摘 要 目的：為解決目前支原體檢測方法操作復雜、耗時長、靈敏度低等問題，按照《中華人民共和國藥典》（ChP）、美國藥典（USP）、歐洲藥典（EP）生物制品支原體檢測方法及驗證指導原則，構建一種快速芯片式的支原體檢測方法，并對該方法檢測能力進行驗證。方法：采用Taqman探針法，并利用快速qPCR儀結合芯片檢測支原體，快速高效，可極大降低檢測成本。結果與結論：本研究建立的基于qPCR的支原體檢測方法特異性強、穩(wěn)定性佳、可重復性好，可為支原體感染的診斷檢測和流行病學調查提供方法學支持。

關鍵詞 支原體殘留 探針法 qPCR

中圖分類號：Q93-332 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2024）19-0085-05

引用本文 姚杰， 黃懿. 芯片式支原體qPCR檢測技術的開發(fā)與應用研究[J]. 上海醫(yī)藥， 2024， 45（19）： 85-89.

Development and application of chip qPCR technology for mycoplasma detection

YAO Jie， HUANG Yi

（Shanghai Tanshi Biotechnology Co.， Ltd.， Shanghai 201206， China）

ABSTRACT Objective： In order to solve the problems of complex operation， long time and low sensitivity of the current detection methods for mycoplasma， a rapid chip-based mycoplasma detection method was established and a simple methodological validation was performed according to the principles of biological product mycoplasma inspection and method validation guidance in the Chinese Pharmacopoeia （ChP）， United States Pharmacopeia （USP）， and European Pharmacopoeia （EP）. Methods： The mycoplasma residue in cells or biological products was accurately and stably detected by Taqman probe method based on the rapid qPCR instrument combined with the chip， which was fast and efficient and could greatly reduce the detection cost. Results Conclusion： The qPCR-based mycoplasma detection method established in this study has high specificity， stability， and certain repeatability and can provide methodological support for the accurate diagnosis and detection of mycoplasma infection and epidemiological investigation.

KEY WORDS mycoplasma residue； probe method； qPCR

支原體（mycoplasma）是一類最小的、沒有細胞壁、高度多形性的原核細胞型微生物，通常大小在0.1～0.3 mm之間。由于其能形成絲狀與分枝形狀，故稱為支原體[1]。支原體廣泛存在于人和動物體內，其中部分支原體具有高致病性，它們寄生于宿主細胞中，通過攫取宿主細胞營養(yǎng)物質及其代謝產生毒素等方式威脅宿主（如人類和動植物）健康[2]?！稓W洲藥典》第2.6.7章公布了生產用細胞庫以及臨床治療用細胞庫檢測用的支原體菌種或菌株，包括萊氏支原體（A. laidlawii）、雞毒支原體（M. gallisepticum）、發(fā)酵支原體（M. fermentans）、豬鼻支原體（M .hyorhinis）、口腔支原體（M. orale）、肺炎支原體（M. pneumoniae）、滑液囊支原體（M. synoviae）。盡管自然界常見的支原體有120多種[3]，但污染細胞的支原體主要是以上這7種，占所有支原體感染的90%以上[4]。支原體感染影響宿主細胞的活性和功能，可導致培養(yǎng)的細胞緩慢死亡，不僅會造成依賴細胞的活性分析檢測結果不可靠，還會導致生產的生物制品存在安全隱患[5]。因此，對細胞和疫苗等生物制品進行支原體檢測十分必要。

目前國內外常用的支原體殘留檢測方法有培養(yǎng)法、DNA的熒光染色法、掃描電鏡法、PCR法、實時熒光定量PCR法（qPCR法）[6]，檢測時間從1 d到4周不等，且檢測結果存在較大偏差[7]。近年來，PCR技術已經應用于多項殘留支原體的檢測[8]，它的高特異性和靈敏度可以滿足研究甚至工業(yè)生產的質量要求[9]。本研究主要介紹我們在qPCR Taqman探針法的基礎上[10]，開發(fā)及優(yōu)化出一套快速熒光定量的芯片式檢測方法，總結支原體核酸的制備和PCR產物驗證等方法，為檢測細胞培養(yǎng)中支原體污染提供一種簡單、快速、可靠的技術。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

GD-106快速熒光定量PCR儀（qPCR，北京吉檢生物科技有限公司）；芯片（北京吉檢生物科技有限公司）；1384高速冷凍離心機、Heracell 150i CO2培養(yǎng)箱、1384生物安全柜（Thermo公司）。

CHO-K1細胞、HEK293細胞（美國典型培養(yǎng)物保藏中心）；DMEM培養(yǎng)基、支原體DNA提取純化試劑盒（湖州申科生物技術有限公司）；基因擴增液（北京吉檢醫(yī)療科技有限公司）；引物探針及PC（支原體特征序列，即陽性對照）/IC（內參系列，即陰性對照）由上海探實生物科技有限公司自主設計，第三方合成。

1.2 方法

1.2.1 支原體DNA的純化

1）樣品處理 將15 mL的細胞轉移至50 mL無菌低吸附離心管，在4 ℃下1 000×g離心5 min，沉淀上清液中的細胞。把離心去除細胞后的上清轉移至20 mL的超濾濃縮管進行離心濃縮（4 ℃，12 000×g，10 min）；用2 mL基礎培養(yǎng)基重懸，將超濾濃縮管內液體轉移至離心管中，在4 ℃下16 000×g離心30 min后棄上清留支原體沉淀，用一定體積的試劑盒稀釋液得到體積為約1.5 mL的支原體樣品濃縮液。

2）樣品制備 上述樣品加入裂解液及蛋白酶k進行消化后應用磁珠法對樣品進行富集和純化，最后在70 ℃下進行洗脫回收，獲樣品待用。

1.2.2 qPCR反應體系的設計

1）配置qPCR反應體系 反應體系包括反應樣品、引物探針混合液、基因擴增液以及IC。其中，引物探針包括PC和IC引物探針。

優(yōu)化前后qPCR反應體系（15 mL）見表1，NTC（no template control）加入水作為樣本進行檢測，標記為空白對照。

2）裝配芯片 將配置完成的qPCR反應體系添加至芯片式反應容器內。

3）擴增條件 50 ℃變性60 s，95 ℃變性30 s，95℃ 15 s，60 ℃ 25 s，45個循環(huán)，總時間約為42 min；反應結束后，得到兩組CT（cycle threshold，即循環(huán)數閾值）值。

4）結果判斷 兩組PC和IC的CT值進行比較，判斷支原體的陰、陽性。根據qPCR儀自動給出的CT值進行定性判斷，在IC的CT值大于35的前提下，PC的CT大于35則為陽性，否則為陰性。

檢測時設置空白對照組和陽性對照組。其中，空白對照組中基因樣品用無核酶的水替代；陽性對照組中基因樣品用PC替代。

1.2.3 PCR反應產物的驗證

根據設計的PC引物探針和IC引物探針，可得到如下PC和IC擴增序列，其中PC來自于支原體保守區(qū)域，IC來自于pUC57質粒序列。PC序列（268 bp，GGTTAACAGAGTGACAGATGGTGCA）和IC序列（214 bp，ACCATGGTACACCTGACTCCTGAGG）后如表2配制PCR體系進行擴增，經瓊脂糖電泳驗證。

1.2.4 普通PCR反應條件

按照表1和2配制PCR反應體系后，設置PCR儀反應條件為98 ℃變性3 min，98 ℃變性30 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，45個循環(huán)；反應結束后PCR產物（目的序列）經1%瓊脂糖凝膠電泳分析可分別得到兩條基因條帶。通過判斷目的基因條帶的大小，驗證PC及IC是否與引物設計的片段大小一致。

2 結果

2.1 雙通道判斷陰、陽性

PC的FAM通道的CT值約為23.13，CY5通道的CT值約為23.95，空白對照的FAM通道未出峰，CY5通道的CT值約為23.90（圖1）。陽性對照PC產生一條約300 bp的特異性擴增產物，空白對照產生一條約200 bp的特異性擴增產物，即內部對照IC的擴增，符合理論分析結果（圖2），表明快速芯片式支原體qPCR檢測方法能快速檢測支原體。

2.2 專屬性分析

分別選用CHO、HEK293、E.coli 3種宿主細胞DNA，采用芯片式支原體檢測系統進行qPCR檢測。結果顯示，CHO、HEK293、E.coli 3種宿主細胞DNA與支原體檢測試劑均無交叉反應；支原體PC樣本、CHO、HEK293、E.coli 3種宿主細胞DNA樣本和空白樣本的CY5通道均出峰，說明擴增反應無抑制；支原體PC FAM通道的CT值分別為23.98、23.26和23.20，而CHO、HEK293、E.coli 3種宿主細胞DNA均未出峰（圖3～5），表明快速芯片式支原體qPCR檢測方法對支原體具有專屬性。

2.3 穩(wěn)定性分析

支原體檢測試劑反復凍融3次、5次、10次后各體系雙通道的CT值無較大差異，證明檢測試劑穩(wěn)定性較好，不受反復凍融影響；凍融3次、5次、10次的FAM通道CT值的RSD為1.13%，CY5通道CT值的RSD為1.18%，CT值無明顯差異（圖6），表明快速芯片式支原體qPCR檢測方法具有良好的穩(wěn)定性。

2.4 靈敏度分析

采用2 000 copies/mL的支原體陽性對照，將支原體陽性對照品稀釋10倍、100倍、1 000倍后進行檢測，結果顯示，10倍稀釋的PC FAM通道的CT值為27.47，100倍稀釋的PC FAM通道的CT值為30.74，1 000倍稀釋的PC未檢出，同時10倍、100倍、1 000倍稀釋的PC CY5通道的CT值分別為23.21，23.16，23.41，說明本發(fā)明的靈敏度可達20 copies/mL（圖7）。表明快速芯片式支原體qPCR檢測方法對支原體具有較高的靈敏度。

3 討論

綜上，芯片式的qPCR檢測方式，相比于孔板式的傳統方法，具有體系小，反應靈敏的特點，結合快速qPCR儀和反應擴增液可以將檢測時間縮短至40 min，從而極大地縮短檢測時間，是一種快速、準確且低成本的檢測技術。總而言之，該方法具有以下幾點優(yōu)勢：①檢測速度快，通量高。支原體qPCR檢測通常需要經過45個循環(huán)的擴增，相當于一次反應需要2 h的儀器運行時間才能獲得最終的結果，再以擴增結果的CT值進行支原體陰陽性判斷。我們建立的快速支原體檢測系統也需要進行45個循環(huán)的擴增，但總共耗費的時間縮短為42 min。另外整個系統分為16個檢測盒，總檢測通量為48個，各個檢測盒可獨立運行程序，適用于隨到隨檢，大大提高了檢測的效率。②體系小，成本低。傳統的qPCR體系設置為30 mL，在0.1 mL的多孔板中進行PCR擴增相對穩(wěn)定，本方法的芯片式qPCR檢測體系縮小至傳統qPCR體系的1/2，從而使檢測試劑用量至少減少1倍，操作更加簡單快捷。③靈敏度更高。目前的支原體檢測試劑盒的最低靈敏度是10 CFU/mL，本方法的支原體檢測試劑的靈敏度可達1 CFU/mL，檢測限度更低。④與傳統PCR檢測方法具有一致性，可應用于醫(yī)學病原體檢測、環(huán)境病原體監(jiān)測、海關檢驗檢疫、科學研究及實驗教學等，另外在植被保護、動物醫(yī)學、食品安全、司法鑒定等領域有潛在的應用價值。

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