu)，但是trnS1和trnR由于缺少二氫尿嘧啶臂無法形成典型的三葉草結(jié)構(gòu)。nad2、nad6和nad4基因更適合作為腸舌狀絳蟲的分子標(biāo)記。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，腸舌狀絳蟲與雙線絳蟲親緣關(guān)系最近，并與雙槽頭屬絳蟲（Dibothriocephalus）形成姐妹群。本研究獲得了腸舌狀絳蟲的線粒體全基因組，為研究腸舌狀絳蟲的分類學(xué)和系統(tǒng)學(xué)提供參考。

關(guān)鍵詞： 腸舌狀絳蟲；線粒體基因組；結(jié)構(gòu)特征；系統(tǒng)發(fā)育

中圖分類號(hào)： S852.734

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）12-5725-13

doi： 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.12.035

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

收稿日期：2024-02-02

基金項(xiàng)目：福建省屬公益類科研院所項(xiàng)目（2023R1024002）；福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自由探索科技創(chuàng)新項(xiàng)目（ZYTS2023017）

作者簡介：陳秀琴（1988-），女，福建漳州人，助理研究員，博士，主要從事畜禽疫病診斷方法研究，E-mail： lyunxqchen@163.com

*通信作者：黃梅清，主要從事畜禽疫病診斷方法研究，E-mail： meiqingmail@126.com

Characteristics and Phylogenetic Analysis of Mitochondrial Genome in the Ligula intestinalis

CHEN" Xiuqin1， QIU" Yangyuan2， L Qingbo2， HUANG" Meiqing1*

（1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Fujian Academy of Agricultural Scienc/Fujian Animal Diseases Control Technology Development Center， Fuzhou， Fujian 350013，" China;

2.Key Laboratory of Zoonosis Research， Ministry of Education/Institute of Zoonosis， College of

Veterinary Medicine， Jilin University， Changchun 130062，" China）

Abstract：" This experiment was conducted to obtain the complete mitochondrial genome sequence of Ligula intestinalis， revealed the sequence’s structural features， and explored the phylogenetic information of L. intestinalis. Several L. intestinalis were obtained from Pseudorasbora parva and genomic DNA was extracted. The complete mitochondrial genome of L. intestinalis was sequenced， assembled， and annotated using Illumina sequencing technology after quality control of the DNA， followed by bioinformatic analysis. Maximum likelihood （ML） and bayesian inference （BI） analysis were used to construct the phylogenetic tree. The results showed that the complete mitochondrial genome of L. intestinalis was 13 655 bp in length， and its A+T content was 67.6%， exhibiting a clear AT bias. The complete mitochondrial genome was composed of 12 protein-coding genes （PCGs）， 22 tRNA genes， two rRNA genes and two NCRs （non-coding regions）. Among the 12 PCGs，11 used ATG as the start codon， except for cox3， which had a TTG initial one. Among the termination codons， five out of twelve were identified as TAA， five as TAG， while neither the cox3 nor nad3 genes had termination codons. The total length of the 22 tRNA genes was 1 272 bp. Most tRNAs have a conventional cloverleaf structure， but trnS1 and trnR lack dihydrouridine arms of tRNA. The nad2， nad6 and nad4 genes are more suitable as molecular markers for L. intestinalis. The results of the phylogenetic tree showed that Ligula and Digramma were most closely related to each other， forming a sister group with Dibothriocephalus. The complete mitochondrial genome of L. intestinalis was obtained. This study will provide a reference for the study of the taxonomy and systematics of L. intestinalis.

Key words： Ligula intestinalis; mitogenome; structure characteristics; phylogeny

*Corresponding author：" HUANG Meiqing，E-mail： meiqingmail@126.com

腸舌狀絳蟲（Ligula intestinalis）是一種寄生于淡水魚的大型絳蟲，主要感染鯉科魚類［1-2］。腸舌狀絳蟲感染會(huì)嚴(yán)重影響魚的生長性能，降低繁殖力，甚至造成魚類死亡［3］。由于絳蟲裂頭蚴無特征性形態(tài)，僅依靠形態(tài)特征進(jìn)行物種鑒定極具挑戰(zhàn)［4］。例如，裂頭科絳蟲中的腸舌狀絳蟲（舌狀屬，Ligula）和雙線絳蟲（雙線屬，Digramma）的裂頭蚴均呈現(xiàn)“面條樣”［4-5］。此外，舌狀屬和雙線屬的分類地位也一直存在爭議。有研究報(bào)道舌狀屬和雙線屬可能不是獨(dú)立的屬，舌狀屬應(yīng)屬于雙線屬［6-7］。

盡管使用核基因分子標(biāo)記的系統(tǒng)發(fā)育分析在揭示許多類群的進(jìn)化關(guān)系方面發(fā)揮了重要作用，但是核基因分子標(biāo)記顯示的物種有時(shí)變異小或者分支支持有時(shí)較低［5］。相比之下，線粒體基因組具有嚴(yán)格的母系遺傳、進(jìn)化速度相對較快、無旁系同源基因和相對保守的基因組結(jié)構(gòu)，是一種理想的分子遺傳標(biāo)記，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于物種鑒定、群體遺傳學(xué)、分子診斷以及系統(tǒng)發(fā)育等研究領(lǐng)域［5，8-9］。盡管線粒體基因適用于多種生物體的系統(tǒng)發(fā)育研究，但是單個(gè)線粒體基因片段通常較短，難以完全解析不同物種間的進(jìn)化關(guān)系［5，10］。而完整的線粒體基因組序列可顯著提高系統(tǒng)發(fā)育分析能力，并且能夠在深層次上準(zhǔn)確解析分類學(xué)關(guān)系。因此，基于線粒體基因組的系統(tǒng)發(fā)育已廣泛應(yīng)用于絳蟲進(jìn)化發(fā)育研究［11-14］。已報(bào)道的絳蟲線粒體基因組大多采用長PCR擴(kuò)增法［11-14］，這種方法不僅操作繁瑣，而且由于可供參考的絳蟲線粒體基因組較少，導(dǎo)致引物設(shè)計(jì)不合適，使得獲得的線粒體基因組信息不準(zhǔn)確。近年來，高通量測序技術(shù)的發(fā)展為獲取線粒體基因組提供了更便捷的工具。然而，該方法尚未應(yīng)用于腸舌狀絳蟲的線粒體基因組研究。

本研究采用高通量測序技術(shù)Illumina平臺(tái)對腸舌狀絳蟲的線粒體全基因組進(jìn)行測序，分析其基因結(jié)構(gòu)、堿基組成、蛋白質(zhì)編碼基因（protein-coding genes， PCGs）和密碼子使用情況， 結(jié)合已發(fā)表的絳蟲線粒體全基因組序列對腸舌狀絳蟲進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析， 以期為腸舌狀絳蟲的分子鑒定、分類地位和線粒體基因組研究奠定基礎(chǔ)。

1" 材料與方法

1.1" 腸舌狀絳蟲基因組DNA提取

腸舌狀絳蟲分離自黑龍江省扶余市捕撈的麥穗魚，將蟲體剪成小塊置于1.5 mL離心管中，加入裂解液和蛋白酶K溶液，56℃裂解1.5 h。按照基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN， Code No.DP304）說明書提取基因組DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的純度。在前期的研究中，通過形態(tài)學(xué)以及擴(kuò)增蟲體的線粒體cox1基因鑒定為腸舌狀絳蟲。

1.2" 高通量測序

檢測合格的DNA樣品分別采用Covaris超聲波破碎儀隨機(jī)分割成長度為350 bp左右的片段，采用標(biāo)準(zhǔn)的Illumina TruSeq Nano DNA LT文庫制備流程構(gòu)建腸舌狀絳蟲DNA樣本上機(jī)文庫，委托南京派森諾基因科技有限公司，使用Hiseq Xten PE150平臺(tái)進(jìn)行高通量測序。采FSATP對下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，刪除讀段（reads）中的測序接頭以及引物序列，過濾長度低于50 bp、Q值低于20或N含量大于3 的讀段，得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)（clean data）。

1.3" 線粒體基因組序列拼接和注釋

用軟件SPAdes v3.15.5、IDBA和GetOrganelle v1.7.7.0 完成線粒體基因組序列的組裝。然后， 利用在線注釋工具M(jìn)ITOS2 （http：//mitos2.bioinf.uni-leipzig.de/index.py）對線粒體基因組序列進(jìn)行識(shí)別和注釋， 并使用CGView （https：//cgview.ca）生成線粒體基因組的基因圖譜。

1.4" 腸舌狀絳蟲mtDNA生物信息學(xué)分析

使用PhyloSuite軟件統(tǒng)計(jì)腸舌狀絳蟲全基因組及各基因的長度、AT 含量、核苷酸偏倚度、PCGs各基因的起始和終止密碼子，計(jì)算相對同義密碼子使用度（relative synonymous codon usage， RSCU）等信息［15］。

1.5" 基因差異位點(diǎn)分析

從GenBank數(shù)據(jù)庫下載所有腸舌狀絳蟲全基因組，運(yùn)用MEGA 6.0軟件對12個(gè)PCGs和2個(gè)rRNA 基因進(jìn)行多重比對，再通過DnaSP 6 軟件分析舌狀絳蟲基因組的基因差異位點(diǎn)。用于基因差異位點(diǎn)分析的腸舌狀絳蟲具體信息見表1。

1.6" 系統(tǒng)發(fā)育分析

從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載8個(gè)科34種絳蟲的線粒體全基因組作為參考序列，以長尾窄體吸蟲（Lyperosomum longicauda， NC_048467.1）作為外群（表2）。使用PhyloSuite軟件提取所有從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載序列的36個(gè)基因信息（12個(gè)PCGs、2個(gè)rRNAs和22個(gè)tRNAs），將PCGs翻譯成氨基酸序列。使用MAFFT軟件和MACSE軟件對34種絳蟲的線粒體基因組12個(gè)PCGs進(jìn)行批量比對。將獲得的比對結(jié)果導(dǎo)入Gblocks以消除不明確的序列［16］。根據(jù)ModelFinder中最低的貝葉斯信息標(biāo)準(zhǔn)得分選擇最佳核苷酸替代模型［17］。

采用最大似然法（maximum likelihood，ML） 和貝葉斯法（Bayesian inference，BI） 來構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其中，ML進(jìn)化樹運(yùn)用IQ-TREE v1.6.12軟件進(jìn)行構(gòu)建［18］，系統(tǒng)發(fā)育樹的各分支置信水平用自展檢驗(yàn)（bootstrap test）進(jìn)行評(píng)估，重復(fù)抽樣次數(shù)為5 000次。BI進(jìn)化樹則運(yùn)用MrBayes v3.2.6軟件進(jìn)行構(gòu)建［19］，運(yùn)行世代數(shù)設(shè)置為5×106，運(yùn)行4條蒙特卡洛馬爾夫鏈（Markov chain Monte Carlo，MCMC），運(yùn)行每1 000世代取樣1 次。當(dāng)分列頻率平均標(biāo)準(zhǔn)差（average standard deviation of split frequencies）低于0.01，ESS值（estimated sample size）大于200，以及PSRF值（potential scale reduction factor）接近1時(shí)則認(rèn)為收斂。最后去掉運(yùn)算開始的前25%取樣，剩下的取樣則用于測算貝葉斯后驗(yàn)概率（posterior probability，PP）。所得到的進(jìn)化樹通過在線工具iTOL進(jìn)行可視化和美化［20］。

2" 結(jié)" 果

2.1" 腸舌狀絳蟲線粒體全基因組分析

2.1.1" 線粒體基因組的結(jié)構(gòu)分析

腸舌狀絳蟲的線粒體基因組為典型的閉合雙鏈DNA分子，全長為13 655 bp，共編碼36個(gè)基因， 包括12個(gè)PCGs（cox3、cytb、nad4L、nad4、atp6、nad2、nad1、nad3、cox1、cox2、nad6、nad5）、22 個(gè)tRNAs（trnG、trnH、trnQ等）和2個(gè)rRNAs（rrnL和rrnS）和2個(gè)非編碼控制區(qū)（non-coding region， NCR）（圖1、表3）。

2.1.2" 堿基組成特點(diǎn)

腸舌狀絳蟲的線粒體基因組的A、T、C、G堿基組成分別為23.5%、44.1%、12.3%、20.2%，堿基呈AT偏好， 其A+T含量為67.6%，AT偏斜度為-0.305，GC偏斜度為0.245，同時(shí)PCGs、tRNA、rRNA和NCR均呈AT偏好，且線粒體基因組和PCGs的AT偏斜度高于GC偏斜度（表4）。

2.1.3" 蛋白編碼基因及密碼子使用情況

腸舌狀絳蟲所有PCGs的總長度（10 059 bp）占線粒體全基因組總長度的73.67%，各個(gè)PCG的長度從261 bp（nad4L）～1 569 bp （nad5） 不等，AT含量在64.4％（cox2） ～71.1％（nad2）之間，呈現(xiàn)明顯的AT偏斜，3 個(gè)位置的AT含量均遠(yuǎn)高于GC含量，且密碼子第3位的AT含量均明顯高于其它2個(gè)位點(diǎn)（表4）。對12個(gè)PCGs的起始密碼子和終止密碼子進(jìn)行分析，結(jié)果表明，除了cox3基因使用非標(biāo)準(zhǔn)起始密碼子TTG外，其余11個(gè)PCGs均使用ATG作為起始密碼子；終止密碼子方面，5 個(gè)PCGs使用TAA，5 個(gè)PCGs使用TAG，而cox3基因和nad3基因都沒有終止密碼子（表3）。排除終止密碼子，腸舌狀絳蟲的PCGs共使用3 353個(gè)三聯(lián)體密碼子。

使用PhyloSuite軟件分析腸舌狀絳蟲線粒體基因組12個(gè)PCGs的RSCU，如圖2所示，PCGs使用密碼子頻率最高的是UUA（Leu2，RSCU=2.81），其次是CGU（Arg，RSCU=2.69）和GCU（Ala，RSCU=2.59）；PCGs使用密碼子頻率最低的是CGA（Arg，RSCU=0.15），其次是AUC（Ile，RSCU=0.2）和UUC（Phe，RSCU=0.23）。以上結(jié)果表明，與使用C或G結(jié)尾的密碼子相比，大多數(shù)以A或U（T）結(jié)尾的密碼子均顯著表達(dá)（RSCUgt;1） ，驗(yàn)證了其PCGs的密碼子存在AT偏好。

2.1.4" tRNA和rRNA

腸舌狀絳蟲線粒體基因組的22個(gè)tRNA基因總長為1 272 bp，A+T 的含量為66.5%，tRNA基因的長度在55 bp（trnR） ～67 bp（trnF、trnM和trnL1）之間。多數(shù)tRNA都可以折疊成典型的三葉草結(jié)構(gòu)，但是trnS1和trnR由于缺少二氫尿嘧啶臂無法形成典型的三葉草結(jié)構(gòu)。在20個(gè)tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，氨基酸接受臂、TΨC 臂、反義密碼子臂和二氫尿嘧啶臂都出現(xiàn)了G-U 錯(cuò)配現(xiàn)象（圖3，僅展示3個(gè)）。

腸舌狀絳蟲線粒體基因組的兩個(gè)rRNA 基因（rrnL和rrnS）長度分別為966 bp 和716 bp，兩者分別位于trnT 和trnC，trnC和cox2之間，總長度為1 682 bp，A+T 的含量為68.1%（圖1，表4）。

2.1.5" 非編碼控制區(qū)

腸舌狀絳蟲線粒體基因組的非編碼控制區(qū)有兩個(gè)，分別位于trnY和trnL1之間，nad5和trnG之間，總長度為445 bp，占整個(gè)線粒體基因組總長度的4.21%，A+T含量為76.85%，比其它基因的A+T含量都更高（圖1、表4）。相比較于線粒體基因組和PCGs，兩個(gè)NCR的AT偏斜度小于GC偏斜度（表3）。

2.1.6" 基因重疊和間隔序列

腸舌狀絳蟲線粒體基因組共有基因間隔23處，總長為572 bp，其中最長一處位于trnY和trnL1之間（間隔序列長度為225 bp）；基因重疊有5處，共63 bp，nad4L和nad4之間重疊最長為40 bp；既無重疊又無間隔的區(qū)域有6處（表3）。

2.2" 分子標(biāo)記

對腸舌狀絳蟲基因組的12 個(gè)PCGs 和2 個(gè)rRNA 基因的差異位點(diǎn)分析見表5。由表5可知，12 個(gè)PCGs中差異位點(diǎn)比例較高的3個(gè)基因分別為nad2（22.59%）、nad6（20.92%）、nad4（20.30%），nad4L基因最保守，差異位點(diǎn)比例僅為0.44%；2個(gè)rRNA 基因的差異位點(diǎn)比例均低于10%。

2.3" 腸舌狀絳蟲的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

以長尾窄體吸蟲（Lyperosomum longicauda）為外群，通過ML和BI構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，兩種方法都生成具有一致分支拓?fù)涞南到y(tǒng)發(fā)育圖，因此僅顯示了后者（圖4）。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，在裂頭科絳蟲（Diphyllobothriidae）中，腸舌狀絳蟲（Ligula_intestinalis，NC_039445.1）和雙線絳蟲（Digramma）位于同一分支，本研究的分離蟲株（PP109086.1）再與該分支聚成一支，節(jié)點(diǎn)分支具有很高的可信度（BP = 100和PP = 1.00），并與雙槽頭屬絳蟲（Dibothriocephalus）形成姐妹群。該分支與復(fù)殖孔屬絳蟲（Diplogonoporus）聚成一支，然后與迭宮屬絳蟲（Spirometra）形成姐妹群。

3" 討" 論

線粒體基因組具有保守性高、母系遺傳、較快的進(jìn)化速率等諸多優(yōu)勢，使得在物種進(jìn)化關(guān)系、物種鑒定以及揭示線粒體基因組和宿主適應(yīng)關(guān)系等研究發(fā)揮了重要作用。此外，完整的線粒體基因組不僅可以揭示一般基因組特征，而且具有研究功能分子機(jī)制的潛力［21］。本研究測定了腸舌狀絳蟲線粒體基因組全序列，全長為13 655 bp，比分離自中國的青海湖裸鯉（NC_039445.1）和俄羅斯的拉多加環(huán)斑海豹（MW602519.1、MW602519.1）長（表1），但是本研究的腸舌狀絳蟲的nad3基因和rrnS基因序列長度更短（詳見OSID開放科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容中的附件1，掃首頁OSID碼可獲取，下同）。堿基組成呈現(xiàn)出Tgt;Agt;Ggt;C，A+T含量為67.6%，具有明顯的AT偏好性，AT偏斜度為-0.305，GC偏斜度為0.245，表明整體更偏好使用T和G堿基。對其它4條腸舌狀絳蟲的線粒體基因組進(jìn)行分析也得出相同的結(jié)論（詳見附件1）。而在線粒體基因組PCGs的密碼子第3位AT含量最高，與其它絳蟲一致［11］。腸舌狀絳蟲的線粒體基因組缺少atp8基因，除了cox3基因使用GTG作為起始密碼子外，其它PCGs都使用ATG作為起始密碼子，這些特征均與其它扁形動(dòng)物一致［22］。本研究中分離的腸舌狀絳蟲線粒體基因組中5 個(gè)PCGs使用TAA作為終止密碼子，5 個(gè)PCGs使用TAG，而cox3基因和nad3基因都沒有終止密碼子。在GenBank數(shù)據(jù)庫中其它4條腸舌狀絳蟲線粒體基因組（NC_039445.1，MW602519.1，MW602520.1，OR756289.1）的cox3基因則使用不完全密碼子T--，其中3條線粒體基因組的nad3基因以TAG作為終止密碼子，1條線粒體基因組的nad3基因的終止密碼子為T--，這與本研究不一致（詳見附件1）。

腸舌狀絳蟲無特異性宿主，大約有170多種魚可作為其第二中間宿主，以食魚鳥作為終末宿主［2］。本研究中用于比較的其中兩條腸舌狀絳蟲分離自拉多加環(huán)斑海豹，這種哺乳動(dòng)物是腸舌狀絳蟲的偶然宿主［23］。由于腸舌狀絳蟲的寄生宿主跨度極大，因此，我們進(jìn)一步將分離自拉多加環(huán)斑海豹的兩株腸舌狀絳蟲（MW602519.1、MW602520.1）的線粒體基因組與分離自青海湖裸鯉的腸舌狀絳蟲（NC_039445.1）進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)它們的線粒體基因組結(jié)構(gòu)和每個(gè)基因的長度完全相同（詳見附件1）。環(huán)境的物理屏障和地理隔離可能會(huì)導(dǎo)致寄生蟲的遺傳差異［24］，但是對于腸舌狀絳蟲卻不是這樣。由于GenBank數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有的腸舌狀絳蟲的全基因組序列只有5條，需要更多的數(shù)據(jù)來支撐以上結(jié)論。

對腸舌狀絳蟲線粒體基因組的密碼子偏好性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在62個(gè)編碼的密碼子中有23個(gè)密碼子的RSCU值大于1，其中密碼子UUA的RSCU值最高，而密碼子CGA的RSCU值則最低。一般認(rèn)為如果密碼子沒有偏好，則該密碼子的RSCU值等于1。當(dāng)密碼子的RSCU值大于1時(shí)，表明該密碼子具有較高的使用率，反之亦然［23］。因此，有23個(gè)密碼子是腸舌狀絳蟲的偏好密碼子。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，腸舌狀絳蟲和雙線絳蟲均以UUA作為最優(yōu)密碼子，本文中選取的用于構(gòu)建進(jìn)化樹的蟲種（表2）均使用UUA作為優(yōu)勢密碼子，并且RSCU值高的密碼子也幾乎以A或U結(jié)尾，這與PCGs的堿基呈AT偏向性的分析結(jié)果一致（表4）。對22個(gè)tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，除trnS1和trnR外，其余20個(gè)tRNA均可形成典型的三葉草結(jié)構(gòu)，這種現(xiàn)象也存在于裂頭科絳蟲、頭頰科絳蟲和帶形科絳蟲［11-12，25］。

合適的分子標(biāo)記對于群體遺傳學(xué)研究至關(guān)重要，甚至可能在基因同源性分析中得出不同的結(jié)論［5］。張學(xué)勇等［5］基于18S rRNA、cox1和cytb基因這3個(gè)基因的聯(lián)合分析對舌狀絳蟲分離株進(jìn)行分子進(jìn)化發(fā)育研究，發(fā)現(xiàn)采用不同的分子標(biāo)記基因可得出不同的結(jié)論，主要是由于核基因分子標(biāo)記變異小，而線粒體基因標(biāo)記變異較大。本研究對GenBank數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有的5條腸舌狀絳蟲的線粒體全基因組序列（包含本研究中上傳的序列）的12 個(gè)PCGs 和2 個(gè)rRNA 基因的差異位點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)nad4L基因最保守，不適合用于物種同源性分析，而較為理想的分子標(biāo)記包括nad2、nad6和nad4基因，可用于物種同源性分析。

本研究構(gòu)建的線粒體全基因組12個(gè)PCGs的核苷酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明腸舌狀絳蟲與雙線絳蟲的親緣關(guān)系最接近。Li等［11］通過比較腸舌狀絳蟲與雙線絳蟲的線粒體全基因組序列結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹，認(rèn)為二者應(yīng)歸屬于同一個(gè)屬。在更早的研究中，Li和Liao［6］通過比較腸舌狀絳蟲與雙線絳蟲的28S rRNA、cox1、ITS1和ND1基因，發(fā)現(xiàn)兩種絳蟲的4個(gè)基因都是高度保守的， 4個(gè)基因的低遺傳差異表明腸舌狀絳蟲與雙線絳蟲應(yīng)該都?xì)w屬于舌狀屬。本研究的結(jié)果與這兩篇文獻(xiàn)報(bào)道一致。除了雙線絳蟲，腸舌狀絳蟲與雙槽頭屬絳蟲形成姐妹群。通過串聯(lián)雙槽頭屬絳蟲和舌狀屬絳蟲18S rDNA+28S rDNA+rrnL+cox1的核苷酸序列，同樣證明雙槽頭屬絳蟲是舌狀屬絳蟲的姐妹群［26］。在裂頭科絳蟲中，復(fù)殖孔屬、舌狀屬、雙葉槽屬和迭宮屬聚成一大分支，這與前人的報(bào)道也一致［11，25］。腸舌狀絳蟲被認(rèn)為是研究寄生蟲生態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)的良好模型［27］，因此，有必要對腸舌狀絳蟲作進(jìn)一步的深入研究。

4" 結(jié)" 論

腸舌狀絳蟲的線粒體基因組全長為13 655 bp，其堿基組成具有明顯的AT偏向性，包括12個(gè)PCGs、22個(gè)tRNA基因、2個(gè)rRNA基因和2個(gè)非編碼控制區(qū)。nad2、nad6和nad4基因更適合作為腸舌狀絳蟲的分子標(biāo)記。腸舌狀絳蟲與雙線絳蟲親緣關(guān)系最近。本研究為腸舌狀絳蟲的分類地位、系統(tǒng)發(fā)育分析和線粒體基因組研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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（編輯" 白永平）