摘 要：繭絲中的多酚含量是進(jìn)行繭絲身份溯源的重要依據(jù)。以繭絲多酚含量的定量測(cè)定為研究對(duì)象，通過響應(yīng)面優(yōu)化法建立了由Folin酚比色法定量檢測(cè)繭絲多酚含量的方法，同時(shí)考察了Folin酚試劑的用量、Na2CO3溶液的用量、反應(yīng)時(shí)間及檢測(cè)波長對(duì)繭絲多酚含量測(cè)定的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化繭絲多酚的檢測(cè)條件。結(jié)果表明：繭絲多酚的最適檢測(cè)條件為1.1 mL的Folin酚溶液用量、0.65 mL的Na2CO3溶液用量、32 min的反應(yīng)時(shí)長和760 nm的檢測(cè)波長。文章建立的方法具有較好的重復(fù)性和重現(xiàn)性，且穩(wěn)定性高，準(zhǔn)確可靠，成本低廉，可用于桑蠶繭和生絲產(chǎn)品中多酚含量的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：繭絲；多酚；單因素；Folin酚法；響應(yīng)面優(yōu)化法

中圖分類號(hào)：TS102.33

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1009-265X（2024）11-0055-07

繭絲中的微量多酚類成分源于桑葉［1-2］，受蠶繭產(chǎn)地、季節(jié)、蠶種及繅絲加工方式等因素的影響，其含量通常能夠反映生絲來源地的特征差異。因此，繭絲中的多酚類組成及含量是進(jìn)行繭絲身份溯源的重要“密碼”。王聰磊等［3］在利用液相色譜分析烘繭、煮繭加工條件對(duì)蠶繭微量組分的影響后，發(fā)現(xiàn)加工條件對(duì)繭絲中的多酚類組分含量影響顯著，多酚的含量水平可作為判定生絲樣品是否經(jīng)過烘繭加工的依據(jù)，這對(duì)鮮繭生絲和干繭生絲樣品檢測(cè)方法的開發(fā)具有重要啟示。在繭絲多酚含量的測(cè)試方法中，基于多酚類物質(zhì)的色譜指紋圖譜能夠?qū)崿F(xiàn)鮮繭繅制生絲和干繭繅制生絲產(chǎn)品的鑒別［4］。然而，傳統(tǒng)的液相色譜指紋圖譜分析樣品效率較低、成本偏高。因此，探索新的低成本檢測(cè)方法在鮮繭/干繭生絲商業(yè)檢測(cè)方面意義重大。

目前，多酚含量的檢測(cè)方法主要有Folin酚法、香草醛-硫酸法和普魯士藍(lán)法等［5］，其中Folin酚法因?yàn)椴僮骱唵?、測(cè)試快速、精確度和穩(wěn)定性良好等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用［5-6］。由于生絲樣品的多酚類物質(zhì)組成復(fù)雜，且含量較少，難以精確檢測(cè)［7-8］，所以目前關(guān)于生絲中微量組分測(cè)定的研究多停留在定性層面，尚未建立起有效測(cè)定生絲中微量組分含量的方法。若選用Folin酚法檢測(cè)生絲中的多酚含量，由于測(cè)試條件對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響顯著，尤其是Folin酚化學(xué)顯色反應(yīng)［5-6］，因此有必要詳細(xì)研究Folin酚比色法檢測(cè)繭絲多酚含量的最優(yōu)條件。

本文以繭絲多酚類組分與Folin酚試劑反應(yīng)的工藝參數(shù)為研究對(duì)象，深入探討檢驗(yàn)波長、Folin酚試劑用量、催化劑Na2CO3用量及反應(yīng)時(shí)間等因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化反應(yīng)條件，以此建立基于Folin酚比色法定量檢測(cè)生絲中多酚含量的優(yōu)化方法。本文所建立的方法對(duì)繭絲中多酚含量的檢測(cè)具有顯著的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)于降低繭絲溯源的檢測(cè)成本、提升檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與實(shí)驗(yàn)儀器

材料：實(shí)驗(yàn)所用蠶繭購自浙江海寧，蠶種為白玉×秋豐，鮮繭生絲和干繭生絲（湖州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測(cè)研究院提供）。Folin酚溶液（分析純，1.0 mol/L）和碳酸鈉（分析純，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%）購置于阿拉丁試劑有限公司。

儀器：UV-1800PC雙光束紫外可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司），RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮儀器有限公司），JSP-80A超聲波清洗機(jī)（深圳市潔泰超聲洗凈設(shè)備有限公司）。

1.2 繭絲多酚的提取

參考王聰磊等［9］建立的繭絲多酚提取方法來提取繭絲中的多酚：將蠶繭剝繭去蛹，繭殼均勻剪至1 mm大小的粉末，稱取2.0 g放入燒杯并加入去離子水（浴比為1∶25）。待繭絲完全浸潤后放入超聲清洗機(jī)，于40 ℃、200 W超聲功率下超聲處理90 min后進(jìn)行抽濾，獲得繭絲多酚提取液。將提取液于50 ℃下蒸干后加入1 mL去離子水重新溶解提取物。充分溶解后，用0.22 μm濾膜對(duì)溶液再次過濾，所得提取液備用。

1.3 Folin酚顯色反應(yīng)試驗(yàn)

按下述步驟確定Folin酚法分析繭絲多酚含量的顯色反應(yīng)條件：

a）Folin酚試劑用量探究：取7份0.6 mL上述繭絲多酚提取液，分別加入0.20～1.40 mL的Folin酚試劑攪拌均勻，再向上述混合液中加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Na2CO3溶液，然后在40 ℃水浴中避光反應(yīng)30 min。用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)試反應(yīng)溶液在可見光波段的最大吸光度所對(duì)應(yīng)的波長。

b）Na2CO3溶液用量探究：移取8份0.6 mL的繭絲多酚提取液，加入（a）中已確定用量的Folin酚試劑攪拌混合均勻，然后分別加入0.5～3.0 mL質(zhì)量濃度為10%的Na2CO3溶液，后續(xù)操作如前所述，以此確定Na2CO3溶液的最佳用量。

c）避光反應(yīng)時(shí)間的探究：移取7份0.6 mL的繭絲多酚提取液，加入（a）中所確定用量的Folin酚試劑，再加入（b）中確定用量的溶液濃度為10%的Na2CO3溶液，超聲震蕩混勻后置于40 ℃水浴中進(jìn)行避光反應(yīng)。反應(yīng)時(shí)間分別為20～60 min。后續(xù)操作如前所述，最終確定最優(yōu)的避光反應(yīng)時(shí)間。

1.4 響應(yīng)曲面優(yōu)化方法

根據(jù)1.2中所得到的單因素實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面法Box-Behnken設(shè)計(jì)，選擇檢測(cè)波長、Folin酚試劑用量、Na2CO3溶液用量和反應(yīng)時(shí)間作為因素，按照表1中的因素和水平組合方式，進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)度優(yōu)化分析。利用Design Expert 13軟件對(duì)4因素3水平進(jìn)行響應(yīng)面分析，因素與水平設(shè)計(jì)見表1所示。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式擬合，得到回歸模型方程：

Y=0.4218+0.0078A-0.0022B-0.0123C+0.0127D+0.0005AB-0.0082AC-0.0012AD+0.0125BC-0.0005BD-0.0003CD+0.0039A2-0.0114B2-0.0171C2-0.0196D2

式中：A為檢測(cè)波長，nm；B為Folin酚用量，mol；C為Na2CO3溶液用量，mL；D為反應(yīng)時(shí)間，min。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素條件探究

a）檢測(cè)波長：繭絲多酚提取物主要成分為黃酮類化合物，其顏色通常呈現(xiàn)淡黃色。由于提取物中多酚含量較低、雜質(zhì)較多，因此多酚含量與提取液吸光度之間的線性關(guān)系并不顯著。通過化學(xué)顯色比色法進(jìn)行繭絲多酚含量的測(cè)定方法靈敏且專一，因此本實(shí)驗(yàn)采取此方法進(jìn)行多酚含量的測(cè)定。圖1（a）為繭絲多酚提取物與Folin酚試劑反應(yīng)后的可見光譜，由此可見在堿性環(huán)境下繭絲多酚與Folin酚試劑反應(yīng)后，吸光度在600～725 nm內(nèi)隨著檢測(cè)波長的增加而增大，并在725～745 nm范圍內(nèi)達(dá)到極值，之后吸光度隨著檢測(cè)波長的增大而下降。因此，生絲提取液顯色反應(yīng)的適宜檢測(cè)波長區(qū)間為725～745 nm。

b）Folin酚試劑用量：在堿性條件下，F(xiàn)olin酚能將繭絲中的酚類化合物還原成藍(lán)色物質(zhì)［10］，且Folin酚的用量顯著影響反應(yīng)產(chǎn)物的生成量，F(xiàn)olin酚用量對(duì)顯色反應(yīng)的影響如圖1（b）所示。當(dāng)Folin酚用量少于1.0 mL時(shí)，對(duì)應(yīng)產(chǎn)物的吸光度隨著Folin酚用量的增加而增大，而超過1.0 mL后繼續(xù)增加Folin酚用量，產(chǎn)物的吸光度不再變化。表明1.0 mL的Folin酚試劑可與0.6 mL多酚提取物完全反應(yīng)。考慮到不同地區(qū)、品種的繭絲中多酚含量偏高的情況，最終將Folin酚試劑的用量確定為1.2 mL。

c）Na2CO3溶液用量：Na2CO3作為催化劑和堿劑對(duì)顯色反應(yīng)有重要影響，其用量對(duì)顯色反應(yīng)結(jié)果的影響如圖1（c）所示。當(dāng)Na2CO3溶液用量小于0.8 mL時(shí)，顏色逐漸加深，但是當(dāng)Na2CO3溶液用量超過0.8 mL，產(chǎn)物的吸光度隨著Na2CO3溶液用量的增加而呈顯著下降趨勢(shì)，這可能是因?yàn)榧尤脒^多的Na2CO3溶液會(huì)使溶液環(huán)境的堿性變強(qiáng)，致使生成的藍(lán)色絡(luò)合物分解［10］。因此，Na2CO3溶液用量不宜過大，適宜的用量為0.8 mL。

d）避光反應(yīng)時(shí)間：避光反應(yīng)時(shí)長對(duì)Folin酚與繭絲多酚提取物顯色反應(yīng)的影響如圖1（d）所示。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間小于30 min，產(chǎn)物濃度隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而增加。30 min后，產(chǎn)物的吸光度值逐漸下降，這是因?yàn)樯傻乃{(lán)色絡(luò)合物不穩(wěn)定，長時(shí)間在堿性環(huán)境中易分解。綜合來看，反應(yīng)時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響較Folin酚和Na2CO3用量小，反應(yīng)時(shí)間控制在25～35 min，此時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物較穩(wěn)定，最優(yōu)反應(yīng)時(shí)間為30 min。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化分析

使用Box-Behnken模型對(duì)檢測(cè)波長、Folin酚試劑用量、Na2CO3溶液用量和反應(yīng)時(shí)間等影響顯色反應(yīng)結(jié)果的因素進(jìn)行分析，結(jié)果如表2所示。在4個(gè)因素不同水平的組合試驗(yàn)中，當(dāng)檢測(cè)波長為760 nm、Folin酚試劑用量為1.2 mL、Na2CO3溶液用量為0.6 mL、反應(yīng)時(shí)間為30 min時(shí)，反應(yīng)后溶液的吸光度值達(dá)到最大值0.440。

進(jìn)一步對(duì)組合試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面方差分析，結(jié)果如表3所示。模型的總體顯著性P值小于0.001，表明所建立的響應(yīng)面模型為極顯著水平，試驗(yàn)實(shí)際值和理論值偏差很小，得到的回歸模型能夠很好地地預(yù)測(cè)響應(yīng)值。P值（0.6102）大于0.5，為不顯著水平，說明實(shí)驗(yàn)缺少的擬合值不影響模型的構(gòu)建。考量4個(gè)因素的P值，檢測(cè)波長的P值（0.0006）小于0.001，為極顯著水平，說明檢測(cè)波長對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有明顯影響；Na2CO3溶液用量和反應(yīng)時(shí)間的P值小于0.001，同樣為極顯著水平；而Folin用量的P值（0.2403）大于0.05，為不顯著水平，說明當(dāng)Folin酚添加量在1.0～1.4 mL范圍內(nèi)時(shí)，F(xiàn)olin酚用量對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響小。

根據(jù)置信度F值大小探究了Folin酚顯色反應(yīng)各因素對(duì)產(chǎn)物產(chǎn)量的影響程度，結(jié)果表明各因素對(duì)產(chǎn)量影響的程度依次為D、C、A、B，即Na2CO3溶液用量對(duì)顯色反應(yīng)結(jié)果的影響最大，然后依次是反應(yīng)時(shí)間和檢測(cè)波長，而在Folin酚添加量1.0～1.4 mL的范圍內(nèi)，其用量對(duì)顯色反應(yīng)結(jié)果的影響不顯著。這說明在本反應(yīng)體系中，1.0 mL、1.0 mol/L的Folin酚已足量。

響應(yīng)面分析中曲面陡峭程度可反應(yīng)各因素交互對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響的顯著性。如圖2（a）、圖2（c）、圖2（e）和圖2（f）所示，當(dāng)交互因素的參數(shù)改變時(shí)，形成的響應(yīng)曲面較為平緩，說明反應(yīng)時(shí)間/Folin酚用量、檢測(cè)波長/反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)時(shí)間/Folin酚用量、反應(yīng)時(shí)間/Na2CO3溶液用量的交互參數(shù)變動(dòng)對(duì)顯色反應(yīng)結(jié)果的影響不顯著。但從圖2 （b）可以看出，檢測(cè)波長/Na2CO3溶液用量交互時(shí)曲面較陡，說明這兩個(gè)因素組合參數(shù)變動(dòng)時(shí)對(duì)顯色反應(yīng)結(jié)果影響較大。而由圖2（d）可以看出，F(xiàn)olin酚用量/Na2CO3用量的交互作用響應(yīng)曲面最為陡峭，說明這兩個(gè)因素組合對(duì)顯色反應(yīng)結(jié)果最為明顯，這與上述方差分析中的分析結(jié)果一致。

2.3 最優(yōu)條件的確認(rèn)與檢驗(yàn)

利用DesignExpert 13.0軟件對(duì)影響反應(yīng)結(jié)果的各因素進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3所示。最終得到繭絲多酚提取液與Folin酚顯色反應(yīng)的最佳條件為：檢測(cè)波長760 nm、Folin酚溶液用量為1.097 mL、Na2CO3溶液用量為0.642 mL、反應(yīng)時(shí)長為31.518 min。在該反應(yīng)條件下，產(chǎn)物的吸光度預(yù)測(cè)值為0.444，置信度為95%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.61%。為方便實(shí)際操作，將該最佳條件調(diào)整為：檢測(cè)波長為760 nm、Folin酚溶液用量為1.1 mL、Na2CO3溶液用量為0.65 mL、反應(yīng)時(shí)長為32 min。同時(shí)，對(duì)調(diào)整后的反應(yīng)條件進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度為0.442±0.0013，與實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)結(jié)果接近，且相對(duì)誤差僅為0.41%。這說明通過響應(yīng)曲面法優(yōu)化得出最優(yōu)反應(yīng)條件具有較高的準(zhǔn)確性，該方法可以用來確定Folin酚顯色反應(yīng)法測(cè)定繭絲中多酚含量的最優(yōu)條件。

2.4 方法的可靠性分析

重復(fù)性考察：按已確定的最適條件，將繭絲提取液分為5份，由同一分析人員依據(jù)本研究建立的顯色反應(yīng)條件進(jìn)行操作，反應(yīng)后在760 nm波長處讀取樣品吸光度，記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，結(jié)果見圖4（a）。該方法所測(cè)定的5份平行樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.59%，呈現(xiàn)出較好的重復(fù)性。

重現(xiàn)性考察：按已確定的最適條件，取繭絲提取液分為5份，由不同實(shí)驗(yàn)室，不同分析人員依據(jù)本研究建立的顯色反應(yīng)條件進(jìn)行操作，對(duì)最后得到數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果見圖4（b），發(fā)現(xiàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.72%，說明該顯色比色法呈現(xiàn)出較好的重現(xiàn)性。

穩(wěn)定性考察：按已確定的最適條件，取繭絲提取液1份，由同一分析人員依據(jù)本研究建立的顯色反應(yīng)條件進(jìn)行操作，反應(yīng)32 min后終止反應(yīng)，然后將反應(yīng)后0 、10、20、30 min和40 min的結(jié)果分別記為1#-5#試驗(yàn)結(jié)果。由圖4（c）可知，反應(yīng)后溶液的吸光度范圍為0.429～0.432，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.21%，說明試驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

本文研究了Folin酚比色法測(cè)定繭絲提取液中多酚含量的最佳檢測(cè)條件，在單因素分析的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法對(duì)檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化，并評(píng)價(jià)該方法的可靠性。主要結(jié)論如下：

a）Folin酚及Na2CO3溶液用量對(duì)顯色反應(yīng)結(jié)果影響顯著，其他因素間的交互作用對(duì)結(jié)果均無顯著影響。

b）Folin酚比色法檢測(cè)繭絲多酚的最佳條件：檢測(cè)波長760 nm、1.0 mol/L的Folin酚試劑的用量為1.1 mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Na2CO3溶液用量為0.65 mL、避光反應(yīng)時(shí)間32 min。

本文所建立的檢測(cè)方法穩(wěn)定可靠，具有較好的重復(fù)性、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

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Determination methods of polyphenol content from cocoon and silk by single factor combined response surface methodology

YANG" Juanya，" LIU" Weihong，" CHEN" Chaohong，" WANG" Zhenhua，" YE" Fei

（Huzhou Institute of Quality and Technical Supervision and Inspection， Huzhou 313000， China）

Abstract：

Cocoon silk contains approximately 2 wt% of polyphenols， and the residue of these polyphenols is closely related to some factors， such as producing area， variety， season， processing methods and so on. Therefore， we can know the identity of raw silk products by detecting the polyphenols residue in the silk. Currently， there is no reliable and accurate method for determining the polyphenol content in cocoon silk. In this study， a quantitative method for detecting the content of polyphenols in cocoon and silk using the Folin phenol colorimetric method through Response Surface Methodology （RSM） was established. The effects of the dosage of Folin phenol reagent， the dosage of Na2CO3 solution， reaction time， and detection wavelength on the determination of polyphenol content in cocoon and silk were investigated. On the basis of single factor experiments， the detection conditions of cocoon and silk polyphenols were further optimized through Box Behnken design. It is shown that the detection wavelength， reaction time and amount of Na2CO3 solution have significant influence on the quantification results， while the amount of Folin phenol solution within the range of 1.0 mL to 1.4 mL has insignificant influence on the result. According to the result of Box Behnken design trial， the optimal detection conditions for cocoon and silk polyphenols are： 1.1 mL of Folin phenol solution， 0.65 mL of Na2CO3 solution， 32 minutes of reaction time， and detection wavelength of 760 nm. This method has good repeatability and reproducibility， and high detection stability within 40 minutes. The proposed method is accurate， reliable and low-cost， and can be applied for the detection of the content of polyphenols in silk cocoons， raw silks and related silk products.

Keywords：

cocoon and silk; content of polyphenols; quantity; Folin-Ciocalteu method; Response Surface Me-thodology （RSM）

基金項(xiàng)目：湖州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2022GZ11）

作者簡介：楊娟亞（1989—），女，浙江湖州人，主要從事繭絲檢驗(yàn)方面的研究。

通信作者：葉飛，E-mail：375068051@qq.com