摘 要：為了解河北省唐秦地區(qū)蛋雞大腸桿菌病流行情況，對(duì)來(lái)自河北省唐山市和秦皇島市部分地區(qū)的92株蛋雞致病性大腸桿菌分離株的血清型、毒力基因、耐藥性及生物被膜形成能力進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：分離的92株大腸桿菌共分為11種血清型，優(yōu)勢(shì)血清型為O78（62/69.57%）、O45（30/32.61%）、O2（20/21.74%）；分離菌株毒力基因檢測(cè)16種毒力基因的攜帶情況，未檢測(cè)到iutB、Ler、eaeA2毒力基因。分離菌株耐藥基因檢測(cè)25種耐藥基因的攜帶情況，KPC、CMY-2、

Oxa-1、SHV、Tet（C）、Tet（G）、qnrA、qnrB qnrC、qnrD、ermA、mefA基因均未檢出；對(duì)林可霉素、氨芐西林、阿莫西林、復(fù)方新諾明、四環(huán)素耐藥嚴(yán)重，對(duì)環(huán)丙沙星、大觀霉素敏感；92株大腸桿菌中，強(qiáng)形成膜能力的菌株有46株（50％），中形成膜能力的菌株有24株（26.09％），弱形成膜能力的菌株有12株（13.04％），不形成生物被膜的菌株有10株（10.87％）。本試驗(yàn)結(jié)果為河北秦皇島地區(qū)和唐山地區(qū)蛋雞大腸桿菌病防治提供了科學(xué)根據(jù)。

關(guān)鍵詞：蛋雞；大腸桿菌；血清型；毒力基因

中圖分類(lèi)號(hào)：S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1673-1085（2024）09-0014-12

收稿日期：2024-02-29

近幾年來(lái)，隨著我國(guó)蛋雞養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，大腸桿菌病的發(fā)生呈不斷上升趨勢(shì)，給蛋雞養(yǎng)殖業(yè)造成了很大損失。近幾年，有關(guān)蛋雞大腸桿菌病的報(bào)道較多，但其分子流行病學(xué)報(bào)道較少。蛋雞大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌（Escherichia coil， E. coil）引起的一種疾病，可引起雛雞、青年雞、成年雞的多種癥狀[1]，引起腹膜炎、輸卵管炎、大腸桿菌性敗血癥、腫頭綜合征、氣囊炎、心包炎、肝周炎[2]等特征性病癥。在合適的外部環(huán)境下，細(xì)菌都有能力形成生物被膜，這被認(rèn)為是細(xì)菌自我保護(hù)的一種適應(yīng)惡劣環(huán)境的方式[3]。此外，細(xì)菌的毒力和耐藥性與其生物被膜的形成能力也有一定的關(guān)聯(lián) [4]。

本試驗(yàn)對(duì)2023年從河北省秦皇島市和唐山市地區(qū)分離的92株蛋雞致病性大腸桿菌進(jìn)行血清型、毒力基因及耐藥性檢測(cè)、生物被膜形成能力檢測(cè)，從而有助于科學(xué)防控蛋雞大腸桿菌病，保障禽畜業(yè)的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

2023年從河北省秦皇島市和唐山市地區(qū)不同養(yǎng)雞場(chǎng)分離鑒定的92株蛋雞致病性E.coli，由河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。E.coli質(zhì)控菌株ATCC25922由河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑與儀器

麥康凱瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂、2×MasterMix、DL-2000Marker，購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；瓊脂糖，購(gòu)自西班牙Biowest公司；頭孢噻肟、慶大霉素等14種藥敏紙片，購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；ID32E腸桿菌科生化鑒定試紙條，購(gòu)自生物梅里埃中國(guó)有限公司。

1.3 細(xì)菌分離純化與鑒定

將疑似大腸桿菌感染病/死蛋雞進(jìn)行解剖，將患病蛋雞的肝、腎、心臟和脾臟等組織處理后無(wú)菌劃線接種于麥康凱（MAC）培養(yǎng)基，倒置37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h后，觀察菌落形態(tài)和生長(zhǎng)特性；挑選MAC培養(yǎng)基上桃紅色邊緣整齊的單菌落接種于伊紅美藍(lán)平板，倒置37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，觀察菌落形態(tài)和生長(zhǎng)特性；挑選伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上紫黑色有金屬光澤的單菌落在普通瓊脂平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)，并對(duì)純化后的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，并接種于LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)12 h后，按照生化鑒定試紙條說(shuō)明書(shū)進(jìn)行生化鑒定。收集剩余的純化菌株，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 細(xì)菌16S rRNA PCR鑒定

水煮法制備DNA模板：將純化好的菌落在LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，搖床培養(yǎng)12 h（溫度為37 ℃），將菌液10 000 rpm/min離心2 min，棄上清，取1 mL高壓后的PBS溶液入到菌體沉淀中，沖懸沉淀，再經(jīng)10 000 rpm/min離心 2min，棄上清，留沉淀，反復(fù)洗滌 2～3次，取200 μL 高壓后的PBS溶液將菌體吹懸起來(lái)，100 ℃煮沸10 min，在冰上放置2 min，10 000 rpm/min離心 2 min后收集上清，即為所提取的 DNA，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

參照文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)引物，PCR 反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，共34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物加入1%瓊脂糖凝膠樣孔中，一個(gè)樣孔中加入5 μL的PCR產(chǎn)物，設(shè)置電泳電壓為120 V，電泳時(shí)間30 min，將凝膠放入凝膠成像儀中觀察條帶并拍照。引物合成及PCR產(chǎn)物測(cè)序均在上海生工生物工程有限公司進(jìn)行。

1.5 大腸桿菌血清型檢測(cè)

1.5.1 DNA模板的制備 操作方法同1.4中水煮法DNA提取。

1.5.2 PCR反應(yīng)及電泳 參考文獻(xiàn)[6]，采用PCR方法對(duì)大腸桿菌O抗原進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)體系如下，2×Taq PCR Mastermix 10 μL，DNA 2 μL，上下游引物各1 μL，超純水6 μL。94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s和72 ℃ 1 min，共34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。取PCR產(chǎn)物5 μL加入到1.5%瓊脂糖加樣孔中，120 V電泳30 min，結(jié)果在凝膠成像儀下拍照并記錄結(jié)果。

1.6 分離菌株的毒力基因檢測(cè)

參考文獻(xiàn)[7]，由北京生物工程有限公司合成毒力基因16對(duì)引物。以提取的DNA為模板，采用PCR方法進(jìn)行毒力基因的檢測(cè)。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52～66 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.7 藥物敏感性試驗(yàn)方法

對(duì)分離的92株蛋雞致病性E.coli采用了美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)CLSI（Clinicaland Laboratory Standards Institute）推薦的K-B藥敏紙片法進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)分離菌株的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行整理，分析其耐藥性。

1.8 細(xì)菌耐藥基因的PCR檢測(cè)

參考文獻(xiàn)[8]，由上海生工生物工程有限公司合成25種耐藥基因引物。以提取的基因組DNA為模板，采用PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.9 細(xì)菌的生物被膜形成能力檢測(cè)

參考文獻(xiàn)[9]，采用結(jié)晶紫微孔板法對(duì)唐秦地區(qū)臨床分離到的92株蛋雞源大腸桿菌分離株進(jìn)行被膜形成能力測(cè)定。判定標(biāo)準(zhǔn)以陰性對(duì)照OD590 平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差定義為ODc，將菌株生物被膜形成能力分為4類(lèi)：生物被膜無(wú)形成能力，OD590 lt;ODc；生物被膜形成能力弱，ODclt;OD590 lt;2ODc；生物被膜形成能力中，2ODclt;ODOD590 lt;4ODc；生物被膜形成能力強(qiáng)，OD590 ≥4ODc。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離鑒定

從采集的211份病料中對(duì)分離菌株進(jìn)行分離純化、染色鏡檢、生化鑒定。結(jié)果顯示，分離到了92株菌株，分離率為43.60%。革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌株的形態(tài)呈兩端鈍圓的紅色短桿狀，在麥康凱平板上呈桃紅色、表面光滑、邊緣整齊的單菌落（圖1）；在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形態(tài)為紫黑色并有金屬光澤菌落（圖2），培養(yǎng)基上的菌株特征與E.coli特征符合。鏡檢菌株呈紅色短桿狀，未觀察到芽孢，屬于革蘭氏陰性菌（圖3）。92株分離菌株經(jīng)ID32E腸桿菌科生化鑒定試紙條鑒定分析，評(píng)定結(jié)果均符合E.coli生化鑒定標(biāo)準(zhǔn)，符合率為99.60%～99%。

2.2 細(xì)菌的生化鑒定

分離菌株經(jīng)生化鑒定后，分離的92株致病性菌株能夠?qū)Ⅺ溠刻恰⑵咸烟侨樘?、果糖等發(fā)酵，V-P試驗(yàn)、尿素酶反應(yīng)均為陰性，M.R試驗(yàn)為陽(yáng)性。菌株鑒定結(jié)果與E.coli生化特性相符。

2.3 分離菌株16S rRNA PCR鑒定

92株分離菌株經(jīng)PCR擴(kuò)增后，在約1 500 bp位置上出現(xiàn)清晰的條帶。分離菌株測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的E.coli的參考株基因序列進(jìn)行比對(duì)，同源性在98.8%～99.9%之間，結(jié)果表明92株分離菌株均為E.coli。部分菌株的PCR結(jié)果見(jiàn)圖4。

2.4 分離菌株血清型檢測(cè)

對(duì)初步分離確定的92株致病性E.coli通過(guò)PCR技術(shù)進(jìn)行O血清型檢測(cè)，共分為11種血清型，分別為O1、O2、O5、O6、O9、O18、O45、O65、O78、O91和O157。由表1可知，62株大腸桿菌血清型為O78，比例為69.57%；O45、O2和O1血清型分離菌株分別是30株、20株和14株，比例分別為32.61%、21.74%和15.21%，為優(yōu)勢(shì)血清型；O6、O9、O18、O45、O91和O157血清型大腸桿菌菌株數(shù)量較少，見(jiàn)表1。未檢出O5、O65血清型，見(jiàn)圖5。

2.5 分離菌株毒力基因檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)PCR方法檢測(cè)16種毒力基因的攜帶情況，結(jié)果顯示，92株致病性E.coli攜帶13種不同毒力基因，未檢測(cè)到iutB、Ler、eaeA 3種毒力基因（圖6）。92株致病性E.coli中irp2毒力基因檢出率最高，為97.83%（90/92）；其次為ompT、fimC和hlyF毒力基因，檢出率也較高，均為93.48%；iroN、iucD、Iss和fyuA的檢出率在58.70%～91.30%之間，而Vat、astA毒力基因檢出率較低，分別為10.87%和21.74%（表2）。

圖7為多重毒力基因檢測(cè)結(jié)果。由圖7可知，92株致病性E.coli攜帶5～13種毒力基因不等。其中，有2株攜帶5種毒力基因，占比2.32%；攜帶11種毒力基因的菌株數(shù)量高達(dá)36株，占比41.86%。92株致病性E.coli主要攜帶毒力譜見(jiàn)表3。由表3可知，含有（hlyF+Colv+Tsh+ompT+Iss+iroN+fimC+iucd+iutA+irp2+fyuA）毒力基因的毒力譜檢出率最高，占比32.56%；其次是含有（hlyF+Colv+fimC+Tsh+ompT+Iss+iroN+Iucd+iutA+irp2）毒力基因的毒力譜，檢出率為11.63%；第三是含有（astA+hlyF+Colv+fimC+Tsh+ompT+Iss+iroN+iucd+iutA+irp2）毒力基因的毒力譜，檢出率為6.98%；含有（hlyF+Colv+fimC+ompT+iroN+iucd+iutA+irp2）和（Tsh+ompT+Iss+iroN+iucd+iutA+Vat+astA+hlyF+Colv+fimC+irp2+fyuA）毒力基因的毒力譜，檢出率均是4.65%。

2.6 92株禽致病性E.coli耐藥性檢測(cè)結(jié)果

由表4可知，92株禽致病性E.coli對(duì)林可霉素、氨芐西林、阿莫西林、復(fù)方新諾明、四環(huán)素耐藥率較高，均在84.78%以上；對(duì)頭孢曲松、鏈霉素、紅霉素、頭孢噻肟、恩諾沙星的耐藥率在50.00%～60.87%之間；對(duì)氟苯尼考、慶大霉素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星的耐藥率在30.43%～56.52%之間；而大觀霉素、耐藥率較低，在19.57%。

分離菌株多重耐藥結(jié)果見(jiàn)圖8。由圖8可知，2023年分離的92株菌最少耐2種藥物的有2株，占比2.17%；最多耐14種藥物的有2株，占比2.17%；對(duì)7、10種藥物耐藥的菌株最多，為14株，占比均為15.22%。

2.7 分離的92株禽致病性E.coli耐藥基因檢測(cè)

通過(guò)PCR方法對(duì)唐秦地區(qū)分離的92株E.coli的25種耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，部分陽(yáng)性菌株的PCR結(jié)果見(jiàn)圖9。

92株雞源致病性E.coli耐藥基因檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，檢出耐藥基因以gyrA、aadA1、dhps、Oxa-5為主，檢出率均在93.48%以上；Sul-3、Sul-1、aadA2、Tet（E）、StrA、ermB、StrB耐藥基因的檢出率分別為34.78%、52.17%、54.35%、56.52%、65.22%、86.96%、89.13%，而KPC、CMY-2、Oxa-1、SHV、Tet（C）、Tet（G）、qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、ermA、mefA耐藥基因均未檢出。

由圖10可知，分離的92株E.coli存在多重耐藥基因攜帶情況，攜帶10種耐藥基因的菌株數(shù)最多，為30株，占比32.61%；其次，攜帶9種耐藥基因的菌株數(shù)為22株，占比23.91%；攜帶7、11種耐藥基因的菌株數(shù)都是12株，占比13.04%；攜帶6種耐藥基因的菌株數(shù)有6株，占比6.52%；攜帶8、12種耐藥基因最少，都是4株，占比4.35%。

2.8 92株禽致病性E.coli生物膜形成能力檢測(cè)結(jié)果

河北省秦皇島市和唐山市分離的92株大腸桿菌中，能形成生物膜的有82株，占全部菌株的為89.13%。其中，有46株菌株形成膜能力強(qiáng)，有24株菌株形成膜能力中等，有12株菌株生物被膜形成能力弱，有10株菌株不形成生物被膜，分別占比50.00%、26.09%、13.04%和10.87%。

2.9 生物膜形成能力與耐藥性相關(guān)性分析

生物膜形成能力與耐藥性相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知，分離的92株大腸桿菌生物被膜形成能力與頭孢曲松、頭孢噻肟、紅霉素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、大觀霉素、氟苯尼考、慶大霉素9種抗生素的耐藥性符合率為91.7%～100.0%，分離的92株大腸桿菌生物被膜形成能力與阿莫西林、鏈霉素、氟苯尼考、復(fù)方新諾明、林可霉素、氨芐西林5種抗生素的耐藥性符合率為78.9%～90.9%。

3 討論

3.1 唐秦地區(qū)蛋雞致病性E.coli的血清型分析

不同地區(qū)流行的血清型有所不同，致病能力也有所差異。楊文文等[10]對(duì)分離的150株大腸桿菌菌株進(jìn)行O抗原血清型鑒定，其中131株可以鑒定出血清型，其中O78和O1陽(yáng)性率最高，分別為16.8%和15.3%。王瑤等[11]對(duì)江蘇、安徽、河南、山東等地區(qū)分離的210株大腸桿菌進(jìn)行O抗原血清型，主要流行血清型為O78、O2、O1，分別占比44.76%、24.29%、13.33%。趙素華等[12]對(duì)皖北地區(qū)分離的36株大腸桿菌進(jìn)行血清型鑒定，顯示主要流行的血清型為O78、O18、O88，分別占比29.03%、22.58%、16.12%。楊立軍等[13]對(duì)福建省龍巖市分離的139株大腸桿菌分離株鑒定血清型，優(yōu)勢(shì)血清型為O78、O2、O1，陽(yáng)性率分別為10.0%、10.0%、8.0%。本試驗(yàn)對(duì)河北地區(qū)秦皇島市和唐山市92株E.coli進(jìn)行血清型鑒定，發(fā)現(xiàn)84株定型，8株未定型，其中優(yōu)勢(shì)血清型為O78、O45、O2，分別占比69.57%、32.61%、21.74%。相關(guān)研究表明，蛋雞致病性E.coli的優(yōu)勢(shì)血清型與地區(qū)存在一定相關(guān)關(guān)系。

3.2 唐秦地區(qū)蛋雞致病性E.coli的毒力基因分析

通過(guò)檢測(cè)禽致病性大腸桿菌攜帶的毒力因子來(lái)判斷其對(duì)機(jī)體的致病能力，毒力因子是直接導(dǎo)致禽大腸桿菌病發(fā)生的基礎(chǔ)。陳亞強(qiáng)等[14]對(duì)重慶地區(qū)分離的286株禽致病性E.coli的9種毒力基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明iss、iucD、hlyF、irp2檢出率較高，分別為75.52%、69.58%、52.10%、46.50%。陳祥等[15]對(duì)江蘇等20個(gè)地區(qū)分離的243株禽致病性E.coli的13種毒力基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果iss、tsh、iucD、irp2、fyuA的檢出率分別為79.4%、68.7%、67.1%、67.1%、66.7%。胡林等[16]對(duì)華東部分地區(qū)77株禽致病性E.coli進(jìn)行26個(gè)毒力基因的檢測(cè)，結(jié)果fimc、ompa、iss毒力基因的檢出率超過(guò)75%，未檢出hlyF毒力基因。李麗麗等[17]對(duì)江蘇、安徽、河南、山東等地區(qū)分離的210株禽致病性E.coli進(jìn)行16種毒力基因檢測(cè)，結(jié)果表明fimc、iss、iroN、iucD、fyuA檢出率較高，分別為90.00%、79.05%、69.05%、65.24%、50.48%；含有多種毒力基因的禽致病性E.coli分離株有207株，其中含有5種毒力基因最多，占比98.57%，其次是含6、7、8、9種毒力基因的菌株分別占比91.90%、82.38%、72.86%。本試驗(yàn)對(duì)從河北地區(qū)秦皇島市和唐山市分離的92株禽致病E.coli的16種毒力基因檢測(cè)，結(jié)果表明irp2、ompT、fimC、hlyF毒力基因的檢出率最高，分別為97.83%、93.48%、93.48%、93.48%；含有11種毒力基因的致病性E.coli最多，占比41.86%；其次是含10、8種毒力基因的菌株，占比分別為20.93%、11.63%。由上述結(jié)果可知，不同地區(qū)蛋雞致病性E.coli的毒力基因的流行趨勢(shì)有所不同。

3.3 唐秦地區(qū)禽致病性E.coli的耐藥基因分析

禽致病E.coli產(chǎn)生耐藥性一般是由攜帶的耐藥基因?qū)е碌模煌貐^(qū)分離的禽致病性E.coli攜帶的耐藥基因也有所不同。王永亮等[18]對(duì)66株大腸桿菌耐藥基因檢測(cè)，對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物檢測(cè)的基因型以qnrA為主，占比50.0%；對(duì)氨基糖苷類(lèi)以aadD為主，占比36.4%。張濟(jì)培等[19]對(duì)廣東地區(qū)分離的149株水禽源大腸桿菌，對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明檢測(cè)基因型以aadA1為主，占比84.6%。張海龍[20]分離的76株致病性E.coli的gyrA檢出率高達(dá)100%，其次為Oxa-5、StrB、Sul-2、aadA1，檢出率均在78.95%以上。本試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)92株禽致病性E.coli進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)，包括β－內(nèi)酰胺類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、磺胺類(lèi)藥物等25種耐藥基因，檢測(cè)到gyrA、aadA1、dhps、Oxa-5、StrA、StrB、ermB、Sul-1、Sul-3、Tet（E）、Sul-1、aadA2、Sul-2等13種基因。本試驗(yàn)分離的92株禽致病性E.coli以gyrA、aadA1、dhps、Oxa-5耐藥基因?yàn)橹?，檢出率在93.48%以上，而KPC、CMY-2、Oxa-1、SHV、Tet（C）、Tet（G）、qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、ermA、mefA基因均未檢出。與上述研究者的結(jié)果存在部分不同，不同地區(qū)耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果有所差異，分析認(rèn)為攜帶的耐藥基因不同，可能與動(dòng)物的品種與地區(qū)有關(guān)。

3.4 唐秦地區(qū)禽致病性E.coli的耐藥性檢測(cè)分析

禽致病性E.coli在防控過(guò)程存在復(fù)雜的耐藥性以及耐藥多重性。潘玉善等[21]對(duì)河北、山東、河南、四川、江西、浙江等8省12個(gè)地區(qū)分離的20株禽致病E.coli分離株進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20株禽E.coli分離株對(duì)氨芐西林、頭孢曲松、頭孢頭孢噻肟耐藥率高達(dá)100%，對(duì)慶大霉素耐藥率為35%，對(duì)氟苯尼考耐藥率為60%。魏清宇等[22]對(duì)從山西省北部地區(qū)分離的81株雞大腸桿菌菌株進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)四環(huán)素耐藥率為92.3%，對(duì)恩諾沙星、阿莫西林的耐藥率分別為87.7%、84.0%，對(duì)鏈霉素、復(fù)方新諾明耐藥率分別為77.8%、76.5%，對(duì)氟苯尼考、慶大霉素、環(huán)丙沙星和頭孢噻肟的耐藥率分別為55.6%、43.2%、34.6%和9.8%。崔笑博等[23]對(duì)山東泰安周邊部分地區(qū)分離的78株禽致病E.coli進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，結(jié)果表明對(duì)紅霉素耐藥率96.2%，對(duì)氨芐西林耐藥率為92.4%，對(duì)環(huán)丙沙星耐藥率為82.27%，對(duì)鏈霉素耐藥率為74.68%，對(duì)復(fù)方新諾明耐藥率為91.1%，對(duì)氟苯尼考耐藥率為89.8%，對(duì)慶大霉素耐藥率為72.15%。陳濤等[24]對(duì)山東部分地區(qū)的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，家禽大腸桿菌普遍存在多重耐藥菌株，占所有耐藥菌株的50%以上，且日益增長(zhǎng)。2重、3重耐藥菌株呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而5重、6重、7重耐藥菌株占比較多。董向磊等[25]對(duì)江蘇省部分地區(qū)（南通、常州和泰州）和山東省膠東地區(qū)（煙臺(tái)、青島）分離的154株大腸桿菌耐藥性檢測(cè)，結(jié)果顯示均表現(xiàn)出多重耐藥性，最少耐5重，13重耐藥菌株最多，占全部菌株的19.48%；其次為12重，占全部菌株的16.88%；10重以上耐藥菌株達(dá)69.48%。本試驗(yàn)中，92株大腸桿菌對(duì)林可霉素、氨芐西林、阿莫西林、復(fù)方新諾明、四環(huán)素耐藥率較高，均在84.78%以上；對(duì)頭孢曲松、鏈霉素、紅霉素、頭孢噻肟、恩諾沙星的耐藥率在50.00%～60.87%之間，對(duì)氟苯尼考、慶大霉素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星的耐藥率在30.43%～56.52%之間；大觀霉素、耐藥率較低，在 19.57%。其中，最少耐2種藥物的有2株，占比2.17%；最多耐14種藥物的有2株，占比2.17%；最多耐7、10種藥物的有14株，占比15.22%。試驗(yàn)結(jié)果顯示蛋雞致病性E.coli耐藥性嚴(yán)重，不合理使用抗菌藥會(huì)導(dǎo)致耐藥性越來(lái)越嚴(yán)重，根據(jù)地區(qū)的不同其耐藥性也有所差異性。

3.5 唐秦地區(qū)禽致病性E.coli生物膜與耐藥性之間的關(guān)系

細(xì)菌的黏附是細(xì)菌生物被膜形成的關(guān)鍵過(guò)程，部分細(xì)菌性疾病與細(xì)菌被膜有關(guān)。生物膜的形成可以對(duì)外界抗菌藥物有抵抗力，大腸桿菌生物膜形成能力與耐藥性有關(guān)。宋學(xué)紅等[26]對(duì)北京、上海、廣東、河南分離的198株雞肉源大腸桿菌進(jìn)行生物膜形成能力測(cè)定，結(jié)果表明強(qiáng)生物膜分離株有95株，占比47.98%；弱生物膜分離株有93株，占比46.97%；不形成生物膜有10株，占比5.05%。其生物膜形成能力與耐藥性相關(guān)性分析，顯示沒(méi)有顯著性差異（P 值為 0.493，P＞0.05）。張召興等[27]對(duì)河北地區(qū)分離出92株大腸桿菌進(jìn)行生物膜能力進(jìn)行測(cè)定，與14種抗生素的符合率在73.70%以上。本試驗(yàn)從河北地區(qū)秦皇島市和唐山市分離的92株禽致病性E.coli中，共有82株能形成生物膜，占分離菌株的89.13%。其中，強(qiáng)形成膜能力菌株有46株，中形成膜能力菌株有24株，弱形成膜能力菌株有12株，不形成被膜菌株有10株，分別占分離菌株的50.00%、26.09%、13.04%和10.87%。其生物被膜形成能力與耐藥性相關(guān)性分析結(jié)果顯示，分離的92株蛋雞致病性E.coli的生物被膜形成能力與13種抗生素耐藥性的符合率在78.9%以上，其產(chǎn)生的耐藥性與大腸桿菌的生物被膜形成能力有所相關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1] KAPET J B， NATARO J P， MOBLEY H L T. Pathogenic escherichia coli[J]. Nat Rev Microbiol， 2004， 2（2）： 123-140.

[2] 陳祥.禽病原性大腸桿菌的生物學(xué)特性及其可能毒力相關(guān)基因的鑒定[D].揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2006.

[3] MELLATA M， DHO-MOULIN M， DOZOIS C M， et al. Role of virulence factors in resistance of avian pathogenic Escherichia coli to serum and in pathogenicity[J]. Infection and immunity， 2003， 71（1）： 536-540.

[4] 歐陽(yáng)鳳菊.禽致病大腸桿菌生物被膜檢測(cè)及形成基因研究[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[5] 張召興，李佩國(guó)，陳玥，等.2018年～2019年河北地區(qū)蛋雞源大腸桿菌流行病學(xué)調(diào)查與分析[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2020，42（03）：228-233.

[6] 張立偉.河北地區(qū)雞源致病性大腸桿菌分離鑒定及耐藥性研究[D].邯鄲：河北工程大學(xué)，2021.

[7] 張海龍，劉優(yōu)優(yōu)，何云鳳，等.秦皇島地區(qū)蛋雞致病性大腸桿菌的血清型、毒力基因及耐藥性檢測(cè)分析[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2022，42（07）：1369-1375.

[8] 李蘊(yùn)玉，葛成，焦賀靜，等.秦皇島地區(qū)育成雞大腸桿菌血清型鑒定及耐藥性分析[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2019，55（08）：71-73+76.

[9] SKYBERG J A， SIEK KE，DOETKOTT，C et al. Biofilm formation by avian Escherichia coli in relation to media， source and phylogeny[J].Journal of Applied Microbiology，2007，102（2）：548-554.

[10]楊文文，李玉保，路建彪，等.雞源大腸桿菌攜帶毒力基因、血清型及與致病性相關(guān)性的研究[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2021，43（10）：1051-1056.

[11]王瑤，張耀東，易正飛，等.禽致病性大腸桿菌血清型、進(jìn)化分群及毒力基因的分子流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2020，50（09）：1159-1166.

[12]趙素華，范紅結(jié).皖北地區(qū)禽源大腸桿菌的血清型鑒定與耐藥性分析[J].畜牧與獸醫(yī)，2017，49（04）：95-98.

[13]楊立軍，韓先干，尹會(huì)方，等.福建省龍巖市禽致病性大腸桿菌的血清型、毒力因子及耐藥研究[J].中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2016，24（06）：24-29.

[14]陳亞強(qiáng).重慶地區(qū)禽大腸桿菌流行特征及評(píng)估模型研究[D].廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2019.

[15]陳祥.禽病4性大腸桿菌的生物學(xué)特性及其可能毒力相關(guān)基因的鑒定[D].揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2006.

[16]胡林.華東部分地區(qū)禽大腸桿菌病的分子流行病學(xué)調(diào)查[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[17]李麗麗.禽源大腸桿菌主要毒力因子的分子流行病學(xué)分析及F1與P菌毛單克隆抗體的制備[D].揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2014.

[18]王永亮.吉林省部分地區(qū)動(dòng)物源大腸桿菌耐藥性及多重耐藥株全基因組序列分析[D].長(zhǎng)春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2022.

[19]張濟(jì)培，韋慶蘭，譚華龍，等.廣東水禽源大腸桿菌耐藥性及氨基糖苷類(lèi)耐藥基因的研究[C]//廣東省畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì).第25屆廣東省科技進(jìn)步活動(dòng)月畜牧獸醫(yī)學(xué)術(shù)與科技創(chuàng)新發(fā)展大會(huì)論文集.2016：5.

[20]張海龍.河北省雞源大腸桿菌的分離鑒定及毒力與耐藥性檢測(cè)[D].秦皇島：河北科技師范學(xué)院，2021.

[21]潘玉善.禽源大腸桿菌、奇異變形桿菌多重耐藥的分子特征及CTX-M基因傳播擴(kuò)散機(jī)制[D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[22]魏清宇.山西省北部地區(qū)雞大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性分析[D].晉中：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[23]崔笑博.禽源大腸桿菌的分離鑒定，耐藥性分析及聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的研究[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[24]陳濤.山東部分地區(qū)禽大腸桿菌分離鑒定及耐藥分析[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[25]董向磊.禽致病性大腸桿菌的分離鑒定和分離株毒力基因與致病性相關(guān)性研究[D].揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2014.

[26]宋學(xué)紅.雞肉源大腸桿菌群體感應(yīng)基因分布、耐藥性及生物膜等特性的研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2016.

[27]張召興，李佩國(guó)，張海龍，等.河北地區(qū)蛋雞源大腸桿菌分子分群、耐藥性及生物被膜檢測(cè)與分析[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2020，40（08）：1474-1478.

Detection and Analysis of Serotypes， Virulence Genes， Drug Resistance， and Biofilm of Pathogenic Escherichia coli in Laying Hens in the Tang and Qin Regions

YIN Heyu， YI Xueyan， GU Yuhua， KUANG Huali， ZHOU Runyu， LI Yunyu， LI Peiguo， JIA Qinghui

（Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine in Hebei Province， Hebei Normal University of Science and Technology， Qinhuangdao 066604，China）

Abstract： To understand the prevalence of Escherichia coli in laying hens in the Tangqin region， this study collected 92 strains of Escherichia coli identified from the Tangqin region in 2023， and tested the serotypes， virulence genes， drug resistance， and biofilm formation ability of 92 pathogenic Escherichia coli strains isolated from some areas of Tangshan and Qinhuangdao in Hebei Province. The results showed that the isolated strains of Escherichia coli were divided into 11 serotypes. The dominant serotypes are O78 （62/69.57%）， O45 （30/32.61%）and O2 （20/21.74%）. The carrying status of 16 virulence genes was detected by testing the virulence genes of isolated strains， but no virulence genes such as iutB， Ler， and eaeA2 were detected. The carrier status of 25 antibiotic resistance genes was detected in the isolated strains， but KPC， CMY-2， Oxa-1， SHV， Tet （C）， Tet （G）， qnrA， qnrB， qnrC， qnrD， ermA， and mefA genes were not detected. Severe resistance to lincomycin， ampicillin， amoxicillin， compound sulfamethoxazole， and tetracycline， sensitive to ciprofloxacin and spectinomycin. Among the 92 strains of Escherichia coli， 46 strains （50%） had strong membrane forming ability， 24 strains （26.09%） had medium membrane forming ability， 12 strains （13.04%） had weak membrane forming ability， and 10 strains 10.87% did not form BF. The results of this experiment provide a scientific basis for the prevention and treatment of Escherichia coli disease in laying hens in the Qinhuangdao and Tangshan regions of Hebei Province.

Keywords： Laying hens; Escherichia coli; Serotypes; Virulence gene