【摘要】目的 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討寒濕阻肺證防疫藥茶方對(duì)新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的作用機(jī)制，為臨床診療提供參考。方法 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）、PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)篩選寒濕阻肺證防疫藥茶方的潛在活性成分[生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18]；利用Swiss數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)防疫藥茶方作用靶點(diǎn)；利用Cytoscape軟件構(gòu)建“藥物活性化合物-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)；String數(shù)據(jù)庫(kù)、Cytoscape軟件構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)；利用R包和ClusterProfiler數(shù)據(jù)包對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析；利用Cytoscape軟件對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析。結(jié)果 10個(gè)藥物活性成分“degree”值gt;30，分別為柳穿魚黃素（pectolinarigenin）、芫花素（genkwanin）、5-羥基-7，4'-二甲氧基黃酮（5-hydroxy-7，4'-dimethoxyflavanon）、香葉木素（diosmetin）、漢黃芩素（wogonin）、槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、黃酮醇（pachypodol）、木犀草素（luteolin）、草質(zhì)素（herbacetin）。可能成為潛在治療靶點(diǎn)的蛋白包括激肽原1（KNG1）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）R、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶（CASP3）、髓過(guò)氧化物酶（MPO）。防疫藥茶方可能通過(guò)多個(gè)生物學(xué)過(guò)程發(fā)揮治療作用。結(jié)論 本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)寒濕阻肺證防疫藥茶方的活性成分及作用靶點(diǎn)進(jìn)行檢索、篩選及富集分析，推測(cè)其治療的活性成分可能為genkwanin、quercetin、diosmetin、kaempferol、wogonin、luteolin，潛在治療靶點(diǎn)可能為KNG1、EGFR、CASP3、MPO，通過(guò)調(diào)控花生四烯酸代謝、血小板活化、磷脂酶D等信號(hào)通路，抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等，這可能是寒濕阻肺證防疫藥茶方治療COVID-19的重要機(jī)制。

【關(guān)鍵詞】網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；防疫藥茶方；新型冠狀病毒肺炎

【中圖分類號(hào)】R563.1 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2096-2665.2024.23.0112.06

DOI：10.3969/j.issn.2096-2665.2024.23.034

近年來(lái)，中醫(yī)藥在新突發(fā)傳染病的防治中取得顯著的臨床效果[1]。早期臨床針對(duì)新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019， COVID-19）的治療沒(méi)有特效藥物[2-4]。診療方案中各證型對(duì)應(yīng)的中醫(yī)辨證處方，在臨床中得以廣泛應(yīng)用。目前尚未有臨床研究深入探討寒濕阻肺證防疫藥茶方治療COVID-19的藥理機(jī)制。有研究表明，中西醫(yī)結(jié)合治療方案在COVID-19死亡率等方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，其可改善普通型COVID-19患者的臨床癥狀[5]。中藥復(fù)方可通過(guò)多靶標(biāo)、多成分對(duì)機(jī)體發(fā)揮調(diào)控作用，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是目前研究中藥復(fù)方發(fā)揮藥物作用機(jī)制的有效方法[6]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探索寒濕阻肺證防疫藥茶方治療COVID-19的有效成分及作用機(jī)制，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索收集寒濕阻肺證防疫藥茶方包含的化合物及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，構(gòu)建和分析靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，明確相關(guān)靶點(diǎn)及子模塊，對(duì)重要靶點(diǎn)和子模塊進(jìn)行功能富集，探索其與COVID-19的關(guān)聯(lián)因素，為中醫(yī)藥治療COVID-19挖掘更加科學(xué)的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 寒濕阻肺證防疫藥茶方的潛在活性成分 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索寒濕阻肺證防疫藥茶方的中藥化學(xué)成分；利用PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)獲取上述檢索結(jié)果中化學(xué)成分的分子結(jié)構(gòu)，保存為Canonical SMILES格式，篩選寒濕阻肺證防疫藥茶方的潛在活性成分，條件為生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18。參考藥物代謝動(dòng)力學(xué)（ADME）評(píng)估寒濕阻肺證防疫藥茶方的中藥成分對(duì)機(jī)體的影響[7]。

1.2 預(yù)測(cè)寒濕阻肺證防疫藥茶方作用靶點(diǎn) 將上述的Canonical SMILES格式文件導(dǎo)入Swiss數(shù)據(jù)庫(kù)（http：// www.swisstargetprediction.ch/），將研究物種設(shè)定為“人類”，獲取相關(guān)化合物的作用靶點(diǎn)，保存為csv格式，通過(guò)整合、去重得到寒濕阻肺證防疫藥茶方的潛在作用靶點(diǎn)。

1.3 構(gòu)建“活性化合物-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò) 有研究報(bào)道， 新型冠狀病毒通過(guò)刺突蛋白與人腎素和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）相互作用，從而導(dǎo)致COVID-19的發(fā)生[8]。因此，本研究根據(jù)結(jié)腸上皮細(xì)胞單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果，提取與ACE2共表達(dá)的基因，對(duì)原始文件的基因名進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換，匹配與人類相關(guān)靶點(diǎn)。與上述寒濕阻肺證防疫藥茶方潛在作用靶點(diǎn)相映射，獲得寒濕阻肺證防疫藥茶方治療COVID-19的潛在靶點(diǎn)。將上述得到的活性化合物和潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建“活性化合物-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

1.4 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò) 將上述的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//stringdb.org/），物種設(shè)定為“人類”，對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白間相互作用（PPI）分析，將所得結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件中的插件Cytohubba進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，使用Cytoscape軟件進(jìn)行可視化處理。

1.5 靶點(diǎn)的生物功能及通路富集分析 利用R包和ClusterProfiler數(shù)據(jù)包對(duì)得到的共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析；利用Cytoscape軟件中的ClueGO和CluePedia插件對(duì)得到的共同靶點(diǎn)進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析，保留結(jié)果P≤0.05的數(shù)據(jù)，獲取GO柱狀圖及KEGG信號(hào)通路柱狀圖，使用Cytoscape軟件繪制靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖，挖掘靶點(diǎn)和信號(hào)通路在寒濕阻肺證防疫藥茶方與COVID-19間的關(guān)聯(lián)因素，探討寒濕阻肺證防疫藥茶方治療的作用機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 寒濕阻肺證防疫藥茶方的潛在活性成分結(jié)果 TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選到70個(gè)寒濕阻肺證防疫藥茶方的潛在活性成分。

2.2 寒濕阻肺證防疫藥茶方作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果 利用Swiss 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)上述70個(gè)寒濕阻肺證防疫藥茶方的活性成分的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。其中50個(gè)化合物可測(cè)得靶點(diǎn)，共計(jì)539個(gè)潛在作用靶點(diǎn)。根據(jù)結(jié)腸上皮細(xì)胞單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果，識(shí)別到5 556個(gè)與ACE2共表達(dá)的基因，對(duì)原始文件的基因名進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換，匹配人類相關(guān)靶點(diǎn)的基因共計(jì)3 388個(gè)。繪制成分靶點(diǎn)（539個(gè)）與疾病靶點(diǎn)（3 388個(gè)）韋恩圖，得到170個(gè)重合靶點(diǎn)，見(jiàn)圖1。上述結(jié)果提示寒濕阻肺證防疫藥茶方機(jī)體可通過(guò)多成分發(fā)揮調(diào)控作用。

2.3 “活性化合物-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 “活性化合物-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖2。共10個(gè)藥物活性成分“degree”值gt;30，分別為柳穿魚黃素（pectolinarigenin）、芫花素（genkwanin）、 5-羥基-7，4'-二甲氧基黃酮（5-hydroxy-7，4'-dimethoxyflavanon）、香葉木素（diosmetin）、漢黃芩素（wogonin）、槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、黃酮醇（pachypodol）、木犀草素（luteolin）、草質(zhì)素（herbacetin）。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖3。潛在靶點(diǎn)可視化網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，見(jiàn)表1。 170個(gè)潛在治療靶點(diǎn)中，可能成為潛在治療靶點(diǎn)的蛋白包括激肽原1（KNG1）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）R、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶（CASP3）、髓過(guò)氧化物酶（MPO）。

2.4 GO富集分析結(jié)果 對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，選擇結(jié)果P≤0.05的數(shù)據(jù)，對(duì)前20個(gè)條目結(jié)果進(jìn)行可視化分析。寒濕阻肺證防疫藥茶方主要作用靶點(diǎn)生物過(guò)程（BP），見(jiàn)圖4；寒濕阻肺證防疫藥茶方主要作用靶點(diǎn)細(xì)胞組成（CC），見(jiàn)圖5；寒濕阻肺證防疫藥茶方主要作用靶點(diǎn)分子功能（MF），見(jiàn)圖6。提示寒濕阻肺證防疫藥茶方可能通過(guò)多個(gè)生物學(xué)過(guò)程發(fā)揮治療作用。

2.6 KEGG富集結(jié)果分析 對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析，選擇結(jié)果P≤0.05的數(shù)據(jù)，進(jìn)行可視化分析，獲取寒濕阻肺證防疫藥茶方主要作用靶點(diǎn)KEGG富集，見(jiàn)圖7。上述結(jié)果提示寒濕阻肺證防疫藥茶方的活性成分靶點(diǎn)存在于多個(gè)通路中，且通路間可協(xié)同發(fā)揮治療作用。

3 討論

目前，臨床研究證實(shí)，在改善COVID-19患者臨床癥狀、縮短平均住院天數(shù)方面，中西醫(yī)結(jié)合治療具有顯著優(yōu)勢(shì)，早期進(jìn)行中醫(yī)干預(yù)可減少普通型向重型及危重型的轉(zhuǎn)化[9]。診療方案中各證型對(duì)應(yīng)的中醫(yī)辨證處方在臨床中均得到廣泛應(yīng)用。目前，尚無(wú)臨床研究深入探討寒濕阻肺證防疫藥茶方治療COVID-19的藥理機(jī)制。本研究選用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)寒濕阻肺證防疫藥茶方的相關(guān)活性成分進(jìn)行篩選，采用Swiss數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)寒濕阻肺證防疫藥茶方的潛在作用進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用Cytoscape軟件對(duì)寒濕阻肺證防疫藥茶方的“藥物活性化合物-潛在作用靶點(diǎn)”進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，對(duì)得到的共同靶點(diǎn)進(jìn)行基因本GO和KEGG富集分析，構(gòu)建靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)而挖掘寒濕阻肺證防疫藥茶方的活性化學(xué)成分、潛在作用靶點(diǎn)及信號(hào)調(diào)節(jié)通路。

通過(guò)寒濕阻肺證防疫藥茶方-活性化合物-潛在作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析推測(cè)pectolinarigenin、genkwanin、5-hydroxy-7，4'-dimethoxyflavanon、 diosmetin、wogonin、quercetin、kaempferol、pachypodol、luteolin、 herbacetin這10個(gè)成分是寒濕阻肺證防疫藥茶方治療COVID-19的主要活性成分，表明黃酮類化學(xué)成分在寒濕阻肺證防疫藥茶方治療COVID-19的作用機(jī)制中具有重要意義。有研究表明，針對(duì)甲型流行性病毒誘導(dǎo)的急性肺損傷，漢黃芩素通過(guò)抑制補(bǔ)體系統(tǒng)的過(guò)度活化，起到一定的保護(hù)作用[10]；槲皮素通過(guò)抑制核因子（NF）-κB信號(hào)通路，減少NF-κB轉(zhuǎn)錄因子、血管細(xì)胞黏附分子1（VCAM-1）的產(chǎn)生，減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)，可緩解急性肺損傷[11]，同時(shí)，其主要通過(guò)拮抗鈣離子通道，阻止病毒受體復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞，從而中斷生活周期，起到抗病毒作用[12]。木犀草素具有緩解咳嗽、咳痰的效果，同時(shí)具有抗病毒、抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗過(guò)敏等藥理學(xué)活性[13]。山柰酚通過(guò)降低MAKP、NF-κB等通路的活性，抑制白細(xì)胞介素（IL）-10、腫瘤細(xì)胞壞死因子（TNF）-α、IL-6、IL-1β、VCAM-1等炎癥因子表達(dá)水平，起到抑制炎癥的作用[14]。同時(shí)，山柰酚可清除體內(nèi)氧自由基，改善組織缺氧損傷，發(fā)揮抗氧化活性[15]。香葉木素可通過(guò)活化核因子E2相關(guān)因子2通路和抑制核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白（NLRP3）炎癥反應(yīng)，減輕急性肺損傷[16]。芫花素通過(guò)調(diào)節(jié)脂多糖激活的巨噬細(xì)胞中的微小RNA（miRNA）101、MKP-1、MAPK途徑抑制促炎介質(zhì)的產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎作用[17]。潛在治療靶點(diǎn)方面，研究表明，COVID-19通過(guò)結(jié)合人ACE2感染患者[18]。

本研究結(jié)果顯示，潛在治療靶點(diǎn)KNG1、EGFR、CASP3、MPO均參與肺部炎癥反應(yīng)。雷公藤紅素可通過(guò)KNG1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑減輕慢性阻塞性肺疾病的炎癥反應(yīng)[19]。EGFR反式激活可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生黏液及促進(jìn)炎性細(xì)胞因子分泌，且有研究表明，EGFR與哮喘大鼠氣道炎癥有關(guān)[20-21]。CASP3是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志物，過(guò)敏性氣道炎癥小鼠模型的研究中，槲皮素通過(guò)調(diào)節(jié)上皮來(lái)源的細(xì)胞因子和上皮細(xì)胞凋亡的過(guò)程，緩解慢性組織病理學(xué)改變，除肺組織中的基底膜厚度，其對(duì)炎癥也有一定抑制作用[22]。失血性休克復(fù)蘇后的大鼠，MPO活性增強(qiáng)，分解胞外纖維與基質(zhì)，從而引起肺實(shí)質(zhì)和急性肺損傷中的炎癥反應(yīng)，而吸入2%氫氣可降低MPO活性并減少炎癥細(xì)胞向肺組織的浸潤(rùn)，從而最大程度地減少肺部損傷程度[23]。以上均為寒濕阻肺證防疫藥茶方藥物活性成分及靶點(diǎn)在治療COVID-19方面的潛在作用機(jī)制，但仍有部分關(guān)聯(lián)性極高的靶點(diǎn)在既往的研究未被證實(shí)具有抗病毒、抗炎作用。例如，潛在治療靶點(diǎn)ESR1，目前普遍認(rèn)為雌激素的生物效應(yīng)主要通過(guò)ESR1調(diào)節(jié)，ESR1與雌激素相結(jié)合可發(fā)揮抗腫瘤作用，而暫未有抗炎、肺保護(hù)方面的研究報(bào)道[24]。

GO富集分析結(jié)果提示，寒濕阻肺證防疫藥茶方可能通過(guò)多個(gè)生物學(xué)過(guò)程發(fā)揮治療作用。寒濕阻肺證防疫藥茶方的潛在治療靶點(diǎn)主要分布于細(xì)胞膜、神經(jīng)元軸突、溶酶體腔等部位，參與細(xì)胞內(nèi)金屬離子穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞鈣離子穩(wěn)態(tài)、激素反應(yīng)、脂肪酸衍生物代謝活性、不飽和脂肪酸代謝、化學(xué)突觸傳遞的調(diào)節(jié)等生物過(guò)程，涉及離子通道調(diào)控、免疫調(diào)節(jié)等環(huán)節(jié)。相關(guān)研究表明，羥基可能通過(guò)改變細(xì)胞鈣離子的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮其細(xì)胞毒性作用，使肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量活性氧自由基，從而導(dǎo)致氧化性肺損傷[25]。炎癥通過(guò)跨細(xì)胞膜和細(xì)胞層的液體轉(zhuǎn)移等而引起疾病，急性肺損傷也已經(jīng)檢測(cè)到離子通道的變化[26]。中性內(nèi)肽酶在急性肺損傷的發(fā)病機(jī)理中起保護(hù)作用[27]。

KEGG富集分析結(jié)果提示，寒濕阻肺證防疫藥茶方的活性成分靶點(diǎn)存在于多個(gè)通路中，且通路間可協(xié)同發(fā)揮治療作用。與治療具有關(guān)聯(lián)性的通路中，最為核心的炎癥反應(yīng)通路是花生四烯酸代謝通路。既往研究發(fā)現(xiàn)，該通路可介導(dǎo)炎癥因子產(chǎn)生，與炎癥的發(fā)生發(fā)展及消退均有密切聯(lián)系[28]。磷脂酶D廣泛分布于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，且受多種細(xì)胞外信號(hào)的調(diào)節(jié)，其主要底物是磷脂酰膽堿，可水解為磷脂酸和膽堿。磷脂酶D催化的磷脂酰膽堿水解被認(rèn)為是細(xì)胞中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要機(jī)制，同時(shí)有證據(jù)表明磷脂酶D與炎癥具有密切聯(lián)系，如炎癥的增加及白細(xì)胞的趨化性與磷脂酶D1、磷脂酶D2緊密相關(guān)[29]。血小板的活化也是寒濕阻肺證防疫藥茶方主要涉及的通路之一，血小板在維持凝血穩(wěn)態(tài)方面起著核心作用，血小板在炎癥和免疫反應(yīng)中具有關(guān)鍵作用[30-31]。調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)可能是寒濕阻肺證防疫藥茶方治療COVID-19的重要機(jī)制。

綜上所述，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)寒濕阻肺證防疫藥茶方的活性成分及作用靶點(diǎn)進(jìn)行檢索、篩選及富集分析，推測(cè)其治療的活性成分可能為genkwanin、quercetin、diosmetin、kaempferol、wogonin、luteolin，潛在治療靶點(diǎn)可能為KNG1、EGFR、CASP3、MPO，通過(guò)調(diào)控花生四烯酸代謝、血小板活化、磷脂酶D等信號(hào)通路，抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等，這可能是寒濕阻肺證防疫藥茶方治療COVID-19的重要機(jī)制。

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