摘" 要： 旨在探究氧化應(yīng)激及鐵死亡在鉬、鎘及其聯(lián)合暴露致綿羊腎組織損傷中的作用。以24只2月齡綿羊?yàn)樵囼?yàn)對象，隨機(jī)分為4組，即對照組（Control）、鉬組（Mo）、鎘組（Cd）和鉬鎘聯(lián)合組（Mo+Cd），對照組灌服等體積蒸餾水，Mo組灌服45 mg·kg-1 BW的Mo，Cd組灌服1 mg·kg-1 BW的Cd，Mo+Cd組灌服1 mg·kg－1 BW Cd+45 mg·kg-1 BW Mo。正試期為75 d。試驗(yàn)結(jié)束，取綿羊血清和腎組織，觀察綿羊腎組織病理及超微病理學(xué)變化，并檢測血清腎功能指標(biāo)、腎組織氧化應(yīng)激和鐵死亡相關(guān)因子水平。結(jié)果顯示，鉬、鎘及其聯(lián)合暴露提高了血清腎功能指標(biāo)（肌酐、尿素和尿酸）水平。Mo組、Cd組和Mo+Cd組中腎小管上皮細(xì)胞變性腫脹、結(jié)構(gòu)模糊和溶解，在細(xì)胞質(zhì)中有微小的紅色顆粒和空泡，表現(xiàn)出顆粒變性、空泡變性和壞死。此外，腎小管管腔內(nèi)有粉紅色著染的絲縷樣成分，部分腎小球及間質(zhì)內(nèi)紅細(xì)胞數(shù)量增多。透射電鏡結(jié)果顯示，鉬、鎘及其聯(lián)合暴露導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞中線粒體體積變小且出現(xiàn)嵴模糊和空泡化。Mo組和Cd組中氧化損傷相關(guān)因子（H2O2、MDA）及Fe離子含量，鐵死亡相關(guān)因子（NCOA4、ACSL4、TFR1和PTGS2）mRNA表達(dá)水平及PTGS2蛋白表達(dá)水平升高；抗氧化相關(guān)因子（GSH、CAT和GSH-Px）水平，鐵死亡相關(guān)因子（SLC7A11、GPX4和FTH1）mRNA及蛋白表達(dá)水平降低，且上述變化在Mo+Cd組中更為明顯。皮爾森相關(guān)性分析表明，氧化損傷相關(guān)因子（H2O2、MDA）和Fe離子水平與鐵死亡相關(guān)因子（NCOA4、ACSL4、TFR1和PTGS2）表達(dá)水平呈正相關(guān)，與鐵死亡相關(guān)因子（SLC7A11、GPX4和FTH1）表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)；抗氧化相關(guān)因子（GSH、CAT和GSH-Px）水平和鐵死亡相關(guān)因子（NCOA4、ACSL4、TFR1和PTGS2）表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，而與鐵死亡相關(guān)因子（SLC7A11、GPX4和FTH1）表達(dá)水平呈正相關(guān)。本研究表明，鉬鎘及其聯(lián)合暴露誘發(fā)綿羊腎氧化應(yīng)激和鐵死亡致腎組織損傷，且鉬鎘毒性具有協(xié)同效應(yīng)。

關(guān)鍵詞： 羊；鉬；鎘；氧化應(yīng)激；鐵死亡

中圖分類號：S856.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）12-5802-11

doi： 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.12.042

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

收稿日期：2024-01-02

基金項(xiàng)目：江西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)牛羊體系疫病防控崗（JXRS-13）

作者簡介：熊志偉（1997-），男，江西南昌人，博士生，主要從事臨床獸醫(yī)學(xué)研究，E-mail：13698091664@163.com

*通信作者：胡愛明，主要從事畜牧獸醫(yī)研究，E-mail：15807969386@163.com

Molybdenum and Cadmium Combined Exposure Mediates Oxidative Stress and Ferroptosis Induced Kidney Damage in Sheep

XIONG" Zhiwei1，2， WANG" Yun2， CAO" Huabin1， PENG" Chengcheng3， YANG" Fan1， DAI" Xueyan1， XING" Chenghong1， LIU" Lingli1， LI" Jingni1， HU" Aiming4*

（1.Jiangxi Key Laboratory of Animal Disease Diagnosis and Control， College of Animal Science and

Technology， Jiangxi Agricultural University， Nanchang 330045，" China;

2.Jiangxi Vocational College of Biotechnology， Nanchang 330100，" China;

3.Department of Pharmacy， Faculty of Medicine， Guangxi

University of Science and Technology， Liuzhou 545005，" China;

4.Ji’an Agricultural and Rural Industry Development Service Center， Ji’an 343000，" China）

Abstract：" The aim of this study was to investigate the role of oxidative stress and ferroptosis in renal tissue injury caused by molybdenum， cadmium and their combined exposure in sheep. Twenty-four sheep aged 2 months were randomly divided into 4 groups， namely control group （Control）， molybdenum group （Mo）， cadmium group （Cd） and molybdenum cadmium combined group （Mo+Cd）. The control group was given equal volume of distilled water， the Mo group was given 45 mg Mo·kg-1BW， group Cd was given 1 mg Cd·kg-1BW， and group Mo+Cd was given 1 mg Cd+45 mg Mo·kg-1BW. The experimental period lasted for 75 d. At the end of the experiment， serum and kidney tissue were collected， pathological and ultrapathological changes of sheep kidney were observed， and the levels of serum renal function indexes， renal tissue oxidative stress and ferroptosis related factors were detected. The results showed that molybdenum， cadmium and their combined exposure increased the levels of serum renal function indicators （creatinine， urea and uric acid）. In the Mo， Cd， and Mo+Cd groups， the renal tubular epithelial cells underwent degeneration， manifesting as swelling， structural blurring， and lysis. The cytoplasm contained minute red granules and vacuoles， indicating granular degeneration， vacuolar degeneration， and necrosis. Additionally， the renal tubular lumens were observed to contain pink-stained filamentous components， while the number of red blood cells was elevated in some glomeruli and interstitial spaces. The results of transmission electron microscopy showed that molybdenum， cadmium and their combined exposure resulted in the reduction of mitochondrial volume， blurring of ridge and vacuolation in renal tubular epithelial cells. The contents of oxidative damage related factors （H2O2， MDA） and Fe ions， the mRNA expression levels of ferroptosis related factors （NCOA4， ACSL4， TFR1 and PTGS2） and the protein expression levels of PTGS2 were increased in Mo and Cd groups. The mRNA and protein expression levels of antioxidant related factors （GSH， CAT and GSH-Px） and ferroptosis related factors （SLC7A11， GPX4 and FTH1） were decreased， and the above changes were more obvious in Mo+Cd group. Pearson correlation analysis showed that the levels of oxidative damage related factors （H2O2， MDA） and Fe ions were positively correlated with the expression levels of ferroptosis related factors （NCOA4， ACSL4， TFR1 and PTGS2）， and negatively correlated with the expression levels of ferroptosis related factors （SLC7A11， GPX4 and FTH1）. The correlation of antioxidant related factors （GSH， CAT and GSH-Px） and ferroptosis related factors was opposite to that of oxidative damage related factors. This study shows that molybdenum cadmium and its combined exposure induced renal oxidative stress and ferroptosis in sheep， resulting in renal tissue damage， and molybdenum， cadmium toxicity has a synergistic effect.

Key words： sheep; molybdenum; cadmium; oxidative stress; ferroptosis

*Corresponding author：" HU Aiming， E-mail：15807969386@163.com

鉬作為機(jī)體必需微量元素，廣泛存在于植物、動(dòng)物和人體中，具有促進(jìn)生長發(fā)育的作用，但攝入過量會引發(fā)毒性損傷［1］。鎘是一種在生物體內(nèi)具有器官毒性和較長的生物半衰期的微量元素［2］。隨著工業(yè)化進(jìn)程的推進(jìn)，化石的燃燒、金屬礦產(chǎn)的冶煉以及污、廢水的排放，使得大量重金屬遷移到自然界中，并通過食物鏈富集到動(dòng)物機(jī)體中。研究表明，低劑量的鎘能夠引發(fā)機(jī)體氧化應(yīng)激并觸發(fā)NF-κB介導(dǎo)的NLRP3炎性小體活化致肝毒性［3］，而高劑量的鉬可通過線粒體途徑誘導(dǎo)鴨腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡［4］。重金屬污染的形式是復(fù)雜多樣的，在自然界中重金屬復(fù)合污染較單一污染現(xiàn)象更為普遍，通常具有伴生性和綜合性［5］。前人研究表明，鉬、鎘具有協(xié)同毒性，并能夠引發(fā)鴨腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激致細(xì)胞焦亡［6］。在江西贛南地區(qū)，鉬、鎘是引起畜禽中毒最重要的環(huán)境污染物，而與單胃動(dòng)物相比，反芻動(dòng)物由于放牧式飼養(yǎng)管理、生產(chǎn)周期長及瘤胃微生物的轉(zhuǎn)化作用，對環(huán)境中的重金屬毒性更為敏感［7］，但其毒性作用機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

氧化應(yīng)激是指機(jī)體受到有害刺激時(shí)，體內(nèi)產(chǎn)生過多的活性氧自由基，導(dǎo)致氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態(tài)。氧化應(yīng)激與機(jī)體損傷具有密切的關(guān)聯(lián)，過多的氧自由基可以引起細(xì)胞和組織的氧化損傷，從而導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生與發(fā)展。重金屬毒性常能引發(fā)機(jī)體氧化應(yīng)激，并伴隨自噬、焦亡和壞死等細(xì)胞損傷［8］。本課題組前期研究表明，鉬、鎘共處理能夠引發(fā)綿羊腎氧化應(yīng)激和線粒體質(zhì)量控制紊亂［9］。與此同時(shí)，鐵死亡作為一種獨(dú)特的細(xì)胞死亡方式，其主要特征是細(xì)胞內(nèi)鐵離子的異常積聚［10］。這種積聚促使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過量的氧自由基，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。研究表明，鎘能夠引起小鼠肝氧化應(yīng)激和自噬進(jìn)而誘發(fā)鐵死亡［11］。然而，鉬、鎘的協(xié)同毒性在反芻動(dòng)物體內(nèi)致氧化應(yīng)激對鐵死亡的影響值得進(jìn)一步探究。因此，本研究以綿羊?yàn)樵囼?yàn)對象，通過檢測綿羊腎功能血清生化相關(guān)指標(biāo)、腎組織病理學(xué)和超微病理學(xué)變化、氧化應(yīng)激和鐵死亡相關(guān)因子水平變化，探究鉬、鎘及其聯(lián)合暴露造成綿羊腎損傷的毒性作用機(jī)制。

1" 材料與方法

1.1" 試驗(yàn)材料

鉬酸銨［（NH4）6Mo7O24·4H2O］和氯化鎘（CdCl2）購自西隴科學(xué)股份有限公司。血清肌酐（creatinine，CREA）、尿素（UREA）和尿酸（uric acid，UA）生化檢測試劑盒購自美康生物科技股份有限公司；過氧化氫（H2O2）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒購自南京建成生物工程有限公司；總鐵離子比色法測試盒購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；TRIzol試劑購于南京諾唯贊生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PTGS2、SLC7A11、GPX4和GAPDH抗體購自艾比瑪特醫(yī)藥科技有限公司，F(xiàn)TH1抗體購自杭州華安生物技術(shù)有限公司。

1.2" 動(dòng)物處理

本試驗(yàn)在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)羊場進(jìn)行，并遵循倫理道德準(zhǔn)則，由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物管理與倫理委員會批準(zhǔn)（No. JXAULL-2023-06-05）。選用24只2月齡綿羊，根據(jù)公母對半原則，將綿羊隨機(jī)分為4組：對照組（Control組），鉬組（Mo組），鎘組（Cd組）和鉬鎘聯(lián)合組（Mo+Cd組）。試驗(yàn)期間，將配制好的鉬酸銨［（NH4）6Mo7O24·4H2O］或氯化鎘（CdCl2）按綿羊體重（BW）使用一次性胃管導(dǎo)服。根據(jù)課題組前期研究確定試驗(yàn)動(dòng)物攻毒劑量［12］，鉬組染毒劑量為：45 mg·kg-1 BW（以Mo元素計(jì)），鎘組染毒劑量為：1 mg·kg-1 BW （以Cd元素計(jì)），鉬、鎘聯(lián)合組接毒劑量為：45 mg·kg-1 BW Mo+1 mg·kg-1 BW Cd，對照組給予相應(yīng)劑量蒸餾水，連續(xù)灌服75天。在試驗(yàn)第75 d，取血清樣品于-80℃保存?zhèn)溆茫⒃诩∪庾⑸溥^量的戊巴比妥進(jìn)行麻醉后，采集腎組織樣品進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.3" 腎功能指標(biāo)測定

使用全自動(dòng)生化分析儀（日立7600）配合對應(yīng)試劑盒，測定血清中CREA、UREA和UA含量。

1.4" 組織病理切片觀察

參考陳亞杰等［13］的方法進(jìn)行石蠟切片制作。將綿羊腎組織置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，并經(jīng)乙醇梯度脫水處理后溶于透明劑（二甲苯）中透明。將已透明的組織塊置于溶化的石蠟中，放入溶蠟箱中保溫，待石蠟完全浸入組織塊后進(jìn)行包埋。隨后，使用切片機(jī)進(jìn)行切片并在37℃溫度下烘片過夜。蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.5" 超微結(jié)構(gòu)觀察

各組取1 mm3的腎組織置于2.5%戊二醛溶液中固定，隨后將組織片置于1%四氧化鋨固定劑中，并用乙醇進(jìn)行梯度脫水處理。將脫水后的組織包埋在環(huán)氧樹脂中，固定后進(jìn)行染色。最后，在透射電子顯微鏡下觀察腎組織超微結(jié)構(gòu)變化。

1.6" 氧化應(yīng)激指標(biāo)測定

參考陳敬宜等［14］的方法，稱取一定質(zhì)量的腎組織，按質(zhì)量（g）∶體積（mL）=1∶9的比例，加入相應(yīng)量的生理鹽水并進(jìn)行勻漿處理。H2O2、CAT、MDA、GSH和GSH-Px指標(biāo)水平通過使用商品化試劑盒進(jìn)行測定，步驟嚴(yán)格參照試劑盒說明書，最終使用酶標(biāo)儀對各孔測定OD值進(jìn)行讀數(shù)。

1.7" 鐵離子水平測定

總鐵離子比色法測試試劑盒用于檢測綿羊腎組織中鐵離子水平，試驗(yàn)方法根據(jù)總鐵離子比色法測試試劑盒說明書進(jìn)行。將一定量的腎組織按質(zhì)量（g）∶體積（mL）=1∶9的比例加入生理鹽水，通過組織勻漿處理制成10%腎組織勻漿液，12 000×g離心10 min，取上清液備用。300 μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和樣本分別加入對應(yīng)的1.5 mL離心管中，隨后加入相應(yīng)試劑，混合均勻，37℃孵育40 min。將各管以12 000×g離心10 min，并取300 μL上清液加入酶標(biāo)板對應(yīng)孔中，在酶標(biāo)儀593 nm處測定各孔OD值。最后，通過公式計(jì)算相應(yīng)樣品中總鐵離子含量水平。

1.8" 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測定

取約0.1 g綿羊腎組織置于1 mL TRIzol試劑中并進(jìn)行勻漿處理，隨后通過TRIzol法對組織中的總RNA進(jìn)行提取，再根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（QuantStudio7 Flex Real-Time PCR）對cDNA進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)使用兩步法，反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 30 s；95℃ 10 s、60℃ 30 s，循環(huán)40次。以GAPDH為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCt法對結(jié)果進(jìn)行分析。使用Primer 5.0設(shè)計(jì)NCOA4、ACSL4、TFFR1、PTGS2、SLC7A11、GPX4、FTH1和GAPDH基因的引物（表1）。

1.9" 蛋白免疫印跡分析

取0.1 g腎組織置于RIPA裂解緩沖液孵育10 min。隨后，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒（索萊寶，中國）進(jìn)行蛋白定量。將相同量的蛋白樣品加入6倍SDS-PAGE裝載緩沖液中，煮沸10 min。將蛋白通過SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)印到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上后，使用5%脫脂乳對PVDF膜進(jìn)行封閉2 h處理，以及4℃孵育相應(yīng)一抗PTGS2（1∶1 000），GPX4（1∶1 000），SLC7A11（1∶2 000），F(xiàn)TH1（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000）過夜，室溫孵育二抗（1∶1 000）40 min，將PVDF膜置于成像儀上滴加顯影液成像。使用ImageJ軟件分析條帶的灰度值。

1.10" 數(shù)據(jù)分析

Excel 2022和SPSS 22.0軟件用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，使用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行作圖。所有統(tǒng)計(jì)分析均通過單因素方差分析和最小顯著差異檢驗(yàn)計(jì)算，用皮爾森相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)變量之間的相關(guān)性。Plt;0.05作為顯著差異的標(biāo)準(zhǔn)。

2" 結(jié)" 果

2.1" 鉬鎘及其聯(lián)合暴露致綿羊腎組織損傷

試驗(yàn)第75天，綿羊血清生化腎功能指標(biāo)如圖1A～1C所示。與Control組相比，Mo組和Cd組血清CREA和UREA水平均顯著升高（Plt;0.01或Plt;0.05）。Mo+Cd組血清CREA、UREA和UA水平顯著（Plt;0.01或Plt;0.05）高于Control組。Mo組和Cd組血清CREA水平顯著低于Mo+Cd組（Plt;0.05）。通過光學(xué)顯微鏡觀察75 d綿羊腎組織病理學(xué)變化，如圖1D所示。Control組腎組織病理學(xué)未見異常，腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)完整。Mo組、Cd組和Mo+Cd組，腎小管上皮細(xì)胞變性腫脹、結(jié)構(gòu)模糊和溶解，在細(xì)胞質(zhì)中有微小的紅色顆粒和空泡，表現(xiàn)出顆粒變性、空泡變性和壞死。此外，腎小管管腔內(nèi)有粉紅色著染的絲縷樣成分，部分腎小球及間質(zhì)內(nèi)紅細(xì)胞數(shù)量增多。

2.2" 鉬鎘及其聯(lián)合暴露致綿羊腎氧化應(yīng)激及鐵離子水平變化

試驗(yàn)第75天，綿羊腎氧化應(yīng)激指標(biāo)及鐵離子水平變化如圖2所示。與Control組相比，Cd組和Mo+Cd組中H2O2、MDA和Fe離子含量顯著升高（Plt;0.01或Plt;0.05）；與單獨(dú)Mo組、Cd組相比，Mo+Cd組腎組織中H2O2和Fe離子含量上升但差異不顯著（P＞0.05），而MDA含量顯著升高（Plt;0.01）。此外，鉬鎘及其聯(lián)合暴露顯著降低了CAT和GSH-Px活力、GSH含量（Plt;0.01或Plt;0.05），且與單獨(dú)Mo組、Cd組相比，Mo+Cd組GSH含量顯著降低（Plt;0.01或Plt;0.05）。與此同時(shí)，與Cd組相比，Mo+Cd組CAT和GSH-Px活力顯著降低（Plt;0.01或Plt;0.05）。

2.3" 鉬鎘及其聯(lián)合暴露誘導(dǎo)綿羊腎組織鐵死亡

通過透射電鏡觀察腎組織超微結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果如圖3所示。Control組超微結(jié)構(gòu)觀察未見異常，線粒體結(jié)構(gòu)完整，而Mo組、Cd組和Mo+Cd組線粒體體積變小且出現(xiàn)嵴模糊和空泡化。

腎組織鐵死亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平變化如圖4所示。與Control組相比，Mo組、Cd組和Mo+Cd組NCOA4、ACSL4、TFR1和PTGS2基因mRNA表達(dá)水平顯著升高（Plt;0.05），且NCOA4、ACSL4、TFR1和PTGS2基因mRNA表達(dá)水平在單獨(dú)Mo和Cd組中顯著低于Mo+Cd組（Plt;0.01或Plt;0.05）。此外，與Control組相比，Mo組、Cd組和Mo+Cd組SCL7A11、GPX4和FTH1基因mRNA表達(dá)水平顯著降低（Plt;0.01或Plt;0.05）。并且Mo+Cd組相比于單獨(dú)Mo組和Cd組，SCL7A11、GPX4和FTH1基因mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)顯著降低變化（Plt;0.01或Plt;0.05）。

進(jìn)一步檢測鐵死亡相關(guān)因子蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如圖5所示。與Control組相比，Mo組、Cd組和Mo+Cd組PTGS2基因蛋白表達(dá)水平顯著升高（Plt;0.01或Plt;0.05），而SLC7A11、GPX4和FTH1基因蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0.01或Plt;0.05）。與此同時(shí)，Mo+Cd組相較于單獨(dú)Mo組和Cd組，PTGS2蛋白表達(dá)水平顯著升高（Plt;0.05），而SLC7A11、GPX4和FTH1蛋白表達(dá)水平顯著降低（Plt;0.01或Plt;0.05）。

2.4" 氧化應(yīng)激指標(biāo)和鐵死亡指標(biāo)變化相關(guān)性分析

氧化應(yīng)激指標(biāo)與鐵死亡指標(biāo)變化相關(guān)性分析結(jié)果如圖6所示。氧化損傷相關(guān)指標(biāo)（H2O2和MDA）和Fe離子含量與鐵死亡相關(guān)因子（NCOA4、ACSL4、TFR1和PTGS2）水平呈正相關(guān)，而與鐵死亡相關(guān)因子（GPX4、FTH1和SLC7A11）水平呈負(fù)相關(guān)。抗氧化相關(guān)指標(biāo)（GSH、GSH-Px和CAT）與鐵死亡相關(guān)因子（NCOA4、ACSL4、TFR1和PTGS2）水平呈負(fù)相關(guān)，而與鐵死亡相關(guān)因子（GPX4、FTH1和SLC7A11）水平呈正相關(guān)。

3" 討" 論

鎘是一種廣泛存在于環(huán)境中的重金屬，長期攝入會對動(dòng)物機(jī)體造成一定的損傷。鉬是一種微量營養(yǎng)素，過量攝入也會引起機(jī)體損傷。腎作為鉬、鎘毒性損傷的重要靶器官，常在鉬、鎘暴露下表現(xiàn)出較為明顯的病理變化。丁小麗等［15］的研究表明，低鎘暴露提高大鼠腎功能相關(guān)血清生化指標(biāo)（CREA、UREA和UA），提示鎘暴露能夠引起大鼠腎功能損傷。宋超［16］的研究表明，過量的鉬攝入同樣能夠引發(fā)綿羊腎功能指標(biāo)（CREA和UREA）升高，提示高鉬對綿羊腎臟造成損傷。與此同時(shí)，鉬、鎘聯(lián)合暴露毒性具有生物放大效應(yīng)，與單獨(dú)鉬或鎘的暴露相比能進(jìn)一步造成腎小管上皮細(xì)胞的損傷［17］。本研究結(jié)果顯示，鉬、鎘及其聯(lián)和暴露能夠引發(fā)綿羊腎功能血清生化相關(guān)指標(biāo)（CREA、UREA和UA）水平升高，且與單獨(dú)鉬或鎘處理相比，鉬鎘聯(lián)合處理造成的腎功能指標(biāo)提升更為明顯，表明鉬鎘及其聯(lián)合暴露能夠引發(fā)綿羊腎功能障礙。為進(jìn)一步確認(rèn)鉬鎘及其聯(lián)合暴露是否引發(fā)綿羊腎損傷，本研究通過對綿羊腎組織HE切片染色進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。前人研究表明，鎘暴露能夠?qū)е履I小管上皮細(xì)胞變性、腫脹并出現(xiàn)顆粒變性和空泡變性以及腎小球充血［9，18］。本研究顯示，鉬鎘及其聯(lián)合暴露引發(fā)腎小管上皮細(xì)胞變性、腫脹、結(jié)構(gòu)模糊和溶解，出現(xiàn)顆粒變性、空泡變性和壞死，且腎小管管腔內(nèi)有粉紅色著染的絲縷樣成分，部分腎小球及間質(zhì)內(nèi)紅細(xì)胞數(shù)量增多，提示綿羊腎組織在鉬、鎘及其聯(lián)合暴露下出現(xiàn)組織損傷。

大量研究表明，腎組織損傷往往伴隨著氧化應(yīng)激的出現(xiàn)［19-20］。氧化應(yīng)激通過自由基反應(yīng)鏈引發(fā)多種有害反應(yīng)，如脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)氧化、核酸氧化等，能夠進(jìn)一步加劇細(xì)胞損傷并影響細(xì)胞的正常生理功能。其中，H2O2、CAT、MDA、GSH、GSH-Px是評價(jià)氧化應(yīng)激狀態(tài)的生物標(biāo)志物。H2O2是氧化應(yīng)激過程中常見的一種氧化劑，是細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)中產(chǎn)生的重要中間體，而CAT和GSH-Px能夠催化H2O2生成水和氧氣，進(jìn)而緩解氧化應(yīng)激的發(fā)生。MDA則是脂質(zhì)過氧化的毒性代謝產(chǎn)物，其含量水平能夠反映氧化損傷程度。GSH-Px能夠特異性催化GSH與氧化物質(zhì)反應(yīng)，從而保護(hù)生物膜免受氧化物質(zhì)的損害，維持細(xì)胞的正常功能。研究表明，鎘能夠促進(jìn)H2O2和MDA含量水平的升高，且降低GSH含量及CAT和GSH-Px活力，從而誘發(fā)氧化應(yīng)激［21-22］。本研究顯示，在單獨(dú)鉬或鎘及其聯(lián)合處理下，綿羊腎組織中H2O2和MDA含量升高，GSH含量降低以及CAT和GSH-Px活力下降，且鉬鎘共處理下指標(biāo)變化更為顯著。因此，該結(jié)果揭示鉬、鎘及其聯(lián)合暴露能夠引起綿羊腎組織氧化應(yīng)激。

氧化應(yīng)激與鐵死亡的發(fā)生和發(fā)展在腎損傷中展現(xiàn)出緊密的聯(lián)系［23］。鐵死亡是一種鐵依賴性的，以細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物堆積為典型特征的細(xì)胞死亡方式。鐵死亡參與了鎘誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞死亡［24］，且在氧化應(yīng)激過程中，鐵離子的積累可通過芬頓反應(yīng)和鐵依賴性酶產(chǎn)生大量的活性氧，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)加劇，進(jìn)而誘導(dǎo)鐵死亡的發(fā)生［25］。研究表明，鎘暴露以劑量依賴性方式引發(fā)腎小管上皮細(xì)胞鐵過載，并進(jìn)一步誘發(fā)鐵死亡［24］。本研究顯示，鉬、鎘及其聯(lián)合暴露能夠引起綿羊腎組織總鐵離子含量水平升高，且鉬、鎘聯(lián)合暴露下更為明顯，提示鉬、鎘及其聯(lián)合暴露能夠引發(fā)綿羊腎組織鐵過載，并可能誘發(fā)鐵死亡。前人研究表明，線粒體體積變小、嵴模糊和空泡化是細(xì)胞鐵死亡的生物標(biāo)志［26］。本研究顯示，鉬鎘及其聯(lián)合處理致綿羊腎組織線粒體體積變小、嵴模糊和空泡化，提示鉬鎘及其聯(lián)合可能通過鐵死亡致綿羊腎損傷。在鐵死亡進(jìn)程中，NCOA4作為一種胞質(zhì)自噬受體，通過與FTH1結(jié)合誘發(fā)鐵蛋白自噬，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鐵含量水平穩(wěn)態(tài)。同時(shí)，TFR1作為轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，通過與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合使細(xì)胞攝入外源性鐵，調(diào)控細(xì)胞的鐵離子代謝進(jìn)程。此外，ACSL4調(diào)控進(jìn)入細(xì)胞中的亞鐵離子發(fā)生芬頓反應(yīng)，使多不飽和脂肪酸生成脂質(zhì)過氧化物，導(dǎo)致生物膜結(jié)構(gòu)損傷并誘發(fā)鐵死亡［27］。GPX4通過催化反應(yīng)將脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物還原，即脂質(zhì)過氧化物轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的脂質(zhì)羥基，從而保護(hù)細(xì)胞膜的完整性和功能。SLC7A11是胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的組成成分，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)GSH的合成，進(jìn)而影響細(xì)胞氧化應(yīng)激水平和鐵死亡進(jìn)程。與此同時(shí)，大量研究表明PTGS2水平變化與鐵死亡進(jìn)程存在密切的聯(lián)系［28-29］。前人研究表明，鎘能夠通過促進(jìn)NCOA4、ACSL4、TFR1和PTGS2基因表達(dá)水平，抑制SLC7A11、GPX4和FTH1基因表達(dá)水平，從而誘發(fā)鐵死亡［24，30］。本研究中，鉬、鎘及其聯(lián)合暴露能夠引發(fā)綿羊腎組織NCOA4、ACSL4、TFR1和PTGS2基因表達(dá)水平上升，SLC7A11、GPX4和FTH1基因表達(dá)水平降低，提示綿羊腎細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。

4" 結(jié)" 論

綜上所述，鉬、鎘及其聯(lián)合暴露能夠誘發(fā)綿羊腎氧化應(yīng)激和鐵死亡，并引起腎組織損傷，且鉬鎘毒性具有協(xié)同效應(yīng)。

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（編輯" 范子娟）