摘 要：對(duì)異養(yǎng)小球藻進(jìn)行常壓室溫等離子體（Atmospheric and Room Temperature Plasma，ARTP）誘變確定最佳誘變條件，在最佳誘變條件下篩選突變株，并開(kāi)展突變株的搖瓶培養(yǎng)再驗(yàn)證試驗(yàn)、遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)、50 L發(fā)酵罐試驗(yàn)。結(jié)果表明，異養(yǎng)小球藻的最佳致死時(shí)間為50 s；得到6株突變株，且其細(xì)胞數(shù)多于出發(fā)菌株、質(zhì)量濃度明顯高于出發(fā)菌株；突變性能可以穩(wěn)定遺傳，突變株可提前24 h到達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)，發(fā)酵液中油脂產(chǎn)量高于出發(fā)菌株。

關(guān)鍵詞：異養(yǎng)小球藻；常壓室溫等離子體；誘變育種

Abstract： The mutation of Heterotrophic Chlorella using atmospheric and room temperature plasma method was performed to determine the optimal mutagenesis conditions， the mutant strains were screened under the optimal mutagenesis conditions， and the mutant strains were re-verified by shaking flask culture test， genetic stability test and 50 L fermenter test. The results showed that the optimal lethal time of Heterotrophic chlorella was 50 s. Six mutant strains were obtained， and their cell number and mass concentration were significantly higher than that of the original strain. The mutant strain could reach the end of fermentation 24 h in advance， and the oil yield in fermentation liquor was higher than that of the original strain.

Keywords： Heterotrophic chlorella; atmospheric and room temperature plasma; mutation breeding

能源問(wèn)題與環(huán)境問(wèn)題是當(dāng)今世界面臨的重大難題。對(duì)化石燃料的過(guò)度依賴引發(fā)的能源與環(huán)境問(wèn)題，最終需要通過(guò)開(kāi)發(fā)與利用可再生能源來(lái)緩解，因此有學(xué)者開(kāi)展了利用藻類生物質(zhì)生產(chǎn)生物柴油的研究[1]。生物柴油作為化石能源的替代燃料，具有燃燒性好、穩(wěn)定性高、可再生等特點(diǎn)，已成為目前國(guó)際上發(fā)展最快、應(yīng)用前景最廣的可再生綠色能源[2]。常壓室溫等離子體（Atmospheric and Room Temperature Plasma，ARTP）誘變技術(shù)是一種高效、溫和的誘變育種技術(shù)，在細(xì)菌、真菌等微生物菌種改良和提升生物合成能力等研究中得到了廣泛應(yīng)用[3-7]。

近年來(lái)，關(guān)于異養(yǎng)小球藻誘變育種的研究較多，研究方向有提高油脂含量、增加次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量等[2，8-9]。理想的生物柴油原料應(yīng)兼具高產(chǎn)油量和高生長(zhǎng)率特性[10]。而目前異養(yǎng)小球藻的培養(yǎng)存在發(fā)酵周期長(zhǎng)的難題，嚴(yán)重影響了發(fā)酵效率。本文從提高異養(yǎng)小球藻生長(zhǎng)速率的角度出發(fā)，對(duì)異養(yǎng)小球藻進(jìn)行ARTP誘變，以篩選出生長(zhǎng)周期短、遺傳性能穩(wěn)定的優(yōu)異突變株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酵母粉，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、葡萄糖、硫酸鎂和甘氨酸，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g，磷酸氫二鉀0.5 g，磷酸二氫鉀0.4 g，硫酸鎂0.2 g，甘氨酸0.1 g，酵母粉2.0 g，水1 L，自然pH值。121 ℃、30 min滅菌處理。

菌種為異養(yǎng)小球藻，來(lái)源于菌種室。

1.2 儀器與設(shè)備

ME204/02電子天平，梅特勒-托利多；SHP-80（D）電熱恒溫干燥箱，上海森信試驗(yàn)儀器有限公司；ZHWY-211C恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；LDZX-150KBS立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；ARTP-II型ARTP生物育種儀，北京思清源生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 誘變條件的選擇確定

將合適濃度的成熟異養(yǎng)小球藻種子液均勻涂布于載片上，在高純He載氣保護(hù)下，保持2 mm射距，將制備完備的載片分別照射一定時(shí)間，誘變處理的載片于1 mL生理鹽水中振蕩均勻、等梯度稀釋后均勻涂布于固體培養(yǎng)基平板上。待單菌落生長(zhǎng)成熟后，統(tǒng)計(jì)不同誘變時(shí)間下所得單菌落數(shù)量，計(jì)算致死率，致死率突躍對(duì)應(yīng)的誘變時(shí)間即為最佳誘變條件。

1.3.2 最佳誘變條件下突變株的篩選

在最佳誘變條件下對(duì)成熟異養(yǎng)小球藻進(jìn)行ARTP誘變處理得到單菌落，將單菌落與出發(fā)菌株同步接種于種子培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)。其中，1號(hào)為出發(fā)菌株，2～40號(hào)為誘變所得菌株。培養(yǎng)期間定期檢測(cè)種子液的吸光度（Optical Density，OD）并計(jì)算OD值變化量，將其中正向變化量超過(guò)20%的突變株定義為正突變株，負(fù)向變化量超過(guò)20%的突變株定義為負(fù)突變株。

1.3.3 突變株的搖瓶培養(yǎng)再驗(yàn)證試驗(yàn)

對(duì)篩選得到的優(yōu)異突變株和出發(fā)菌株同期進(jìn)行搖瓶種子培養(yǎng)，培養(yǎng)期間每24 h檢測(cè)一次OD值及質(zhì)量濃度變化情況。

1.3.4 突變株的遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證

為驗(yàn)證突變株的遺傳穩(wěn)定性，對(duì)6株突變株分別連續(xù)傳代3次和5次后，繼續(xù)進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，并在培養(yǎng)期間定期檢測(cè)培養(yǎng)液細(xì)胞數(shù)和質(zhì)量濃度。

1.3.5 突變株的50 L發(fā)酵罐試驗(yàn)

為考察突變株對(duì)不同培養(yǎng)規(guī)模的適應(yīng)性，選取33號(hào)突變株進(jìn)行50 L發(fā)酵罐試驗(yàn)，與出發(fā)菌株生長(zhǎng)情況進(jìn)行比較。對(duì)50 L發(fā)酵罐試驗(yàn)所得發(fā)酵液進(jìn)行體積統(tǒng)計(jì)及質(zhì)量濃度、油脂得率檢測(cè)，并據(jù)此核算發(fā)酵液的油脂產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變條件的選擇確定

從圖1可以看出，等離子體對(duì)菌體的致死趨勢(shì)并不是線性的，而是隨著激發(fā)能量的積累呈現(xiàn)指數(shù)增長(zhǎng)，有明顯的突躍過(guò)程。突躍條件即為最佳的誘變條件，異養(yǎng)小球藻的最佳致死時(shí)間為50 s。

2.2 最佳誘變條件下突變株的篩選

最佳誘變條件下成熟異養(yǎng)小球藻的正、負(fù)突變結(jié)果如表1所示，其OD值變化如圖2所示。由圖2可知，10號(hào)、12號(hào)、13號(hào)、26號(hào)、33號(hào)和35號(hào)最終的OD值大于出發(fā)菌株，10號(hào)、12號(hào)、26號(hào)、33號(hào)和35號(hào)突變株比出發(fā)菌株早12 h達(dá)到或超過(guò)出發(fā)菌株的培養(yǎng)終點(diǎn)OD值。

2.3 突變株的搖瓶培養(yǎng)再驗(yàn)證試驗(yàn)

從表2和表3可以看出，各突變株搖瓶培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)明顯多于出發(fā)菌株，特別是在培養(yǎng)72～96 h，突變株細(xì)胞數(shù)的增加速率明顯快于出發(fā)菌株，其在96 h的細(xì)胞數(shù)已明顯多于出發(fā)菌株培養(yǎng)120 h的細(xì)胞數(shù)；質(zhì)量濃度變化趨勢(shì)與細(xì)胞數(shù)變化趨勢(shì)一致。

2.4 突變株的遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證

從表4可以看出，傳代3次和傳代5次的搖瓶培養(yǎng)結(jié)果比較穩(wěn)定，并未出現(xiàn)因?yàn)閭鞔螖?shù)增加導(dǎo)致突變株生長(zhǎng)性能下降的趨勢(shì)，由此說(shuō)明ARTP誘變產(chǎn)生的突變可穩(wěn)定遺傳。

2.5 突變株的50 L發(fā)酵罐試驗(yàn)

2.5.1 突變株與出發(fā)菌株生長(zhǎng)情況

從圖3可以看出，突變株搖瓶種子培養(yǎng)成熟接入發(fā)酵罐后初始的細(xì)胞數(shù)多于出發(fā)菌株，其在對(duì)數(shù)期的生長(zhǎng)速率也快于出發(fā)菌株，提前24 h達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)，發(fā)酵周期縮短。

2.5.2 突變株與出發(fā)菌株油脂產(chǎn)量

從表5可以看出，突變株發(fā)酵液質(zhì)量濃度、油脂得率均高于出發(fā)菌株，油脂產(chǎn)量明顯高于出發(fā)菌株，表明異養(yǎng)小球藻突變株具有優(yōu)良、穩(wěn)定的突變特性。

3 結(jié)論

本文通過(guò)ARTP誘變異養(yǎng)小球藻，經(jīng)篩分選育后獲得突變株，縮短了生長(zhǎng)周期，提高了發(fā)酵效率和油脂產(chǎn)量。由于研究?jī)?nèi)容和時(shí)間的限制，未對(duì)突變株的細(xì)胞活性成分進(jìn)行進(jìn)一步探究，以尋找突變株發(fā)酵效率提高的原因。另外，本文在試驗(yàn)規(guī)模的研究中僅探索了突變株的搖瓶培養(yǎng)和50 L發(fā)酵罐培養(yǎng)，對(duì)于規(guī)?；凸I(yè)化培養(yǎng)而言，后續(xù)還需進(jìn)行更為深入的研究。

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作者簡(jiǎn)介：王方方（1983—），女，山東菏澤人，碩士，工程師。研究方向：生物化工。