多糖作為活性生物大分子已經(jīng)受到人們的廣泛關(guān)注。海欖雌作為民間用藥具有多種藥理活性，但對(duì)其多糖研究一直鮮有報(bào)道。對(duì)海欖雌葉多糖的提取、結(jié)構(gòu)解析和抗氧化活性等進(jìn)行研究，為有效開發(fā)和利用其藥理活性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。通過(guò)水提醇沉得到海欖雌葉中的多糖，高效液相色譜分析其單糖組成，紅外光譜分析其官能團(tuán)，研究其抗氧化活性。液相色譜顯示單糖組成為：甘露糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、葡萄糖、D-半乳糖和阿拉伯糖。紅外光譜表明內(nèi)含吡喃糖環(huán)和α-糖苷鍵。以VC為對(duì)照，在濃度200μg/mL時(shí)，海欖雌葉多糖對(duì)DPPH的清除率為86.53%，表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。

廣東省湛江市沿海灘涂生產(chǎn)大片紅樹林群落，海欖雌是紅樹林生態(tài)系統(tǒng)的主要品種。長(zhǎng)期受周期性潮水浸淹，其環(huán)境的特殊性（高鹽度，高壓，低氧，避光），使得其與陸地生物相比有著巨大的差異，往往能夠產(chǎn)生一些化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎、生物活性多樣且顯著的藥物先導(dǎo)化合物，為新藥研究與開發(fā)提供了大量的模式結(jié)構(gòu)和藥物前體[1]。國(guó)內(nèi)外研究都集中在其生態(tài)特性上，對(duì)于海欖雌藥理活性成分的研究還較少。海欖雌作為民間用藥在哮喘、風(fēng)濕、潰瘍等疾病治療上都有功效[2-8]。

植物多糖在國(guó)內(nèi)已經(jīng)有很多報(bào)道，作為植物體中生物活性分子，其是由多個(gè)單糖分子脫水縮合而成的，以糖苷鍵相連接串聯(lián)成大分子，常具有三維結(jié)構(gòu)，具有多種生物活性，能預(yù)防疾病，抗衰老和增強(qiáng)免疫力[9]。然而對(duì)于海欖雌葉多糖還未見系統(tǒng)報(bào)道，本文首次對(duì)海欖葉多糖進(jìn)行提取，并對(duì)其結(jié)構(gòu)和活性進(jìn)行研究。水提醇沉法試劑便宜、工序簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備要求不高[10]。因此，本文采用水提醇沉法提取得到的海欖雌葉粗多糖。多糖的脫蛋白方法主要有Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法等。最常用的方法是Sevag法，是將正丁醇、氯仿按照一定的比例相互混勻，再以一定比例混合于多糖溶液中，離心除去混合液中的蛋白沉淀絮狀物[11]。三氟三氯乙烷法效率更高，但因?yàn)殡y揮發(fā)等缺點(diǎn)限制了它的應(yīng)用[12]。張萍等[13]建立了一種柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定石榴皮多糖的單糖組成分析方法，結(jié)果揭示本法測(cè)定單糖的線性范圍寬、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高，測(cè)得石榴皮多糖組分含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖等7種單糖。何源等[14]研究3種鹿茸多糖，紅外光譜顯示均具有典型的多糖結(jié)構(gòu)，2 930 cm-1附近的CH的拉伸和彎曲振動(dòng)吸收峰是多糖的特征吸收峰，次峰出現(xiàn)在2 854 cm-1處，表明存在亞甲基并含有硫酸根基團(tuán)，屬糖胺聚糖。何婷婷等[15]利用紅外光譜表征蒲公英多糖為β-吡喃糖，1 072、779、618、541 cm-1為吡喃糖特征吸收峰之一。蔣文明等[16]通過(guò)提取椰子皮多糖，并對(duì)其生物活性進(jìn)行研究，體外抗氧化試驗(yàn)表明，椰子皮多糖對(duì)ABTS+自由基、DPPH自由基和O2-均有一定的清除效果，隨著椰子皮多糖濃度的增加清除能力逐漸增強(qiáng)。趙賽蕾等[17]總結(jié)了山藥多糖能清除活性氧，通過(guò)減少自由基進(jìn)而延緩衰老和抗氧化。蔡永萍等[18]揭示薏苡仁多糖具有良好的抗氧化能力，對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制能力效果明顯，并且隨著濃度的增加，抑制率增加。

據(jù)此，本論文通過(guò)95%乙醇提取得到的海欖雌葉多糖，水提醇沉得到海欖雌葉中的多糖，高效液相色譜法研究其單糖組成，紅外光譜揭示其官能團(tuán)，DPPH清除實(shí)驗(yàn)研究其抗氧化活性，為海欖雌藥用價(jià)值開發(fā)利用提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

以湛江市南三島沿海采集的新鮮海欖雌葉條為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。裁剪新鮮碧綠的海欖雌葉，初步自然曬干，然后放入50℃恒溫烘箱烘干后，分別粉碎至40目大小，在干燥環(huán)境中保存?zhèn)溆?。所用試劑與藥物：95%乙醇、丙酮、無(wú)水乙醇、PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）、三氟乙酸（TFA）、氫氧化鈉、甲醇、鹽酸、氯仿、DPPH藥品、磷酸二氫鈉、乙腈、D-葡萄糖醛酸、D-（+）-半乳糖醛酸、阿拉伯糖、無(wú)水葡萄糖、甘露糖、D-半乳糖、木糖、鼠李糖、維生素Vc（廣州賽國(guó)生物科技有限公司）。實(shí)驗(yàn)所用藥物和試劑除D-葡萄糖醛酸、D-（+）-半乳糖醛酸、巖藻糖、阿拉伯糖、無(wú)水葡萄糖、甘露糖、D-半乳糖、木糖、鼠李糖（上海研域生物科技有限公司）為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品外，其余均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

RD-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）色譜柱（中譜紅）、沃特世2695高效液相色譜儀、CF12RX（日本日立）多用途冷凍離心機(jī)、754N紫外可見分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）、AUW220D電子分析天平（日本島津）、真空干燥箱、冰箱等儀器設(shè)備。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1多糖成分的提取

將打碎過(guò)篩后得到的海欖雌葉粉末稱重后，平均分成3份，每份2 kg，分別填充至10 L蒸餾瓶?jī)?nèi)，加入5 L超純水浸泡2 h，然后于80℃條件下蒸餾提取2 h，重復(fù)該過(guò)程1次，將2次提取所得溶液混合后于2 000 rpm、10 min條件下離心，去除海欖雌葉粉末殘?jiān)?，將上清液真空濃縮至100 mL。對(duì)應(yīng)加入4倍體積的95%濃度乙醇進(jìn)行沉淀；沉淀完全后于2 000 rpm、10 min條件下離心收集絮狀物，并分別用300 mL去離子水復(fù)溶，真空濃縮除去殘余乙醇，再將殘留液于2 000 rpm、10 min條件下離心除去不溶物；上清液真空濃縮，冷凍干燥后，依次用丙酮和無(wú)水乙醇洗滌3遍，最后一次洗滌后，置于通風(fēng)櫥內(nèi)讓殘余的有機(jī)試劑自然揮發(fā)，待有機(jī)試劑揮發(fā)完后，提取到的海欖雌葉多糖（YAM），收集多糖固體，稱重備用。

1.3.2高效液相色譜法測(cè)定單糖組成

利用PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）柱前衍生化高效液相色譜法測(cè)定單糖組成。

1.3.2.1樣品的完全酸水解

稱取2 mg YAM固體，分別加到具塞試管中，之后加入2 mL 2 mol/L的三氟乙酸（TFA），120℃下油浴4 h，將酸水解后所得樣品溶液轉(zhuǎn)于蒸餾瓶?jī)?nèi)，加入10 mL甲醇溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，此操作重復(fù)2次，去除TFA。用1 mL去離子水溶解，待衍生化。

1.3.2.2 PMP衍生化

分別吸取100μL的YAM水解液放入試管中，再分別取50μL 0.3 mol/L的NaOH溶液和0.5 mol/L PMP甲醇溶液混勻，70℃下水浴30 min，自然冷卻10 min。加入50μL 0.3 mol/L HCl中和，再加入1 mL氯仿萃取3次，上層為水層，加100μL超純水混勻稀釋，0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾后待進(jìn)樣。

1.3.2.3 9種單糖標(biāo)準(zhǔn)品混合液的衍生化

取2 mmol/L單糖標(biāo)準(zhǔn)品D-葡萄糖醛酸、D-（+）-半乳糖醛酸、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、D-半乳糖、木糖、鼠李糖和巖藻糖各50μL，分別加入0.5 mol/L 50μL PMP甲醇溶液和0.3 mol/L 50μL NaOH溶液，70℃下水浴30 min，自然冷卻10 min。加入50μL 0.3 mol/L HCl中和，再加入1 mL氯仿萃取3次，上層為水層，加100μL超純水混勻稀釋，待進(jìn)樣。

1.3.2.4進(jìn)樣分析

液相色譜條件：色譜柱：中譜紅RD-C18（250 nm×4.6 nm，5μm）；流動(dòng)相：0.1 mol/L磷酸鹽（pH 6.7）、緩沖液-乙腈（體積比為83∶17）；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；流速：1 mL/min；進(jìn)樣體積：20μL。

1.3.3紅外光譜分析

取一定量干燥的多糖樣品，與干燥KBr粉末混勻后壓片，在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描，記錄紅外光譜圖。

1.3.4海欖雌葉多糖對(duì)DPPH的清除率測(cè)定

取多糖母液和VC母液，分別制得不同濃度2.5、5、10、20、50、75、100μg/mLYAM的多糖溶液和VC溶液，然后分別對(duì)應(yīng)吸?。簻y(cè)定管：0.5 mL多糖溶液+3.5 mLDPPH液；空白管：0. 5 mL蒸餾水+3.5 mLDPPH液。渦旋混勻，在黑暗處放置30 min，1 cm光徑，517 nm，95%乙醇調(diào)零，測(cè)定各管吸光度值。通過(guò)下式計(jì)算海欖雌葉多糖對(duì)DPPH的清除率，結(jié)果如表1。

其中Y表示DPPH清除率，A1為測(cè)定管的吸光度，A0為空白管的吸光度。

2.2紅外結(jié)果分析

紅外結(jié)果如見圖3所示。在400～4 000 cm-1得到如下的吸收峰：3 271、2 928、1 745、1 463、1 085、1 023、931、716、624、504 cm-1。各峰歸屬如下：3 271 cm-1處的峰信號(hào)強(qiáng)且寬，為O-H伸縮振動(dòng)引起的。2 928 cm-1出現(xiàn)的吸收峰為CH2或者CH3的C-H的伸縮振動(dòng)。1 745 cm-1為乙酰胺基（-NHCOCH3）的C=O伸縮振動(dòng)，說(shuō)明多糖是一種含氨基的糖綴合物。1 463 cm-1處的吸收峰可能是C-H的變角運(yùn)動(dòng)引起的，1 085和

2結(jié)果分析

2.1單糖組成分析

高效液相色譜結(jié)果顯示如見圖1，各單糖分離度好，峰型尖銳，從左往右依次為甘露糖（19.636）、鼠李糖（26.763）、D -葡萄糖醛酸（30.328）、D -半乳糖醛酸（34.932）、葡萄糖（40.815）、D-半乳糖（46.337）、木糖（48.644）、阿拉伯糖（50.508）、巖藻糖（57.520）。海欖雌葉多糖液相色譜結(jié)果如見圖2，顯示該多糖由甘露糖（19.596）、鼠李糖（26.715）、D -半乳糖醛酸（34.859）、葡萄糖（40.728）、D-半乳糖（46.236）和阿拉伯糖（50.481）組成，摩爾比為1∶2∶1∶2∶1∶1。葡萄糖含量最高，甘露糖酸含量最低，單糖組成往往與多糖的生物活性息息相關(guān)。

1 023 cm-12處的吸收峰預(yù)示多糖內(nèi)含由于吡喃糖環(huán)。931 cm-1說(shuō)明多糖可能含有β-D吡喃葡萄糖環(huán)。716 cm-1是α-吡喃環(huán)的彎曲振動(dòng)特征峰，表示多糖結(jié)構(gòu)中有α-糖苷鍵。584 cm-1則是O-H外平面振動(dòng)峰[19-21]。

2.3 DPPH清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，表明海欖雌葉多糖具有良好的清除DPPH自由基的活性，且隨著濃度的增加，對(duì)DPPH自由基的清除率呈上升趨勢(shì)，在濃度50 ug/mL時(shí)，清除活性達(dá)到85%左右，隨著濃度增加，清除活性趨于平緩。濃度增加，清除活性趨于平緩。

3結(jié)論與討論

隨著醫(yī)藥技術(shù)的不斷發(fā)展，生物醫(yī)藥開發(fā)不再滿足于已收錄的藥用植物名錄，海欖雌作為中國(guó)分布面積最大的紅樹林植物種類，研究其天然活性成分，充分挖掘其利用功能，有利于拓寬植物資源的開發(fā)利用范圍，創(chuàng)造新的生物制藥。海欖雌對(duì)多種疾病的治療存在良好藥效，多糖作為植物體中的主要活性成分，對(duì)海欖雌葉進(jìn)行多糖提取，分析其多糖結(jié)構(gòu)及研究其體外抗氧化活性，更利于探究海欖雌的藥用價(jià)值，對(duì)提高海欖雌整株的利用率具有重要意義。

本論文采用95%乙醇對(duì)海欖雌葉的多糖進(jìn)行提取，利用PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）柱前衍生化高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定其單糖組成，結(jié)果表明單糖組成為：甘露糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、葡萄糖、D-半乳糖和阿拉伯糖組成。紅外光譜說(shuō)明多糖是一種含氨基的糖綴合物，內(nèi)含由于吡喃糖環(huán)、β-D吡喃葡萄糖環(huán)和α-糖苷鍵。通過(guò)DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)，表明海欖雌葉多糖具有一定的抗氧化活性，為海欖雌的提取及進(jìn)一步加工利用提供了一定的科學(xué)理論依據(jù)。

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基金項(xiàng)目：海南省自然科學(xué)基金（221QN0923）[1中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所陳吳海，羅成，葉劍芝（通信作者）；2云南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶作物學(xué)院熊玉民，謝宇欣，楊佳麗]