摘""要：廣西種植的桂葡柚1號(hào)葡萄柚豐產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)性好，其果肉多汁、酸甜適宜。為了解其不同成熟度果肉成分差異，測(cè)定其不同成熟度果肉廣泛靶向代謝組，篩選差異代謝物并進(jìn)行代謝通路分析。結(jié)果顯示：從桂葡柚1號(hào)中共檢測(cè)到529種代謝物，其中黃酮159種，氨基酸及其衍生物和酚酸類各64種，其他類包含糖、醇類和維生素共53種，脂質(zhì)51種，木脂素和香豆素40種，核苷酸及其衍生物34種，生物堿29種，有機(jī)酸28種，萜類5種，鞣質(zhì)2種。不同成熟度果肉差異代謝物主要有黃酮、酚酸類、氨基酸及其衍生物、脂質(zhì)、木脂素和香豆素，且大多下調(diào)。隨著果實(shí)成熟度上升，下調(diào)的酚酸、氨基酸及其衍生物、脂質(zhì)等種類增加，且大部分呈持續(xù)下調(diào)趨勢(shì)；大部分下調(diào)黃酮的相對(duì)含量在果實(shí)成熟初期大幅下降，到果實(shí)成熟后期又有增加趨勢(shì)，下調(diào)黃酮種類先增加后減少，在果實(shí)成熟中期最多；辛弗林、亞精胺、甜菜苷、諾米林酸、（-）-莽草酸的相對(duì)含量持續(xù)降低；檸檬苦素的相對(duì)含量在果實(shí)成熟初期增加，在成熟中后期顯著下調(diào)。在果實(shí)成熟初期，差異代謝物富集最顯著的是類黃酮生物合成通路，但在整個(gè)成熟過(guò)程中，差異代謝物富集最顯著的是苯丙烷生物合成通路。G2果實(shí)口感最佳，可溶性固形物達(dá)12%，固酸比為23.24，適宜鮮食，但該時(shí)期咖啡酸、阿魏酸等酚酸類物質(zhì)，以及異槲皮苷、金絲桃苷等黃酮顯著下降。研究表明，桂葡柚1號(hào)果肉代謝物種類多、營(yíng)養(yǎng)和功能成分豐富，鮮食適宜采摘時(shí)間為10月下旬至12月上旬，用于保健或藥用的果實(shí)應(yīng)根據(jù)功效需求提前采摘。該研究為桂葡柚1號(hào)葡萄柚的營(yíng)養(yǎng)及功能成分研究提供一定的理論基礎(chǔ)，為不同用途的果實(shí)最佳采摘成熟度提供參考。

關(guān)鍵詞：桂葡柚1號(hào)；成熟度；代謝組學(xué)；果肉成分；果實(shí)品質(zhì)中圖分類號(hào)：S666.3""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Differential"Analysis"of"Flesh"Compounds"of"Grapefruit"of"Guipuyou"No."1"at"Different"Maturation"Stages"Based"on"Widely"Targeted"Metabolomics

LIU"Fuping，"LIAO"Huihong*，"WANG"Xi，"CHEN"Dongkui，"WEI"Chizhang，"HUANG"Hongming，"HUANG"Qichun，"WANG"Nina

Horticulture"Research"Institute，"Guangxi"Academy"of"Agricultural"Sciences"/"Nanning"South"Subtropical"Fruit"Tree"Scientific"Observation"Experimental"Station，"Ministry"of"Agriculture"and"Rural"Affairs"/"National"Germplasm"Resources"Observation"Experiment"Station"in"Wuming"/"Guangxi"Engineering"Technology"Research"Center"of"Citrus"Huanglongbing"Prevention"and"Control，"Nanning，"Guangxi"530007，"China

Abstract："Grapefruit"of"Guipuyou"No."1"planted"in"Guangxi"has"high"and"stable"yield，"and"the"flesh"is"juicy，"suitably"acidic"and"sweet."The"widely"targeted"metabolisms"of"flesh"was"determined，"the"differential"metabolites"were"screened"and"the"metabolic"pathway"was"analyzed"to"understand"the"difference"ofnbsp;flesh"composition"at"different"maturity"stages."A"total"of"529"metabolites"were"detected"from"grapefruit"of"Guipuyou"No."1，"including"159"flavonoids，"64"Phenolic"acids，"64"amino"acids"and"derivatives，"53"others"（saccharides"and"alcohols，vitamin，"others），"51"lipids，"40"lignans"and"coumarins，"34"nucleotides"and"derivatives，"29"alkaloids，"28"organic"acids，"5"terpenoids"and"2"tannins."The"differential"metabolites"at"different"maturity"stages"mainly"included"flavonoids，"phenolic"acids，"amino"acids"and"their"derivatives，"lipids，"lignans"and"coumarins，"and"most"of"them"were"down-regulated."The"down-regulated"types"of"phenolic"acids，"amino"acids"and"their"derivatives，"lipids"and"other"types"increased，"and"most"of"them"showed"a"continuous"downward"trend"with"the"increase"of"fruit"ripeness."Most"of"the"down-regulated"flavonoids"showed"a"sharp"decline"in"the"early"stage"of"fruit"ripening，"and"then"increased"in"the"late"stage"of"fruit"ripening."The"types"of"down-regulated"flavonoids"first"increased"and"then"decreased，"with"the"most"in"the"middle"stage"of"fruit"ripening."The"relative"contents"of"synephrine，"spermidine，"betaine，"shikimic"acid"were"consistently"decreasing."The"relative"content"of"limonin"increased"in"the"early"stage"of"fruit"ripening，"and"decreased"significantly"in"the"middle"and"late"stage"of"fruit"ripening."The"most"significant"enrichment"pathway"of"differential"metabolites"was"flavonoid"biosynthesis"in"the"early"stage"of"fruit"ripening，"but"it"was"phenylpropanoid"biosynthesis"during"the"whole"ripening"process."The"fruit"of"G2"had"the"best"taste，"with"soluble"solids"of"12%"and"solid-acid"ratio"of"23.24，"which"was"suitable"for"fresh"eating."However，"phenolic"acids"such"as"caffeic"acid"and"ferulic"acid，"flavonoids"such"as"isoquercitrin"and"hyperoside"decreased"significantly"during"this"period."There"were"many"kinds"of"metabolites"in"the"pulp"of"grapefruit"of"Guipuyou"No."1，"which"was"rich"in"nutritional"and"functional"components."The"best"picking"time"for"fresh"food"is"from"late"October"to"middle""November."Fruits"used"for"health"care"or"medicinal"purposes"should"be"picked"in"advance"according"to"the"efficacy"requirements."This"study"would"provide"a"theoretical"basis"for"the"study"on"the"nutritional"and"functional"components"of"grapefruit"of"Guipuyou"No.1，"and"provide"a"reference"for"the"best"harvest"maturity"of"its"different"uses.

Keywords："grapefruit"of"Guipuyou"No."1;"maturity;"metabolomic;"fruit"compounds;"fruit"quality

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.12.001

葡萄柚（Citrus"paradisi"Macf.）屬蕓香科柑橘屬，果實(shí)風(fēng)味獨(dú)特，不僅富含維生素、有機(jī)酸、糖、蛋白質(zhì)、礦質(zhì)元素、膳食纖維等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還含有類黃酮、檸檬苦素類化合物等生物學(xué)活性物質(zhì)，具有特殊的醫(yī)療保健功能，是一種鮮食和加工兼用的重要水果，備受歐美發(fā)達(dá)國(guó)家青睞[1-2]。葡萄柚在廣東、福建、四川、云南、廣西等地已有規(guī)模栽培[3-4]。前人在國(guó)內(nèi)葡萄柚種質(zhì)資源、性狀遺傳變異、生物學(xué)特性、栽培技術(shù)與果實(shí)品質(zhì)等方面開展了較多的研究，但對(duì)葡萄柚的健康功效研究較少，且與國(guó)外差距較大[2]。國(guó)外科學(xué)家發(fā)現(xiàn)葡萄柚汁能增加如非洛地平、達(dá)泊西汀、布南色林等某些藥物的生物利用率[5-7]，葡萄柚能夠平衡老鼠胰島素和葡萄糖水平[8]等。王琦等[9]也發(fā)現(xiàn)葡萄柚果汁具有明顯延緩果蠅衰老的作用。但是隨著葡萄柚果實(shí)的發(fā)育成熟，檸檬苦素類化合物和柚皮苷、枸橘甙、新橙皮苷、新橙皮素等類黃酮物質(zhì)含量逐漸下降[10]?；趶V泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)分析不同成熟度葡萄柚果實(shí)中的代謝成分及差異尚未見(jiàn)報(bào)道。桂葡柚1號(hào)葡萄柚在廣西種植豐產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)性好，其果肉多汁、酸甜適中[11]，本研究旨在通過(guò)測(cè)定其不同成熟度果實(shí)的品質(zhì)和果肉廣泛靶向代謝組，分析其不同成熟度果肉成分和果實(shí)的品質(zhì)，為其營(yíng)養(yǎng)及功能成分的研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為鮮食、保健等不同用途桂葡柚1號(hào)果實(shí)的采摘成熟度和采摘時(shí)間提供參考。

1""材料與方法

1.1""材料

以廣西南寧市上林縣白圩鎮(zhèn)桂葡柚1號(hào)基地果實(shí)為供試材料，該基地桂葡柚1號(hào)砧木為酸柚，2019年為第三年掛果。從基地中選取樹勢(shì)、果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期一致的具有代表性的3棵樹，自2019年9月28日（果實(shí)成熟初期）開始采樣，之后每隔24"d取1次樣，共取4次，最后一次采樣時(shí)間為2019年12月9日（果實(shí)成熟后期）。采樣時(shí)從每棵樹東、南、西、北方向各采摘果實(shí)大小、成熟度一致的2個(gè)果，每棵樹8個(gè)果，3棵樹即3個(gè)重復(fù)。采摘當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，樣品信息見(jiàn)表1。

1.2""方法

1.2.1""果實(shí)品質(zhì)測(cè)定""使用游標(biāo)卡尺測(cè)量果實(shí)縱、橫徑。用電子天平測(cè)量單果質(zhì)量。用手持折光儀測(cè)定果汁可溶性固形物含量。用酸堿滴定法測(cè)定果汁可滴定酸含量。分別采用SPSS"Statistics"23軟件和LSD法開展方差分析和差異顯著性分析，差異顯著性水平為0.05。

1.2.2""代謝組樣品準(zhǔn)備與分析""分析果實(shí)品質(zhì)時(shí)，每個(gè)樣品的果肉各用5"mL凍存管取樣，裝好樣品后，將其快速放入液氮中，然后移至–80"℃超低溫冰箱保存。代謝組學(xué)分析樣品的提取流程參照錢瑞[12]的方法，將提取好的樣品保存于進(jìn)樣瓶中，利用超高效液相色譜（UPLC）（Shim-pack"UFLC"SHIMADZU"CBM30A）和串聯(lián)質(zhì)譜（MS/"MS）（Applied"Biosystems"4500"QTRAP）對(duì)樣本進(jìn)行物質(zhì)分離和鑒定[13-14]。

1.2.3""代謝組質(zhì)控樣本與數(shù)據(jù)分析""質(zhì)控樣本（QC）為4組分析樣品提取物的等量混合物。檢測(cè)分析時(shí)，每10個(gè)分析樣本中插入1個(gè)質(zhì)控樣本。代謝組數(shù)據(jù)分析基于KEGG化合物數(shù)據(jù)庫(kù)和Met Ware數(shù)據(jù)庫(kù)，以及多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）開展樣品代謝物的定性和定量質(zhì)譜分析，代謝物鑒定[15]MS容差和MS2容差設(shè)置為20"mg/kg，保留時(shí)間非常

接近的同分異構(gòu)體，廣靶無(wú)法區(qū)分，根據(jù)購(gòu)買的標(biāo)品提供取代基位點(diǎn)參考，沒(méi)有標(biāo)品的則參考文獻(xiàn)[16]的中位點(diǎn)，代謝物的定量利用三重四級(jí)桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式分析完成[17]。獲得不同樣本的代謝物質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)后，對(duì)所有物質(zhì)質(zhì)譜峰進(jìn)行峰面積積分，并對(duì)其中同一代謝物在不同樣本中的質(zhì)譜出峰進(jìn)行積分校正[18]，利用Analyst"1.6.3軟件處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)，每個(gè)色譜峰的峰面積代表對(duì)應(yīng)物質(zhì)的相對(duì)含量。采用多元統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)4組樣品進(jìn)行主成分分析（PCA）[19-20]、聚類分析，根據(jù)正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）法預(yù)測(cè)模型的可靠性。采取將fold"change和OPLS-DA模型的VIP值相結(jié)合的方法篩選差異代謝物，fold"change值為2倍以上或0.5倍以下，POLS-DA的VIP≥1則認(rèn)為差異顯著[21]。對(duì)差異顯著的代謝物采用unit"variance"scaling（UV）歸一化處理，通過(guò)R軟件pheatmap包繪制熱圖[22]。利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)[23]對(duì)差異代謝物通路類型進(jìn)行分類、KEGG富集分析。

2""結(jié)果與分析

2.1""不同成熟度桂葡柚1號(hào)果實(shí)品質(zhì)

由表2可知，G2、G3的單果質(zhì)量、果實(shí)縱、橫徑均與CK差異顯著，G1與各比較組差異均不顯著；G3的果皮厚度最厚，與CK、G1、G2差異顯著，CK、G1、G2之間差異不顯著，原因可能是在2019年12月9日采摘G3樣品時(shí)，果實(shí)出現(xiàn)浮皮現(xiàn)象；G2的可溶性固形物最高，G3與G1、G2差異顯著，G1、G2之間差異不顯著。原因可能是2019年10月21日至2019年11月14日為可溶性固形物快速上升期，但在2019年12月9日前果實(shí)可溶性固形物已開始下降；可滴定酸從高到低依次是CK、G1、G2、G3，且差異顯著，說(shuō)明2019年9月28日至12月9日期間果實(shí)可滴定酸持續(xù)下降；CK、G1、G2的固酸比逐漸上升，且差異顯著，G2與G3差異不顯著。此外，各比較組果形指數(shù)差異不顯著。

2.2""代謝組樣本質(zhì)控及統(tǒng)計(jì)分析

采用多元統(tǒng)計(jì)對(duì)樣本（含質(zhì)控樣品）開展主成分（PCA）分析（圖1），PCA結(jié)果顯示檢測(cè)分析樣品之間代謝組有分離趨勢(shì)，其中CK、G1、G2各比較組之間在主成分PC1上分離明顯，G2與G3在PC1上分離不明顯，但在PC2上存在顯著分離，因此，各樣品數(shù)據(jù)處理結(jié)果可信，能從總體上反映出不同采收時(shí)期桂葡柚1號(hào)果肉之間的代謝物差異。建立PLS-DA、OPLS-DA模型的R2和Q2模型進(jìn)行分析（表3），PLS-DA模型各比較組的R2X≥0.780，R2Y≥0.999，Q2≥0.956；OPLS-DA模型各比較組的R2X≥0.710，R2Y=1，Q2≥0.982。2個(gè)模型Q2均大于0.9，為出色模型。同時(shí)對(duì)模型進(jìn)行200次排列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果顯示R2Y'和Q2'都小于原始模型R2Y和Q2，因此該模型有意義，可根據(jù)VIP值來(lái)分析篩選差異代謝物。

2.3""桂葡柚1號(hào)代謝物成分總體分析

從桂葡柚1號(hào)中共檢測(cè)出529種代謝物，根據(jù)種類從多到少，依次為黃酮159種，種類占比30%；氨基酸及其衍生物和酚酸類各64種，種類占比均為12%；其他類（其中糖及醇類42種，維生素9種）53種，占比10%；脂質(zhì)51種，占比9.6%；木脂素和香豆素40種，占比7.5%；核苷

酸及其衍生物34種，占比6.4%；生物堿29種，占比5.4%；有機(jī)酸28種，占比5.2%；萜類和鞣質(zhì)類種類最少（圖2）。

2.4""不同成熟度桂葡柚1號(hào)差異代謝物分析

對(duì)所檢樣品的代謝物進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示（圖3），隨著果實(shí)逐漸成熟，代謝物的相對(duì)含量發(fā)生變化?？傮w上，相對(duì)含量減少的代謝物較多（代謝物在圖上標(biāo)注的顏色從綠色變?yōu)榧t色，即相對(duì)含量逐漸增加，代謝物在圖上標(biāo)注的顏色從紅色變?yōu)榫G色，即相對(duì)含量逐漸減少）。

2.4.1""差異代謝物篩選分析""各比較組總體差異代謝物以下調(diào)為主，按照物質(zhì)一級(jí)分類，下調(diào)的代謝物較多的種類主要有氨基酸及其衍生物、脂質(zhì)、酚酸類、其他類、核苷酸及其衍生物、生物堿等，上調(diào)代謝物較多的主要為木脂素和香豆素，萜類、有機(jī)酸的上調(diào)和下調(diào)種類均較少。CK"vs"G1差異代謝物主要是黃酮，且以下調(diào)種類為主，其中金圣草黃素等3種上調(diào)，異槲皮苷等9種下調(diào)；

G2"vs"CK差異代謝物增多，下調(diào)代謝物有N-丙酰甘氨酸、L-天冬酰胺、咖啡酸、阿魏酸、綠原酸、單棕櫚酸甘油酯、溶血磷脂酰膽堿14：0"（2n異構(gòu)）、異槲皮苷、繡線菊苷、辛弗林、甜菜苷、莽草酸、異歐前胡素等49種，其中下調(diào)代謝物以黃酮、脂質(zhì)、酚酸、氨基酸及其衍生物為主，上調(diào)的代謝物有對(duì)-香豆醇、松柏醇、金圣草黃素、橙皮素O-丙二酰己糖苷、松脂醇、去乙酰諾米林、琥珀酸等19種，上調(diào)代謝物以木脂素、香豆素和酚酸為主；G3"vs"CK下調(diào)代謝物增加至59種，包括乙酰色氨酸、煙胺、原兒茶酸、胞嘧啶、佛手柑素、檸檬苦素、諾米林酸、石榴酸等，上調(diào)代謝物增加至23種，包括L-脯氨酸、異甜橙素等，相對(duì)于G2"vs"CK，下調(diào)的黃酮種類減少，上調(diào)的黃酮種類有所增加。

2.4.2nbsp;"差異代謝物變化趨勢(shì)分析""從表4可以看出，各組的氨基酸及其衍生物差異代謝物共13種，其中L-谷氨酸、DL-谷氨酸、L-天冬酰胺、組胺、氨基乙酰基苯丙氨酸等12種均下調(diào)，僅L-脯氨酸上調(diào)；脂質(zhì)差異代謝物共14種，其中溶血磷脂酰膽堿15：0、溶血磷脂酰膽堿17：0、2，3-二羥基丙基-9，12，15-十八碳三酸酯-己糖、9，10-環(huán)氧十八碳二烯酸、石榴酸等13種均下調(diào)，僅二十碳二烯酸上調(diào)，且各比較組下調(diào)氨基酸及其衍生物和脂質(zhì)的相對(duì)含量大多為CKgt;G1gt;"G2gt;G3，即隨著果實(shí)的成熟度增加，代謝物相對(duì)含量持續(xù)下降?？傮w上兩類下調(diào)差異代謝物的相對(duì)含量均大于上調(diào)差異代謝物相對(duì)含量，在桂葡柚1號(hào)成熟度上升時(shí)，果肉中氨基酸及其衍生物和脂質(zhì)的總含量均下降。

由表5可見(jiàn)，各組的差異代謝物中，屬酚酸類的有18種，期間有下調(diào)表達(dá)的為11種，有上調(diào)表達(dá)的為7種。各組的原兒茶酸、香草酸、咖啡酸、阿魏酸、1-O-[（E）-咖啡酰]-β-D-吡喃葡萄糖、阿魏酰葡萄糖、β-D-呋喃果糖基-α-"D-（6-芥子?；┢咸烟擒盏?種酚酸相對(duì)含量均為CKgt;G1gt;G2gt;G3；阿魏酰蘋果酸、新綠原酸*、隱綠原酸等3種酚酸相對(duì)含量為CKgt;G1gt;G2，G3組的相對(duì)含量略大于G2，但遠(yuǎn)小于G1組；阿魏酰芥子酰酒石酸相對(duì)含量為G1組最高，CK和G3組相當(dāng)，G2最低。各組的對(duì)-香豆醇、利波腺苷、松柏醇、3-O-對(duì)香豆?？鼘幩?、順-3-對(duì)香豆酰奎寧酸、芥子酸吡喃葡萄糖酯等6種酚酸相對(duì)含量G3gt;G2gt;G1gt;CK，二-O-沒(méi)食子酸甲酯G1和G2組較高，CK和G3組較低。隨著果實(shí)的成熟，酚酸差異代謝物大部分相對(duì)含量逐漸減少，呈下調(diào)趨勢(shì)。

黃酮差異代謝物變化趨勢(shì)見(jiàn)表6。各組的黃酮差異代謝物共20種，其中7，8-二羥基-"5，6，4′-三甲氧基黃酮、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷（金絲桃苷）*、繡線菊苷、橙皮素5-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-（6″-O-乙酰）-半乳糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷（異槲皮苷）*、槲皮素-7-O-（6″-O-丙二?；?β-D-葡萄糖苷、異鼠李素半乳糖-鼠李糖、柚皮黃素3-O-（3-羥基-3-甲基戊二酸）-葡萄糖苷）、山奈酚-3-O-（6″-O-乙酰）-葡萄糖苷等10種黃酮相對(duì)含量均在成熟初期至中期持續(xù)降低，CKgt;G1gt;G2，尤其在CK至G1時(shí)期大幅下降。成熟后期（G3）相對(duì)含量又開始增加，即隨著果實(shí)成熟度增加，10種黃酮相對(duì)含量呈先下降后上升趨勢(shì)。槲皮素-O-乙?；禾擒障鄬?duì)含量在G1急劇下降至最低水平。槲皮素-3-O-（2″-O-乙酰基）-β-D-葡萄糖醛酸相對(duì)含量在G2最低，G3又有上升。2′-羥基-"3，4，5，4′6′-五甲氧基查耳酮相對(duì)含量在G3最低。異甜橙素、橙皮素O-丙二酰己糖苷等2種黃酮在各時(shí)期的相對(duì)含量為G3gt;G2gt;G1gt;CK，持續(xù)增加。CK至G3，五羥黃酮相對(duì)含量先下降，后上升又下降；金圣草黃素、山奈酚-3-O-β-"（2″-O-乙酰基-β-D-葡萄糖醛酸）的相對(duì)含量先上升，后下降又上升；6，7，8-三羥基-5-甲氧基黃酮先持續(xù)上升后下降。

本研究還發(fā)現(xiàn)，辛弗林、亞精胺、甜菜苷、諾米林酸、（-）-莽草酸相對(duì)含量為CKgt;G1gt;G2gt;G3，呈持續(xù)下降趨勢(shì)；檸檬苦素的相對(duì)含量在CK至G1時(shí)增加，G1至G3時(shí)逐漸減少，呈先上升后下降趨勢(shì)。

2.4.3""主要差異代謝物成分分析""CK"vs"G1、G1"vs"G2、G2"vs"G3、CK"vs"G3對(duì)比差異倍數(shù)圖列出了差異倍數(shù)排在前20（上調(diào)和下調(diào)）的代謝物（圖4）。結(jié)果顯示，在不同成熟階段的桂葡柚1號(hào)葡萄柚中，上調(diào)和下調(diào)的主要差異代謝物不盡相同。CK"vs"G1中，下調(diào)倍數(shù)從大到小依次是黃酮類物質(zhì)槲皮素-O-乙酰基己糖苷（pmb3026）11.19倍，萜類物質(zhì)熊果酸（mws4053）8.01倍，黃酮類物質(zhì)槲皮素-7-O-（6″-O-丙二酰基）-β-D-葡萄糖苷（pmp000589）1.95倍等，上調(diào)倍數(shù)從大到小依次是生物堿椰油酰胺丙基甜菜堿（pmb2211）2.77倍，黃酮類物質(zhì)金圣草黃素（pmp001127）2.59倍，木脂素松脂醇單葡萄糖苷（pmn001378）2.4倍等，主要差異代謝物為黃酮類、萜類、生物堿、木脂素；G1"vs"G2中，下調(diào)倍數(shù)從大到小依次是酚酸類物質(zhì)阿魏酰蘋果酸（Lmhn003074）2.03倍，香豆素異歐前胡素（pmf0526）2.0倍，酚酸類物質(zhì)阿魏酰芥子酰酒石酸（Lmhn003801）1.64倍等，上調(diào)倍數(shù)較大的有酚酸類物質(zhì)對(duì)-香豆醇（mws 0921）10.55倍，木脂素松脂醇單葡萄糖苷（pmn 001378）2.32倍、松脂醇（mws0097）1.49倍，主要差異代謝物為酚酸類、香豆素、木脂素；G2"vs"G3中，下調(diào)倍數(shù)從大到小依次是黃酮類物質(zhì)2′-羥基-3，4，5，4′6′-五甲氧基查耳酮（Lmjp003722）8.37倍，脂質(zhì)單棕櫚酸甘油酯（pmp001284）7.88倍，其他類黃柏酸（Lmzp003694）3.58倍，上調(diào)倍數(shù)較大的有香豆素異氧化前胡內(nèi)酯（pmp 000021）9.47倍、異歐前胡素（pmf0526）3.56倍，黃酮類物質(zhì)繡線菊苷（mws0856）4.59倍，主要差異代謝物為黃酮類、脂質(zhì)、其他類、香豆素。從整個(gè)成熟期來(lái)看，下調(diào)倍數(shù)從高到低依次是黃酮類物質(zhì)槲皮素-"O-乙?；禾擒?1.19倍，脂質(zhì)單棕櫚酸甘油酯9.09倍，黃酮類物質(zhì)2′-羥基-3，4，5，4′6′-五甲氧基查耳酮8.37倍；上調(diào)倍數(shù)從高到低依次是黃酮類物質(zhì)對(duì)-香豆醇11.73倍，香豆素異氧化前胡內(nèi)酯9.47倍，木脂素松脂醇單葡萄糖苷5.15倍等，主要差異代謝物為黃酮類、脂質(zhì)、酚酸類、香豆素、木脂素。

2.4.4""差異代謝物通路分析""將差異代謝物進(jìn)行KEGG通路富集，結(jié)果顯示（圖5），CK"vs"G1中鑒定出的30種顯著差異代謝物主要分布在8條代謝途徑中，差異代謝物富集最顯著的是類黃酮生物合成通路（flavonoid"biosynthesis），其次是紅色代表差異表達(dá)代謝物上調(diào)，綠色代表差異表達(dá)代謝下調(diào)物。

黃酮和黃酮醇生物合成通路（flavone"and"flavonol"biosynthesis）；G1"vs"G2中鑒定出的24種顯著差異代謝物主要分布在12條代謝途徑中，差異代謝物富集最顯著的是苯丙烷生物合成通路（pheny l propanoid"biosynthesis），其次是嘧啶代謝通路（pyrimidine"metabolism）；G2"vs"G3中鑒定出來(lái)的25種顯著差異代謝物主要分布在9條代謝途徑中，差異代謝物富集最顯著的是賴氨酸降解通路（lysine"degradation），其次是嘧啶代謝通路；CK"vs"G2中鑒定出的68種顯著差異代謝物主要分布在20條代謝途徑中，差異代謝物富集最顯著的是苯丙烷生物合成通路，其次是甘油磷脂代謝通路（glycerophospholipid"metabolism）；G1"vs"G3中鑒定出的52種顯著差異代謝物主要分布在20條代謝途徑中，差異代謝物富集最顯著的是苯丙烷生物合成通路，其次是嘧啶代謝通路；CK"vs"G3中鑒定出的82種差異代謝物，差異代謝物富集最顯著的是苯丙烷生物合成通路，其次是次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成通路（Biosynthesis"of"secondary"metabolites）。

3""討論

黃酮類化合物是柑橘中重要的生物活性物質(zhì)，不僅是柑橘植株重要的抗逆物質(zhì)，也是柑橘果實(shí)發(fā)揮抗氧化、抗炎癥等食用和藥用價(jià)值的重要原因；對(duì)柑橘黃酮類物質(zhì)進(jìn)行組分鑒別和定量研究，有助于延長(zhǎng)柑橘產(chǎn)業(yè)鏈，為開發(fā)柑橘食藥產(chǎn)品建立基礎(chǔ)[24]。類黃酮是葡萄柚主要功能成分之一[25]，具有抗氧化、抗炎、降低膽固醇、抗菌及抗癌等功效。葡萄柚具有較強(qiáng)的生物活性，雞尾葡萄柚所含類黃酮種類明顯多于普通柚類品種[26]。基于廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)檢測(cè)到的桂葡柚1號(hào)黃酮多達(dá)159種，包括柚皮苷、枸橘苷、橙皮苷、新橙皮苷、蕓香柚皮苷、忍冬苷、木犀草苷、柚皮素、橙皮素、異槲皮苷、金絲桃苷等，具有很好的保健價(jià)值。檢測(cè)到氨基酸及其衍生物64種，包括賴氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、纈氨酸等8種人體必需氨基酸，和人體半必需氨基酸精氨酸，以及多種非必需氨基酸和氨基酸衍生物。氨基酸種類較齊全，營(yíng)養(yǎng)豐富，兼具食用和藥用價(jià)值，其中蛋氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸是評(píng)價(jià)食品及中藥材品質(zhì)的重要指標(biāo)[27]，天冬氨酸和谷氨酸是鮮味氨基酸，蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸和絲氨酸是甜味氨基酸，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸是芳香族氨基酸[28]。此外，谷胱甘肽還原型能明顯改善原發(fā)性肝癌介入治療引起的肝功能損害，有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值[29]。研究發(fā)現(xiàn)酚酸類化合物具有抗氧化、抗炎、抑菌、抗糖尿病、抗癌等多種生物活性，因此酚酸類化合物可以應(yīng)用于傳統(tǒng)藥物或作為膳食補(bǔ)充劑應(yīng)用于現(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)制品中[30]。動(dòng)物和人自身不能合成酚酸，主要通過(guò)食物獲得，水果、蔬菜、豆類、谷物等都是很好的酚酸來(lái)源，此外果汁、茶、啤酒、咖啡等飲品中酚酸含量也很豐富[31]。桂葡柚1號(hào)中檢測(cè)到酚酸類化合物64種，包括有抗炎作用的阿魏酸、綠原酸、咖啡酸等，有抗氧化作用的咖啡酸、綠原酸、阿魏酸、芥子酸、原兒茶酸、香草酸、丁香酸等，有抑菌作用的原兒茶酸、香草酸、咖啡酸等，有對(duì)乳腺癌、肝癌、肺癌、血癌、宮頸癌等具有抗癌活性的綠原酸、咖啡酸、阿魏酸等[30]。由此可見(jiàn)，桂葡柚1號(hào)代謝物功能成分多，可對(duì)其健康功效開展相關(guān)研究，并加以利用。

本研究中，桂葡柚1號(hào)果實(shí)不同成熟度果肉代謝物表達(dá)存在差異。隨著果實(shí)的成熟，果肉中上調(diào)差異代謝物和下調(diào)差異代謝物種類均呈上升趨勢(shì)，到成熟后期，增速有所下降，但總體上，下調(diào)差異代謝物種類多于上調(diào)差異代謝物種類，且下調(diào)差異表達(dá)顯著的代謝物中，包含諸多功能成分代謝物。不同成熟階段的主要差異代謝物不盡相同，成熟初期為黃酮類、萜類、生物堿、木脂素，中期為酚酸類、香豆素、木脂素，后期黃酮類、脂質(zhì)、其他類、香豆素。隨著果實(shí)成熟度增加，果肉中下調(diào)差異表達(dá)顯著的氨基酸及其衍生物、脂質(zhì)種類增加，只有脯氨酸、二十碳二烯酸上調(diào)，這與前人的研究結(jié)果基本相符。牟蛟琳等[32]對(duì)高班柚、代代酸橙、夏橙、稻葉溫州蜜柑、本地早橘、尤力克檸檬6個(gè)柑橘品種檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，氨基酸的總含量、脂類物質(zhì)含量均隨著果實(shí)的成熟而降低，有色層中脯氨酸的相對(duì)含量隨著果實(shí)的成熟而增加。董昕穎[33]研究發(fā)現(xiàn)尤力克檸檬果皮和果肉中17種氨基酸的總含量均隨著成熟度的增加而下降。同時(shí)，隨著果實(shí)的成熟，果肉中酚酸類物質(zhì)下調(diào)差異表達(dá)顯著的種類增加，成熟中后期包括原兒茶酸、香草酸、咖啡酸、阿魏酸、新綠原酸*、隱綠原酸等，這與前人研究結(jié)果較一致。徐貴華等[34]對(duì)不同成熟期蜜桔中酚酸的研究表明，果肉中綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、原兒茶酸、香草酸等酚酸含量隨成熟度提高而減少。前人通過(guò)對(duì)東風(fēng)早柚等品種的研究，發(fā)現(xiàn)同一品種、同一部位篩查出的酚酸種類數(shù)量無(wú)明顯變化，但柚果實(shí)不同成熟期的生物活性成分含量有差異，隨著果實(shí)成熟度的上升，測(cè)定的酚酸含量大多降低[35]。黃酮差異代謝物下調(diào)種類多于上調(diào)，且先增加后減少，在成熟中期最多。大部分下調(diào)黃酮代謝物相對(duì)含量在成熟初期大幅下降，在成熟后期又有上升，其中異槲皮苷、繡線菊苷、金絲桃苷等僅在成熟初期至中期下調(diào)差異表達(dá)顯著，這與對(duì)四季柚、文旦（授粉和未授粉）和早香柚４種柚的研究結(jié)果相同，隨著果實(shí)成熟度的增加，果肉中的黃酮類物質(zhì)含量多數(shù)在下降，并且初期急劇下降[35]。檸檬苦素和諾米林酸在成熟后期下調(diào)差異顯著，這與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較符合。但俊峰[36]對(duì)不同生長(zhǎng)期柚果中功能性成分的分析顯示，多數(shù)情況下，檸檬苦素類物質(zhì)的含量是隨成熟度上升而下降。張耀海等[35]對(duì)柚果實(shí)不同成熟期生物活性成分開展了分析，結(jié)果表明檸檬苦素含量大多呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。張念[37]開展了柚果實(shí)不同成熟期主要營(yíng)養(yǎng)功能成分的變化規(guī)律研究，發(fā)現(xiàn)東風(fēng)早柚、琯溪蜜柚、梁平柚、長(zhǎng)壽沙田柚、豐都紅心柚和龍安柚6種柚果類檸檬苦素的總含量均隨著成熟期的延長(zhǎng)呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。有機(jī)酸甲基馬來(lái)酸、莽草酸相對(duì)含量持續(xù)下降，琥珀酸相對(duì)含量持續(xù)上升。劉淑楨等[38]研究發(fā)現(xiàn)，國(guó)慶1號(hào)溫州蜜柑果實(shí)隨著成熟度上升，多種有機(jī)酸呈現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)，但多數(shù)有機(jī)酸含量逐漸降低。本研究還發(fā)現(xiàn)辛弗林、亞精胺、甜菜苷等代謝物的相對(duì)含量在果實(shí)成熟度上升時(shí)持續(xù)減少。

不同成熟階段，富集差異代謝物通路不同。果實(shí)成熟初期富集最顯著的為類黃酮生物合成通路，其次是黃酮和黃酮醇生物合成通路類，與此時(shí)期黃酮類差異代謝物大部分相對(duì)含量大幅下降，黃酮類生物合成降低有關(guān)。果實(shí)成熟中期富集最顯著的為苯丙烷生物合成通路，后期為賴氨酸降解通路。整個(gè)成熟期差異代謝物富集最顯著的是苯丙烷生物合成通路。黃酮類化合物是來(lái)源于植物的一類重要的次生代謝產(chǎn)物，"具有抗癌、抗氧化、抗炎、降低血管脆性等多種藥理作用[39]。苯丙烷代謝作為植物重要的次級(jí)代謝途徑之一，在調(diào)控植物適應(yīng)性生長(zhǎng)的過(guò)程中發(fā)揮著重要功能，還與眾多藥用活性成分的合成息息相關(guān)[40]。因此，隨著果實(shí)成熟度上升，果肉中諸多生物活性物質(zhì)含量下降。

根據(jù)對(duì)桂葡柚1號(hào)生長(zhǎng)發(fā)育習(xí)性的觀測(cè)，其果汁含量在7—8月份急劇增加，之后增速緩慢，10月底后不再增加，其果實(shí)口感一般在9月底（CK）已較好，隨著果實(shí)逐漸成熟，可溶性固形物增加，固酸比提高，口感變好，12月上旬（G3）果實(shí)開始出現(xiàn)可溶性固形物開始下降、浮皮等現(xiàn)象。因此，應(yīng)根據(jù)用途確定桂葡柚1號(hào)果實(shí)采摘成熟度。

4""結(jié)論

桂葡柚1號(hào)果肉代謝物種類多，營(yíng)養(yǎng)和功能成分豐富，生物活性較強(qiáng)，具有很好的食用和保健價(jià)值，本研究為其營(yíng)養(yǎng)和健康功效研究奠定基礎(chǔ)。隨著果實(shí)的成熟，果肉代謝物種類、含量及果實(shí)品質(zhì)均在發(fā)生變化。在廣西南部地區(qū)，桂葡柚1號(hào)果實(shí)從9月底進(jìn)入成熟期，在10月下旬至12上旬口感均佳，適宜鮮食，但至10月下旬，果肉中少量黃酮等功能成分下調(diào)差異顯著，至11月中旬，下調(diào)差異顯著的黃酮、酚酸、氨基酸及其衍生物、脂質(zhì)等功能成分物質(zhì)種類大量增加，用于保健或藥用的果應(yīng)根據(jù)功效需求提前采摘。

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