【摘要】目的 探究攜帶人表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）的RNA納米顆粒作為新型藥物遞送囊泡搭載紫杉醇，對(duì)于結(jié)腸腫瘤細(xì)胞的增殖及凋亡水平的影響，以為臨床治療結(jié)腸腫瘤提供參考。方法 將人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞系細(xì)胞按照處理的方式不同分為3個(gè)組別，分別為A組（單純紫杉醇干預(yù)，干預(yù)濃度60 ng/mL）、B組（包裹紫杉醇的RNA納米顆粒干預(yù)）及C組（包裹紫杉醇并搭載EGFR的RNA納米顆粒干預(yù)），每組約2×104個(gè)細(xì)胞，直接在培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的干預(yù)藥物，3組的培養(yǎng)時(shí)間均為24 h。通過(guò)流式細(xì)胞儀及共聚焦顯微鏡檢測(cè)Alexa647偶聯(lián)的搭載EGFR適配體的三接頭RNA（EGFRapt-3WJ）納米顆粒在結(jié)腸細(xì)胞系HCT116中的EGFR靶向能力；采用CCK8法檢測(cè)RNA納米顆粒搭載紫杉醇治療后結(jié)腸腫瘤細(xì)胞的增殖水平；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡水平；采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（BCL-2）及B淋巴細(xì)胞瘤-2基因相關(guān)X蛋白（Bax）表達(dá)水平。結(jié)果 共聚焦顯微鏡結(jié)果證實(shí)，攜帶了EGFR抗體的AF647標(biāo)記三接頭RNA（3WJ-EGFRapt-AF647）納米顆粒對(duì)于結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116具有出色的特異性靶向能力；C組細(xì)胞吸光度值（OD）值低于A、B組，且A組低于B組；C組細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率均高于A、B組，且A組高于B組；C組細(xì)胞BCL-2蛋白表達(dá)水平均低于A、B組，且A組低于B組，Bax蛋白表達(dá)水平高于A、B組，且A組高于B組（均Plt;0.05）。結(jié)論 攜帶EGFR適配體的RNA納米顆粒具備靶向遞送紫杉醇的特點(diǎn)，顯著抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能力，并能促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】結(jié)腸腫瘤 ; RNA納米顆粒 ; 紫杉醇 ; 表皮生長(zhǎng)因子受體 ; B淋巴細(xì)胞瘤-2基因 ; B淋巴細(xì)胞瘤-2基因相關(guān)X蛋白

【中圖分類號(hào)】R735.3+5 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2096-3718.2024.24.0032.05

DOI：10.3969/j.issn.2096-3718.2024.24.010

結(jié)腸癌是常見(jiàn)的發(fā)生于結(jié)腸部位的消化道惡性腫瘤，早期癥狀不明顯，隨著癌腫的增大而表現(xiàn)出排便習(xí)慣改變、便血、腹瀉、局部腹痛等癥狀，晚期則表現(xiàn)貧血、體質(zhì)量減輕等全身癥狀，該病是全球第3大常見(jiàn)癌癥，是全球主要致死癌癥之一[1]。目前化療依舊是結(jié)腸癌治療術(shù)后最常用的治療方案之一。紫杉醇是結(jié)腸癌化療方案的核心用藥，可以有效提高患者的生存率并延長(zhǎng)生存期，但其水溶性差，且有一定的肝腎損害、神經(jīng)毒性等，給其臨床應(yīng)用帶來(lái)了一定的阻礙[2]。RNA納米顆粒作為藥物遞送系統(tǒng)的一個(gè)新興領(lǐng)域，將紫杉醇搭載于RNA納米顆粒中，其價(jià)值在于能夠提高其水溶性和生物利用度，然而單純的納米顆粒載體因其缺乏靶向性在治療中依舊表現(xiàn)不佳[3]。表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）是普遍存在于結(jié)腸癌細(xì)胞表面的抗體，因此本研究在RNA納米顆粒載體表面添加EGFR的適配體，能夠顯著增加結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)搭載紫杉醇RNA納米顆粒的內(nèi)吞，有望增強(qiáng)其結(jié)腸癌細(xì)胞靶向性，起到很好抗結(jié)腸癌細(xì)胞分裂、增殖的作用，同時(shí)降低對(duì)正常組織的毒性，減少不良反應(yīng)[4]。因此，本研究旨在探索攜帶EGFR適配體的RNA納米顆粒作為新型藥物遞送囊泡搭載紫杉醇，驗(yàn)證其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的靶向能力及增殖、凋亡的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要藥物、試劑及儀器 人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞系（廈門逸漠生物科技有限公司）。紫杉醇注射液（海南紫杉園制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20066558，規(guī)格：5 mL∶30 mg），DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、磷酸平衡鹽溶液（Gibco），胰酶（Merck），凋亡試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），基質(zhì)膠（武漢賽維爾生物科技有限公司），聚乙二醇生物素（Alexa Fluor-647）（Thermo Fisher Scientific），B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（BCL-2）、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因相關(guān)X蛋白（Bax）及β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）（Abcam）等。流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson And Company，型號(hào)：FACSCanto），二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱（（Thermo Fisher Scientific），型號(hào)：Heracell 150i），Multi-Chemiluminescence成像系統(tǒng)（天能科學(xué)有限公司，型號(hào)：Tanon 5200），共聚焦顯微鏡（Olympus，型號(hào)：fv 3000），倒置熒光顯微鏡（Olympus，型號(hào)：CKX53）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞在含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素 - 鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱中充入5% CO2。細(xì)胞鋪滿細(xì)胞瓶以后胰酶消化后傳代，本實(shí)驗(yàn)取2～3代的結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞處理 細(xì)胞按照處理的方式不同分為3個(gè)組別：A組（單純紫杉醇干預(yù)，紫杉醇濃度為60 ng/mL）、B組（包裹紫杉醇的RNA顆粒干預(yù)）及C組（包裹紫杉醇并搭載EGFR的RNA顆粒干預(yù)），每組約2×104個(gè)細(xì)胞，直接在培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的干預(yù)藥物，3組的培養(yǎng)時(shí)間均為24 h。具體的包裝搭載方法可見(jiàn)1.2.3及1.2.4。

1.2.3 納米顆粒的設(shè)計(jì)與制備 委托微納生物醫(yī)藥（廣州）有限公司成功構(gòu)建并合成了2'F-修飾的3WJ納米顆粒及其相匹配的2'F-修飾RNA寡核苷酸鏈。具體而言，搭載EGFR適配體的三接頭RNA（3WJ-EGFRapt）納米顆粒集成了兩大功能模塊，即Alexa Fluor-647熒光標(biāo)記與針對(duì)EGFR的特異性RNA適配體（EGFRapt）。對(duì)照組則采用不含EGFRapt靶向模塊的3WJ納米顆粒，其中小寫字母標(biāo)識(shí)的核苷酸均經(jīng)過(guò)2'F-修飾。為確保RNA寡核苷酸在納米顆粒組裝前的純度超過(guò)95%，采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）或高效液相色譜（HPLC）技術(shù)對(duì)其進(jìn)行純化。

RNA納米顆粒的組裝過(guò)程如下：首先，在1x三羥甲基甲胺基乙磺酸（TES）緩沖溶液[包含50 mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl），pH值7.5；50 mM氯化鈉（NaCl）；1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）]中，將等摩爾比的單個(gè)RNA寡核苷酸混合均勻；然后，將溶液加熱至90 ℃并保持5 min，隨后逐步冷卻至4 ℃并維持90 min。最后，利用含有89 mM Tris-硼酸和2 mM EDTA的TBE緩沖溶液的8%原生PAGE凝膠，對(duì)RNA納米顆粒進(jìn)行分離。

1.2.4 含PTX的RNA納米顆粒的設(shè)計(jì)與構(gòu)建 如前1.2.3中所述，在紫杉醇分子中引入一個(gè)炔基，同時(shí)在RNA寡核苷酸鏈的特定位置引入一個(gè)疊氮基，以此形成一個(gè)穩(wěn)定的三唑環(huán)結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)紫杉醇分子與RNA納米顆粒的寡核苷酸鏈的牢固連接。

1.2.5 共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞顆粒結(jié)合情況 結(jié)腸癌細(xì)胞（約2×104個(gè)）在24孔板玻璃載玻片上生長(zhǎng)，并置于培養(yǎng)基中。16 h后，向培養(yǎng)基中加入3WJ-EGFRapt-AF647或3WJ-AF647納米顆粒，37 ℃孵育4 h。再用Alexa Fluor 488凝集素和DAPI染色細(xì)胞骨架和細(xì)胞核。至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，并用共聚焦顯微鏡觀察評(píng)估細(xì)胞結(jié)合情況。

1.2.6 CCK8檢測(cè) 采用CCK8試劑盒檢測(cè)藥物細(xì)胞毒性。干預(yù)后的3組結(jié)腸癌細(xì)胞以40%濃度接種到96孔板，在含5% CO2、濕度50%的培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，處理培養(yǎng)48 h。加入CCK8染料溶液，37 ℃孵育2 h，用Synergy 4讀數(shù)器記錄450 nm吸光度值（OD），計(jì)算細(xì)胞活力。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平 干預(yù)后的3組結(jié)腸癌細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心5 min后，以磷酸鹽緩沖液重懸清洗細(xì)胞，再度1 000 r/min、5 min離心后，棄上清，加入膜外磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白V（Annexin V）和丙碘胺（PI）染色15 min避光染色。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次獨(dú)立操作。

1.2.8 蛋白免疫印跡法檢測(cè)基因表達(dá)水平 結(jié)腸癌細(xì)胞在3個(gè)不同的方式干預(yù)后分別于RIPA裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑中4 ℃裂解30 min。裂解液在高速離心機(jī)10 000 r/min，4 ℃下離心5 min。蛋白上清液在SDS-PAGE上分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上印跡，AzureSpot PRO成像軟件進(jìn)行密度分析。以β-actin為對(duì)照組，計(jì)算凋亡相關(guān)蛋白BCL-2及Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用GraphPad Prism 7數(shù)據(jù)分析繪圖軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組樣本之間比較采用單因素?方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)?。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組別的細(xì)胞靶向和內(nèi)化 共聚焦顯微鏡觀察納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部過(guò)程，見(jiàn)圖1。A和E為DAPI標(biāo)記細(xì)胞核、B和F為Phil-488標(biāo)記細(xì)胞骨架、C和G為納米顆粒標(biāo)記，D和H為混合圖，EGFRapt-偶聯(lián)的RNA納米顆粒被內(nèi)吞，見(jiàn)圖H；隨后以EGFRapt為靶點(diǎn)將PTX運(yùn)送至癌細(xì)胞中，見(jiàn)圖H。這表明EGFRapt-3WJ納米顆粒能有效地靶向HCT116細(xì)胞進(jìn)行結(jié)合。

2.2 3組細(xì)胞OD值比較 C組細(xì)胞OD值均低于A、B組，且A組低于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05），見(jiàn)表1、圖2。

2.3 3組腫瘤細(xì)胞凋亡水平比較 C組細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率均高于A組和B組，且A組高于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05），見(jiàn)表2、圖3。

2.4 3組細(xì)胞BCL-2、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 Bax蛋白的上調(diào)和Bcl-2蛋白的下調(diào)共同促進(jìn)細(xì)胞凋亡的進(jìn)程，蛋白免疫印跡法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，C組細(xì)胞BCL-2蛋白表達(dá)水平均低于A、B組，且A組低于B組，Bax蛋白表達(dá)水平均高于A、B組，且A組高于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05），見(jiàn)表3、圖4。

3 討論

紫杉醇作為抗腫瘤藥物，通過(guò)穩(wěn)定微管抑制細(xì)胞分裂，從而阻止癌細(xì)胞的增殖，常用于結(jié)腸癌的治療中，尤其是與其他化療藥物聯(lián)合應(yīng)用，可提高療效，延長(zhǎng)生存期并提高生活質(zhì)量[5]。紫杉醇作為一種廣泛應(yīng)用于臨床的抗腫瘤藥物，屬于細(xì)胞微管抑制劑，通過(guò)促進(jìn)微管蛋白二聚體的組合并阻止其解聚，達(dá)到穩(wěn)定微管的作用，從而抑制了對(duì)于分裂間期和有絲分裂期細(xì)胞功能至關(guān)重要的微管的正常動(dòng)態(tài)重組，將細(xì)胞周期阻斷于G2/M期，導(dǎo)致有絲分裂異?；蛲Ｖ?，阻礙腫瘤細(xì)胞復(fù)制，使癌細(xì)胞無(wú)法繼續(xù)分裂而死亡。紫杉醇在臨床治療結(jié)腸癌上效果顯著，但存在顯著缺點(diǎn)，紫杉醇溶解度低，是技術(shù)難題，影響其體內(nèi)吸收、分布及代謝[6]。因此，需搭載特殊的溶劑或載體給藥，增加治療的靶向性和有效性。因此，本研究團(tuán)隊(duì)經(jīng)過(guò)精心設(shè)計(jì)并成功構(gòu)建了一種獨(dú)特的3WJ納米顆粒，這種納米顆粒巧妙地融合了Alexa Fluor-647熒光成像技術(shù)模塊。納米顆粒作為藥物載體本身往往缺乏足夠的靶向性，因此需要針對(duì)特定的靶細(xì)胞進(jìn)行修飾，通過(guò)添加特定的靶向配體來(lái)提高其靶向能力[7]。EGFR是一種與結(jié)腸癌密切相關(guān)的受體，它廣泛表達(dá)于細(xì)胞表面，在結(jié)腸癌細(xì)胞中常常出現(xiàn)過(guò)度表達(dá)或擴(kuò)增現(xiàn)象，這與疾病的產(chǎn)生、發(fā)展及預(yù)后不良有著緊密的關(guān)聯(lián)[8]。本研究通過(guò)共聚焦顯微鏡的觀測(cè)發(fā)現(xiàn)搭載了EGFR的RNA納米粒子對(duì)HCT116細(xì)胞系顯示出比單純的RNA粒子更強(qiáng)的靶向性。這表明搭載了EGFR適配體的RNA粒子確實(shí)具備了卓越的結(jié)腸癌細(xì)胞靶向能力，這一發(fā)現(xiàn)與現(xiàn)有的相關(guān)研究結(jié)果相一致[9]。這為未來(lái)的靶向治療提供了新的可能性和研究方向。

OD值可用來(lái)衡量細(xì)胞凋亡情況。本研究中，C組細(xì)胞OD值低于A、B組，且A組低于B組，這表明RNA納米顆粒載體并沒(méi)有增強(qiáng)紫杉醇的治療效果，而搭載EGFR的納米顆粒更能促進(jìn)細(xì)胞凋亡。搭載EGFR的納米顆粒增強(qiáng)了紫杉醇對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖水平的抑制作用，并且促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡。然而未搭載EGFR的納米顆粒表現(xiàn)卻更差，這表明相較于游離紫杉醇，單純納米顆粒的搭載因其缺乏靶向性，無(wú)法有效地轉(zhuǎn)入結(jié)腸癌細(xì)胞中，導(dǎo)致紫杉醇在細(xì)胞內(nèi)的積累減少[10]。因此，盡管紫杉醇本身具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，但在本研究中，其單獨(dú)使用納米顆粒時(shí)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用并不理想，這進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了靶向藥物載體在提高治療效果方面的重要性。

增殖和凋亡是調(diào)控結(jié)腸癌進(jìn)展的關(guān)鍵細(xì)胞功能，也是紫杉醇治療癌細(xì)胞效果相關(guān)的重要評(píng)估指標(biāo)之一。BCL-2和Bax分別為抑制凋亡和促進(jìn)凋亡的蛋白，在多數(shù)腫瘤中，BCL-2表達(dá)水平升高，而B(niǎo)ax表達(dá)下降，下調(diào)BCL-2和上調(diào)Bax則能在促進(jìn)結(jié)腸癌腫瘤的凋亡[11]。本研究結(jié)果表明，C組細(xì)胞BCL-2蛋白表達(dá)水平均低于A、B組，且A組低于B組，Bax蛋白表達(dá)水平高于A、B組，且A組高于B組，這表明RNA納米顆粒載體并沒(méi)有增強(qiáng)紫杉醇的治療效果，而搭載EGFR的納米顆粒更能促進(jìn)細(xì)胞凋亡。分析其原因?yàn)?，RNA納米顆粒的作用主要是增強(qiáng)紫杉醇的水溶性；也存在單純的RNA顆粒并不能有效增強(qiáng)紫杉醇效應(yīng)的結(jié)果，研究者們推斷這是由于其較差的靶向作用及較強(qiáng)的水溶性[12]。EGFR在多種腫瘤細(xì)胞表面過(guò)度表達(dá)，因此可以作為藥物遞送的靶點(diǎn)，本研究利用RNA納米顆粒作為載體，將EGFR作為分子靶向劑標(biāo)記于納米粒子表面，從而達(dá)到結(jié)腸癌細(xì)胞靶向識(shí)別治療的目的，將紫杉醇直接運(yùn)送到表達(dá)EGFR的結(jié)腸癌細(xì)胞。通過(guò)這種方式，紫杉醇能夠更集中地作用于癌細(xì)胞，提高治療效率并減少對(duì)正常細(xì)胞的毒性[13]。本研究表明，攜帶EGFR的RNA納米顆粒搭載紫杉醇治療結(jié)腸癌是一種靶向治療策略，這種治療策略旨在提高藥物的靶向性，減輕不良反應(yīng)，從而改善患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。

綜上，攜帶EGFR適配體的RNA納米顆粒具備靶向遞送紫杉醇的特點(diǎn)，顯著抑制了紫杉醇對(duì)于結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)其凋亡能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，有望為未來(lái)的腫瘤治療提供一種新的策略。作為一種針對(duì)結(jié)腸腫瘤細(xì)胞的靶向藥物遞送系統(tǒng)，未來(lái)還需進(jìn)一步將其應(yīng)用于體內(nèi)，以探究其在靶向治療方面的實(shí)際應(yīng)用能力。

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