摘要" 為探究水草組織培養(yǎng)污染的污染源及藥物防治措施，本研究對(duì)水草組培污染防治實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練進(jìn)行教學(xué)設(shè)計(jì)，采用水草組織細(xì)胞培養(yǎng)課程與水草組培污染防治實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的教學(xué)模式，對(duì)教學(xué)目標(biāo)與教學(xué)內(nèi)容進(jìn)行探討，并分析實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及流程。以典型的水草紅絲青葉（Hygrophila polysperma）為對(duì)象進(jìn)行組織培養(yǎng)，通過從污染菌中進(jìn)行細(xì)菌和真菌的分離和純化，采用16S rDNA和ITS基因測(cè)序，并結(jié)合表型分析進(jìn)行種類鑒定，明晰了污染菌的種類。進(jìn)一步對(duì)污染菌開展防治藥物篩選，通過藥敏實(shí)驗(yàn)獲得了有效的藥物組合，加入培養(yǎng)基進(jìn)行組培培養(yǎng)基優(yōu)化，取得了一定的抗菌防治效果。該教學(xué)模式有利于學(xué)生熟練掌握水草組培污染防治技術(shù)原理、方案及應(yīng)用等，為水草擴(kuò)繁生產(chǎn)和相關(guān)科學(xué)研究培養(yǎng)專業(yè)人才。

關(guān)鍵詞" 組織培養(yǎng)；紅絲青葉；細(xì)菌；真菌；污染防治

中圖分類號(hào)" S451；G642.0" " " "文章編號(hào)" 1007-7731（2024）17-0105-04

DOI號(hào)" 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2024.17.025

Water Grass Tissue Culture Pollution Prevention and Control in experimental teaching reform

JIANG Bingyang" " CAO Guanglong" " LI Weijie" " ZHAO Zhenyang" " GUO Yaning" " WANG Mei

LIANG Mengting" " GUO Zhiyong" " GUAN Lianqing" " MA Wenwen" " LIU Minghui" " SUN Yanling

（School of Marine Science and Engineering， Qingdao Agricultural University， Qingdao 266237， China）

Abstract" To explore the pollution sources and drug prevention measures of water plant tissue culture pollution， teaching was designed for the experimental training of water grass tissue culture pollution prevention and control， a teaching model was adopted that combined water grass tissue cell culture courses with water grass tissue culture pollution prevention experiments， the teaching objectives and content were explored ， and the experimental content and process were analyzed. Tissue culture on typical common water plant Hygrophila polysperma were conducted， by isolating and purifying the contaminating bacteria， 16S rDNA and ITS gene sequencing were used in combination with phenotype analysis for species identification， clarifying the source of the contaminating bacteria. Further screening of prevention and control drugs for cotaminants was carried out， and effective drug combinations were obtained through drug sensitivity experiments. The addition of culture medium for tissue culture medium optimization achieved certain antibacterial and control effects. This course showed that this teaching model was beneficial for students to proficiently master the principles， schemes， and applications of water grass tissue culture pollution prevention and control technology， to cultivate professional talents for the expansion and production of aquatic plants and related scientific research.

Keywords" organizational development; Hygrophila polysperma; bacteria; fungus; pollution prevention

水草相較于陸地植物，根系欠發(fā)達(dá)，整體偏弱，組培難度較高，且培養(yǎng)基更容易出現(xiàn)污染菌，其中小水榕（Anubias barteri）[1]、雪花草（Hottonia inflata）[2]和小對(duì)葉（Rotala rotundifolia）[3]等均已見相關(guān)報(bào)道。已有報(bào)道主要傾向在陸生植物組培中發(fā)現(xiàn)污染菌，如細(xì)菌和真菌，其中細(xì)菌主要有芽孢桿菌屬（Bacillus）和假單胞菌屬（Pseudomonas）[4]，真菌主要有芽枝霉屬（Cladosporium）、曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillum）和酵母屬（Saccharomyces）[5]。目前關(guān)于水草組培過程中污染菌的種類暫不明確。在水草組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基的污染問題一直是該領(lǐng)域的技術(shù)盲區(qū)，大量組培苗因培養(yǎng)基前期被污染而使得種苗的繁殖受到影響。對(duì)于觀賞價(jià)值高、難以培養(yǎng)的名貴品種，其易在形成愈傷組織過程中受到不同菌類的污染，使組織培養(yǎng)難以繼續(xù)進(jìn)行。

水草組織細(xì)胞培養(yǎng)是水族科學(xué)與技術(shù)專業(yè)的一門拓展課程，主要對(duì)水草組織培養(yǎng)的基本原理、方法及應(yīng)用進(jìn)行介紹，讓學(xué)生掌握培養(yǎng)基的制備、外植體的接種、無菌培養(yǎng)及移栽等組織培養(yǎng)技術(shù)相關(guān)基礎(chǔ)操作。培養(yǎng)基中出現(xiàn)污染菌是導(dǎo)致水草組織培養(yǎng)失敗的主要原因之一，但有關(guān)污染菌的研究報(bào)道較少。

在組培過程中，微生物污染防治一直備受關(guān)注。本文對(duì)水草組培污染防治課程的實(shí)驗(yàn)教學(xué)進(jìn)行設(shè)計(jì)，以紅絲青葉（Hygrophila polysperma）為研究對(duì)象，對(duì)其組培過程中出現(xiàn)的典型污染菌進(jìn)行分離、純化和種類鑒定，并明確其各菌種的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，同時(shí)篩選相關(guān)防治藥物，優(yōu)化培養(yǎng)基，以有效控制組培過程中的污染，使水草組培過程得以順利進(jìn)行，成功培育出水草組培苗。

1 水草組培污染防治課程實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練教學(xué)設(shè)計(jì)

1.1 教學(xué)目標(biāo)

以解決水草組培過程中存在的污染為目標(biāo)，運(yùn)用理論課堂上學(xué)習(xí)的水草組培培養(yǎng)基制備，污染菌分離、鑒定，藥敏檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析等知識(shí)，熟練掌握水草組培污染菌分離、鑒定及藥物敏感性檢測(cè)的基本原理和操作步驟，鞏固該課程的理論基礎(chǔ)，直觀展示各種菌的分離及表型鑒定技巧，使學(xué)生更加了解污染源的種類與防治措施，加強(qiáng)對(duì)防治作用機(jī)理的理解，培養(yǎng)學(xué)生的綜合能力和科研探索精神。

1.2 教學(xué)內(nèi)容

在實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程中，詳細(xì)介紹組培污染源的分離、鑒定及藥物篩選的常規(guī)技術(shù)方法，以及其在組培培養(yǎng)基優(yōu)化中的應(yīng)用，并講解藥物防治的實(shí)驗(yàn)原理和相關(guān)注意事項(xiàng)。從方案的制訂到實(shí)驗(yàn)條件的摸索嘗試，從實(shí)驗(yàn)規(guī)程的講解到實(shí)踐操作，從理論知識(shí)復(fù)習(xí)到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理，讓學(xué)生參與實(shí)驗(yàn)的全過程，結(jié)合理論知識(shí)與實(shí)驗(yàn)操作，實(shí)現(xiàn)理論聯(lián)系實(shí)際。

2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及流程分析

2.1" 實(shí)驗(yàn)材料

紅絲青葉、MS（Murashige and skoog）培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato dextrose agar，PDA）、微生物培養(yǎng)基（Luria-bertani，LB）和大豆肉湯（Tryticase soy broth，TSB）瓊脂平板、75%乙醇、2%次氯酸鈉溶液、蔗糖、6-KT、IBA、乳酚棉藍(lán)（Lactophenol cotton blue，LPCB）溶液、FastPure?細(xì)菌DNA提取試劑盒（Vazyme，南京）、真菌DNA分離試劑盒（Solarbio，北京）、磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）、PCR反應(yīng)液、50 μg/mL卡那霉素（Kanamycin，Kan）、100 μg/mL氨芐西林（Ampicillin，Amp）、250 μg/mL紅霉素（Erythromycin，Ery）、200 μg/mL壯觀霉素（Spectinomycin，Spc）或25 μg/mL氯霉素（Chloramphenicol，Chl）、山梨酸鉀（Potassium sorbate，PS）、苯甲酸鈉（Sodium benzoate，SB）或雙乙酸鈉（Sodium diacetate，SD）溶液以及納米銀（Nanoscale silver，nano-Ag）。

2.2 實(shí)驗(yàn)原理

抗生素可以通過以下幾種途徑抑制或殺滅細(xì)菌。一是影響細(xì)菌細(xì)胞壁的合成；二是改變細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性；三是影響細(xì)菌細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成；四是抑制細(xì)菌核酸的合成。防腐劑通過抑制霉菌的生長繁殖，來抑制微生物體內(nèi)的脫氫酶系統(tǒng)，達(dá)到抑制微生物的生長和防腐作用，對(duì)霉菌、酵母菌等均具有較好的抑制作用。

2.3 實(shí)驗(yàn)教學(xué)流程

2.3.1 講解注意事項(xiàng) 介紹水草組培污染菌分離、鑒定及藥物篩選實(shí)驗(yàn)設(shè)備組成、試驗(yàn)操作過程，講解方案設(shè)計(jì)注意事項(xiàng)。

2.3.2 演示實(shí)驗(yàn) 植物材料和培養(yǎng)條件：紅絲青葉購自山東當(dāng)?shù)厮参镛r(nóng)場(chǎng)，長5～6 cm，含5～6個(gè)節(jié)點(diǎn)，先用自來水沖洗葉片5 min。在超凈工作臺(tái)上，把枝段切成長4～5 cm的小段，每小段包含2～3個(gè)節(jié)點(diǎn)，用75%乙醇進(jìn)行表面消毒0.5 min，并迅速轉(zhuǎn)移到2%次氯酸鈉溶液中浸泡10 min，然后用無菌蒸餾水連續(xù)攪拌沖洗3次。將消毒后的外植體切成長0.5～1.0 cm的小段，在含有MS培養(yǎng)基的240 mL培養(yǎng)容器（6 cm×9 cm）中培養(yǎng)數(shù)周。MS培養(yǎng)基添加3%蔗糖，1.0 mg/L 6-KT和1.0 mg/L IBA，用0.65%瓊脂固化，在高壓滅菌（118 kPa大氣壓）前pH調(diào)至5.8±0.1。每個(gè)培養(yǎng)容器包含2～4個(gè)莖的外植體。所有培養(yǎng)物在（26±1）℃和60%～70%濕度下培養(yǎng)，在16 h光周期（5 000 lx）下使用氣候室內(nèi)的白色熒光燈（寧波）。

（1）細(xì)菌的分離與鑒定。根據(jù)表型觀察，細(xì)菌污染物通常在30 d內(nèi)長于MS培養(yǎng)基中。將分離的細(xì)菌劃線接種于常見的LB和TSB瓊脂平板上，分別在26 ℃下孵育48 h。選擇單個(gè)菌落，重新劃線。當(dāng)所有菌落在瓊脂平板上的形態(tài)相同，并獲得細(xì)菌分離物的純培養(yǎng)時(shí)，所有分離物菌液加入15%甘油保存在-80 ℃冰箱中。

（2）真菌的分離與鑒定。MS培養(yǎng)基中也出現(xiàn)了數(shù)種真菌，依據(jù)其表型，選擇典型真菌接種于PDA板上，于26 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，多次接種后得到真菌純培養(yǎng)物，在4 ℃環(huán)境下保存于PDA板上備用。用LPCB溶液染色真菌，用透明紙膠帶法檢測(cè)真菌形態(tài)[6]。將一根含有真菌樣本的玻璃紙膠帶壓在玻璃載玻片表面，另一根玻璃紙膠帶粘貼在玻璃載玻片的非磨砂端。在膠帶的交叉處滴一滴LPCB。幾分鐘后，LPCB滲透到真菌體內(nèi)，利用顯微鏡觀察真菌形態(tài)并拍照。

（3）細(xì)菌的分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。用磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）洗滌細(xì)菌細(xì)胞2次，使用FastPure?細(xì)菌DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，作為PCR反應(yīng)的模板。采用通用引物27F（正義引物，5’-AGAGTTGATCATGGCTCA-3’）和1492R（反義引物，5’-GGTTCACTTGTTACGTT-3’）對(duì)所有分離株進(jìn)行PCR擴(kuò)增16S rDNA基因，如參考文獻(xiàn)[7]所述。擴(kuò)增在熱循環(huán)器（BioRad，USA）中進(jìn)行，循環(huán)程序：95 ℃變性5 min，然后執(zhí)行94 ℃ 0.5 min、55 ℃ 0.5 min和72 ℃ 1 min連續(xù)循環(huán)34次，最后72 ℃延長7 min。PCR產(chǎn)物在1%三乙酸-EDTA緩沖液中1.2%（w/v）瓊脂糖凝膠（含GelRed）電泳分析。在紫外線照射下觀察凝膠并拍照。PCR產(chǎn)物送至生物技術(shù)公司進(jìn)行Sanger測(cè)序。將16S rDNA序列提交至NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫，使用BLASTn算法進(jìn)行比對(duì)。鑒定出一種細(xì)菌的16S rDNA序列的核苷酸同源性在97%以上。利用Mega 6.0中CLUSTALX程序生成的多序列比對(duì)，采用鄰接法（Neighbor-joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[8]。遺傳距離矩陣采用Kimura的雙參數(shù)模型（Kimura’s two-parameter model）[9]得到1 000個(gè)重復(fù)的 Bootstrap值，以百分比顯示。

（4）真菌的分子鑒定。采集菌絲并用無菌玻璃球研磨，用真菌DNA分離試劑盒提取真菌基因組DNA。以DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，使用ITS-F（上游引物，5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS-R（下游引物，5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）擴(kuò)增真菌核糖體基因的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列[10]，隨后采用上述類似程序進(jìn)行真菌的分子鑒定。

（5）細(xì)菌抑制藥劑篩選試驗(yàn)。細(xì)菌在26 ℃ LB中培養(yǎng)24 h。在26 ℃ LB和瓊脂中分別添加50 μg/mL卡那霉素（Kan）、100 μg/mL氨芐西林（Amp）、250 μg/mL紅霉素（Ery）、200 μg/mL壯觀霉素（Spc）或25 μg/mL氯霉素（Chl），觀察細(xì)菌生長情況。檢查抗生素耐受水平，并記錄為敏感（-）或耐藥（+）。

（6）真菌抑制藥劑篩選試驗(yàn)。于26 ℃條件下，在分別添加0.015 625%（w/v）、0.031 250%（w/v）、0.062 500%（w/v）、0.100 000%（w/v）、0.125 000%（w/v）、0.250 000%（w/v）、0.500 000%（w/v）和1.000 000%（w/v）山梨酸鉀的PDA瓊脂板上觀察真菌生長14 d。同樣，測(cè)試一系列濃度的苯甲酸鈉或雙乙酸鈉溶液以及納米銀對(duì)真菌的抑制作用。

（7）抗菌劑對(duì)外植體的影響。測(cè)試抗菌藥物對(duì)外植體生長的影響。一方面，加入50 μg/mL Kan和25 μg/mL Chl（Kan+Chl）、1/2（Kan+Chl）、1/5（Kan+Chl）和1/10（Kan+Chl），觀察細(xì)菌抑制作用效果，觀察外植體生長情況14 d。另一方面，研究PS、SB和SD（0.015 625%、25%、0.0625%、0.061%、0.2%和0.5%）對(duì)真菌的抑制作用和對(duì)外植體生長的影響，并測(cè)定適當(dāng)?shù)目咕幬餄舛取⑼庵搀w或幼苗放置在添加上述適當(dāng)濃度藥物的MS培養(yǎng)基中生長。

（8）移栽。將幼苗移植到水族館土壤中，記錄其60 d生長情況并拍照。

2.3.3 實(shí)驗(yàn)后續(xù)處理 （1）對(duì)學(xué)生進(jìn)行分組，每組學(xué)生挑選細(xì)菌或真菌試樣并進(jìn)行方案設(shè)計(jì)，培養(yǎng)學(xué)生自主動(dòng)手能力。（2）檢驗(yàn)每組實(shí)驗(yàn)情況，并適當(dāng)拋出問題，引發(fā)學(xué)生思考，調(diào)動(dòng)學(xué)習(xí)積極性。（3）課程結(jié)束后，繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析。（4）留取作業(yè)，并形成實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

3 水草組培污染防治實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果分析

采用水草組織細(xì)胞培養(yǎng)課程與水草組培污染防治實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的教學(xué)模式，提高水族科學(xué)與技術(shù)專業(yè)人才培養(yǎng)質(zhì)量；通過組培教學(xué)平臺(tái)，有效提升學(xué)生的綜合實(shí)踐能力。

首先，培養(yǎng)基配制與優(yōu)化是水族科學(xué)與技術(shù)專業(yè)類學(xué)生參與水草組培的必備基礎(chǔ)，其有利于引導(dǎo)學(xué)生更好地理解組培操作原理與過程，讓學(xué)生了解水草組培污染防治對(duì)水草組培的意義，拓展水草組培培養(yǎng)基優(yōu)化的配方分析，引導(dǎo)學(xué)生思考防治培養(yǎng)基污染實(shí)驗(yàn)的基本原理；培養(yǎng)學(xué)生研究水草組培污染防治實(shí)驗(yàn)的整體思維，提高科研能力。其次，水草組培污染防治實(shí)驗(yàn)需要通過團(tuán)隊(duì)協(xié)作有序展開，實(shí)驗(yàn)課程大多采用分組方式進(jìn)行教學(xué)。將學(xué)生分成5～6組，分階段接替完成，以確保每名學(xué)生均能動(dòng)手實(shí)踐，培養(yǎng)協(xié)作能力，提高自主學(xué)習(xí)性。再次，教師詳細(xì)講解組培理論、防治機(jī)理和培養(yǎng)基優(yōu)化分析等知識(shí)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)測(cè)試原理，對(duì)所收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，幫助學(xué)生直觀了解組培、污染源檢測(cè)和抑菌機(jī)制等概念，強(qiáng)化學(xué)生對(duì)理論知識(shí)的理解，使其在實(shí)驗(yàn)課程學(xué)習(xí)過程中實(shí)現(xiàn)對(duì)理論知識(shí)的融會(huì)貫通，并在實(shí)驗(yàn)中靈活運(yùn)用。最后，結(jié)合水草組培污染防治實(shí)驗(yàn)，學(xué)生實(shí)際參與方案設(shè)計(jì)、培養(yǎng)基制備、污染菌鑒定、藥物篩選防治和數(shù)據(jù)分析等全實(shí)驗(yàn)流程，提高了其實(shí)踐操作能力，有利于其更加深刻地理解并掌握水草組培培養(yǎng)基優(yōu)化知識(shí)。

4 結(jié)語

Lewis等[11]研究認(rèn)為，水生植物生長在淡水和鹽水中具有不同的生命周期和結(jié)構(gòu)。水生植物可以通過營養(yǎng)方式快速繁殖，其中，組織培養(yǎng)是生產(chǎn)中的重要應(yīng)用手段之一。植物材料通過70%～75%乙醇、2%次氯酸鈉或0.1%氯化汞進(jìn)行表面消毒，而這些消毒劑可能對(duì)植物細(xì)胞產(chǎn)生不利影響，需要控制合理的使用劑量與處理時(shí)間。在此情況下，某些類型的微生物，如假單胞菌、農(nóng)桿菌和克雷伯氏菌，可能不會(huì)被破壞；內(nèi)生菌可能免受表面消毒處理。為消除培養(yǎng)基中不必要的微生物，Li等[12]測(cè)試了幾種藥物，以確定適當(dāng)?shù)囊志鷿舛?，?0 μg/mL Kan、5 μg/mL Chl和0.015 625% PS的混合物，可抑制微生物感染，且可避免對(duì)外植體脫分化和再分化的負(fù)面影響，并應(yīng)用于MS培養(yǎng)基的優(yōu)化改良。為使學(xué)生更好地理解水草組培污染防治的原理，以污染防治實(shí)驗(yàn)為出發(fā)點(diǎn)開展組培污染防治教學(xué)非常必要。通過污染源的菌種鑒定分析、篩選防治藥物及優(yōu)化培養(yǎng)基的探索研究，鍛煉學(xué)生的實(shí)踐能力、理論應(yīng)用能力及科研探索能力，提高其對(duì)科研的興趣，為從事水草擴(kuò)繁生產(chǎn)和相關(guān)科學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。在教學(xué)過程中，學(xué)生能夠更直觀地學(xué)習(xí)組培培養(yǎng)基配制、細(xì)菌分離與鑒定和藥敏反應(yīng)等知識(shí)，有利于調(diào)動(dòng)學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性，提升實(shí)驗(yàn)參與性，培養(yǎng)理論和實(shí)踐應(yīng)用的整體思維等，為水族專業(yè)學(xué)科水草組織細(xì)胞課程教學(xué)改革提供新視角和參考。

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（責(zé)任編輯：楊歡）