關(guān)鍵詞：巴西橡膠樹(shù)；次生乳管分化；維管形成層；原生質(zhì)體；組蛋白乙?；?；CUTamp;Tag

中圖分類號(hào)：S576；S59 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

2019年4月29日，美國(guó)西雅圖HENIKOFF博士在《Nature Communications》上首次發(fā)布Cleavage Under Targets and Tagmentation（CUTamp;Tag）技術(shù)[1]。CUTamp;Tag 技術(shù)是利用超高活性的新型pG-Tn5 轉(zhuǎn)座酶，在特異抗體引導(dǎo)下精準(zhǔn)靶向切割目的蛋白附近的DNA 序列。在進(jìn)行CUTamp;Tag 實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先進(jìn)行靶蛋白特異性抗體（一抗）孵育，使抗體進(jìn)入細(xì)胞與靶蛋白結(jié)合，為了放大信號(hào)，同理接著進(jìn)行二抗孵育，最后孵育pAG-Tn5 轉(zhuǎn)座體，使得轉(zhuǎn)座體進(jìn)入細(xì)胞并與抗體結(jié)合，這樣就把轉(zhuǎn)座體間接地固定在靶蛋白上，隨后加入Mg2+，激活Tn5 酶的切割活性，切斷靶蛋白結(jié)合的DNA 區(qū)域。由于Tn5 連有測(cè)序接頭，在打斷的同時(shí)直接在片段化的DNA 上加接頭，然后提取DNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增構(gòu)建文庫(kù)。在傳統(tǒng)的染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP-Seq）試驗(yàn)中，使用超聲波隨機(jī)打斷染色質(zhì)，經(jīng)過(guò)抗體免疫沉淀DNA，通常得到DNA 長(zhǎng)度均一性差。然而，在CUTamp;Tag 中，轉(zhuǎn)座子只在接近蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的附近切割染色質(zhì)，從而使DNA 序列長(zhǎng)度縮短[2]。因此即使較低的測(cè)序深度（3～5 M reads）也能得到高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。與傳統(tǒng)的ChIP-Seq 相比，CUTamp;Tag 技術(shù)具有細(xì)胞投入量低、信噪比高、可重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì)，尤其適用于早期胚胎發(fā)育、干細(xì)胞、腫瘤以及表觀遺傳學(xué)等研究領(lǐng)域[1-3]。目前，CUTamp;Tag 在組蛋白修飾方面的研究己經(jīng)在動(dòng)物細(xì)胞和植物中都有成功應(yīng)用[3-4]，甚至利用CUTamp;Tag 進(jìn)行組蛋白修飾的研究己經(jīng)發(fā)展到了單細(xì)胞水平[1， 3， 5]。然而，植物細(xì)胞存在細(xì)胞壁、大液泡和復(fù)雜的次生代謝產(chǎn)物，對(duì)抗體和pG-Tn5 轉(zhuǎn)座酶進(jìn)入到植物細(xì)胞內(nèi)有阻礙作用，CUTamp;Tag 技術(shù)應(yīng)用于植物蛋白質(zhì)修飾的研究較成熟，而針對(duì)植物的轉(zhuǎn)錄因子與染色質(zhì)結(jié)合研究的CUTamp;Tag 試驗(yàn)仍然是個(gè)挑戰(zhàn)，試驗(yàn)成功案例還很少[6]。

天然橡膠與石油、煤炭、鋼鐵并稱四大工業(yè)原料，是國(guó)防和經(jīng)濟(jì)建設(shè)的重要戰(zhàn)略物資。世界所需的天然橡膠，98%以上是來(lái)自巴西橡膠樹(shù)（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）[7]。橡膠樹(shù)樹(shù)干樹(shù)皮中的次生乳管是天然橡膠合成和貯存的場(chǎng)所，由維管形成層紡錘狀原始細(xì)胞分化而來(lái)[8-9]。割膠生產(chǎn)上，通過(guò)切斷樹(shù)皮中的乳管，收集從乳管排出的膠乳，加工成天然橡膠。維管形成層細(xì)胞分化次生乳管后，會(huì)不斷向樹(shù)皮外側(cè)推移，乳管細(xì)胞要經(jīng)過(guò)發(fā)生-幼嫩-成熟-衰老-死亡的過(guò)程。為維持橡膠樹(shù)樹(shù)皮產(chǎn)膠部位的乳管數(shù)量，需要維管形成層不斷分化出新的次生乳管進(jìn)行補(bǔ)充。而這些次生乳管的數(shù)量與天然橡膠產(chǎn)量直接相關(guān)，次生乳管數(shù)量取決于維管形成層分化成次生乳管的頻率，即次生乳管分化能力，這是橡膠樹(shù)產(chǎn)量育種的主要指標(biāo)[7]。前期研究中，我們團(tuán)隊(duì)最早發(fā)現(xiàn)外施茉莉酸（jasmonic， JA）及其前體亞麻酸（LA）能誘導(dǎo)維管形成層細(xì)胞分化成次生乳管[9-11]。后續(xù)我們又發(fā)現(xiàn)使用活性形式的茉莉酸（JA-Ile）結(jié)構(gòu)類似物冠菌素（coronatine， COR）[12]，在誘導(dǎo)橡膠樹(shù)次生乳管分化的效應(yīng)方面比茉莉酸甲酯（MeJA）更好[13]，并建立了一種穩(wěn)定的COR 誘導(dǎo)橡膠樹(shù)萌條次生乳管分化的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)[14-19]。最近，我們發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙?；福℉DACs）的抑制劑曲古抑菌素A（trichostatin A， TSA）也能夠高效誘導(dǎo)橡膠樹(shù)次生乳管分化[16]。使用COR 處理，能顯著提高維管形成層區(qū)的組蛋白乙?；潭?，而且HDA 活性和含量也受到影響?；谶@些研究基礎(chǔ)，以及組蛋白乙?；揎椬鳛榛蜣D(zhuǎn)錄調(diào)控的重要方式，推測(cè)JA 誘導(dǎo)橡膠樹(shù)次生乳管分化，可能是通過(guò)組蛋白乙?；揎椪{(diào)控橡膠樹(shù)次生乳管分化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄而實(shí)現(xiàn)。

本研究利用COR誘導(dǎo)橡膠樹(shù)萌條次生乳管分化的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，通過(guò)分離COR 誘導(dǎo)橡膠樹(shù)次生乳管分化的樹(shù)皮樣品，使用酶解法分離形成層區(qū)細(xì)胞的原生質(zhì)體。采用CUTamp;Tag 技術(shù)，通過(guò)組蛋白H3 乙?；贵w引導(dǎo)下精準(zhǔn)靶向切割組蛋白乙?；揎梾^(qū)域附近的DNA 序列，進(jìn)行CUTamp;Tag 試驗(yàn)，構(gòu)建cDNA 文庫(kù)并質(zhì)檢和測(cè)序。研究結(jié)果為使用CUTamp;Tag 技術(shù)構(gòu)建植物組織cDNA文庫(kù)提供操作方法，為解析組蛋白乙?；揎椪{(diào)控橡膠樹(shù)乳管分化的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為巴西橡膠樹(shù)無(wú)性系熱研7-33-97的1 年生萌條，種植在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所的五隊(duì)增殖苗圃，這些萌條每年都經(jīng)過(guò)鋸桿，并通過(guò)基部的潛伏芽重新生長(zhǎng)新的萌條，并在1 年內(nèi)生長(zhǎng)5～6 個(gè)伸長(zhǎng)單位（extension unit，EU）[9， 13]。

1.2 方法

1.2.1 冠菌素（COR）處理橡膠樹(shù)萌條 選取一年生橡膠樹(shù)萌條的第2 伸長(zhǎng)單位（EU2），節(jié)間長(zhǎng)且健壯的樹(shù)干作為實(shí)驗(yàn)材料，在EU2 樹(shù)干中部，使用單面刀片刮去面積為2 cm× 4 cm 的莖表皮及部分皮層，用面積略大的滅菌無(wú)塵紙包裹處理部位，施加含有20 μmol/L COR 溶液，然后用塑料封口膜纏繞并密封包裹。處理時(shí)間為1 d。然后拆去塑料封口膜和無(wú)塵紙，剝?nèi)√幚聿课坏臉?shù)皮（不帶部分木質(zhì)部），并立即置于冰水中，帶回實(shí)驗(yàn)室。COR處理橡膠樹(shù)萌條，取3 組生物學(xué)重復(fù)，每組生物學(xué)重復(fù)取自5 株橡膠樹(shù)萌條樹(shù)皮進(jìn)行混合。選取與COR 處理相同狀態(tài)的橡膠樹(shù)萌條，不做任何處理。在COR 處理剝?nèi)?shù)皮樣品的同時(shí)，剝?nèi)∥刺幚淼拿葪l樹(shù)皮（不帶部分木質(zhì)部），即為對(duì)照處理（CK）膠樹(shù)萌條。對(duì)CK 的樹(shù)皮樣品，同樣取3 組生物學(xué)重復(fù)，每組生物學(xué)重復(fù)取自5株橡膠樹(shù)萌條樹(shù)皮進(jìn)行混合。

1.2.2 橡膠樹(shù)萌條樹(shù)皮形成層細(xì)胞的原生質(zhì)體制備 將取回的COR 和對(duì)照處理橡膠樹(shù)萌條的樹(shù)皮樣品，立即置于一次性塑料培養(yǎng)皿內(nèi)，分割成約0.5 cm×2cm的小塊，并立即置于冰水中，充分洗滌，洗掉膠乳和細(xì)小的雜質(zhì)。再通過(guò)酶解法從新鮮樹(shù)皮中制備原生質(zhì)體，參考擬南芥和楊樹(shù)[20-21]的實(shí)驗(yàn)方案加以改進(jìn)，分離橡膠樹(shù)萌條樹(shù)皮形成層區(qū)域的原生質(zhì)體。針對(duì)橡膠樹(shù)樹(shù)皮中存在大量膠乳，相應(yīng)地增加洗滌步驟和樹(shù)皮材料酶解時(shí)間。將得到的原生質(zhì)體懸浮液添加到含有0.01 mg/mL雙醋酸熒光素（fluorescein diacrtate， FDA）和2.5 μg/mL 碘化錠（propidium iodide， PI）緩沖液中，使用FDA 和PI 雙重染色法測(cè)定原生質(zhì)質(zhì)體活力，并使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.3 CUTamp;Tag 實(shí)驗(yàn) 使用南京諾唯贊公司的Hyperactive Universal CUTamp;Tag Assay Kit for Illumina試劑盒進(jìn)行cDNA 文庫(kù)構(gòu)建，針對(duì)本研究的植物細(xì)胞原生質(zhì)體，對(duì)實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行優(yōu)化，詳情如下：

（1）緩沖液（Buffer）配制。①Binding Buffer：取30 μL 10×Binding Buffer，加無(wú)酶水至300 μL，混勻。②Wash Buffer：取150 μL 10×Wash Buffer，加入30 μL 50×蛋白酶抑制劑，加入1320 μL 無(wú)酶水，混勻。③50×蛋白酶抑制劑：取1 片蛋白酶抑制劑混合片劑（Roche， EDTA-free Protease InhibitorCocktai， 11873580001）溶于1 mL 無(wú)酶水中，–20 ℃保存。④Antibody Buffer：取50 μLAntibody Buffer（-），加入0.5 μL 5% Digitonin，混勻后置于冰上預(yù)冷。⑤Dig-wash Buffer：取792 μL步驟②中配制的Wash Buffer，加入8 μL 5%Digitonin，混勻。⑥D(zhuǎn)ig-300 Buffer：取100 μL10×Dig-300 Buffer，加2 μL 5% Digitonin 和20 μL50×蛋白酶抑制劑，加入878 μL 無(wú)酶水，混勻。⑦試劑盒中的Buffer WA 和Buffer WB，在首次使用時(shí)，加入試劑盒說(shuō)明書要求的無(wú)水乙醇。

（2）ConA Beads 處理。取1 支200 μL 的8連管，每個(gè)樣本加入100 μL Binding Buffer。使用移液槍吹打充分重懸ConA Beads，取出10 μLConA Beads 加到Binding Buffer 中，混合均勻，置于磁力架上，待溶液澄清后（約2 min），用移液槍吸棄上清。將8 連管從磁力架上取下，加入100 μL Binding Buffer，用移液槍輕輕吹打混勻（請(qǐng)勿振蕩混勻）。將8 連管置于磁力架上，待液體澄清后（約2 min），用移液槍吸盡上清。再加入10 μL Binding Buffer 重懸ConA Beads。

（3）細(xì)胞原生質(zhì)體收集。在細(xì)胞原生質(zhì)體通透之前的所有步驟都在室溫下進(jìn)行，使細(xì)胞受到的應(yīng)力最小化。操作過(guò)程中，避免劇烈的渦旋振蕩，造成細(xì)胞原生質(zhì)體破裂。在室溫條件下收集原生質(zhì)體，并用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。重懸原生質(zhì)體，取所需數(shù)量的原生質(zhì)體（約150 000個(gè)）于1.5 mL EP 管中，室溫下2500 r/min（600×g）低速離心5 min，用移液槍吸盡上清。在室溫條件下，加入500 μL Wash Buffer 重懸細(xì)胞，2500 r/min（600×g）低速離心5 min，用移液槍吸盡上清。在每個(gè)樣本中，加入100 μL Wash Buffer 重懸原生質(zhì)體。

（4）一抗孵育。在每個(gè)樣本中，加入50 μL預(yù)冷的Antibody Buffer 重懸細(xì)胞（細(xì)胞核）-磁珠復(fù)合物。使用Merck 公司的組蛋白H3 乙?；揎椏贵w（ Anti-acetyl-Histone H3 Antibody，06-599）作為一抗，進(jìn)行COR 誘導(dǎo)橡膠樹(shù)萌條次生乳管分化形成層區(qū)樣品和對(duì)照的CUTamp;Tag 文庫(kù)構(gòu)建。CUTamp;Tag 文庫(kù)需要設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照， 其中陽(yáng)性對(duì)照使用細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的H3K27me3 抗體，陰性對(duì)照使用結(jié)合能力強(qiáng)的IgG抗體。參照抗體說(shuō)明書推薦的免疫濃度，按照1∶50 的濃度，將抗體加入8 連管中，上下顛倒混勻。瞬時(shí)離心，收集液體于管底（切忌因離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致磁珠聚集在管底），將8 連管置于冰箱4 ℃，靜置孵育過(guò)夜。

（ 5 ） 二抗孵育。二抗為羊抗兔CI ， 用Dig-wash Buffer 按照一定的比例，預(yù)先稀釋好二抗（常規(guī)推薦使用1∶100 比例稀釋，二抗?jié)舛葹?∶50），每個(gè)樣本的二抗工作液用量為50 μL。從冰箱取出孵育過(guò)夜的8 連管，瞬時(shí)離心收集反應(yīng)液，將8 連管置于磁力架上，待溶液澄清后（2 min），用移液槍吸棄上清。加入稀釋好的二抗工作液，上下顛倒數(shù)次，使抗體與細(xì)胞（細(xì)胞核）-磁珠復(fù)合物混合均勻，室溫下旋轉(zhuǎn)孵育1 h，由于溶液較少，旋轉(zhuǎn)孵育期間每15 min 取下八連管，輕彈混勻1 次。二抗孵育完成后，將8 連管置于磁力架上，待溶液澄清后（2 min），用移液槍吸盡上清。向8 連管中加入200 μL Dig-washBuffer，上下顛倒數(shù)次，確保Buffer 與細(xì)胞（細(xì)胞核） - 磁珠復(fù)合物充分混合。重復(fù)上述的Dig-wash Buffer 洗滌步驟2 次。

（ 6 ） pA/G-Tnp 轉(zhuǎn)座子孵育。取2 μLpA/G-Tnp 加入98 μL Dig-300 Buffer 混合，預(yù)先稀釋好pA/G-Tnp，使其終濃度為0.04 μmol/L，每個(gè)樣本pA/G-Tnp 轉(zhuǎn)座子工作液用量為100 μL。取Dig-wash Buffer 洗滌的8 連管，瞬時(shí)離心，將8 連管置于磁力架上，待溶液澄清后（2 min），用移液槍吸盡上清。每個(gè)樣本加入100 μL 稀釋的pA/G-Tnp 轉(zhuǎn)座子工作液，上下顛倒數(shù)次，使轉(zhuǎn)座子與細(xì)胞（細(xì)胞核）-磁珠復(fù)合物混合均勻。室溫下旋轉(zhuǎn)孵育1 h，由于溶液較少，旋轉(zhuǎn)孵育期間每10 min 取下8 連管，輕彈混勻1 次。pA/G-Tnp 轉(zhuǎn)座子孵育完成后，瞬時(shí)離心，將8 連管置于磁力架上，待液體澄清后（30～120 s），用移液槍吸盡上清。向8 連管中加入200 μL Dig-300 Buffer，上下顛倒數(shù)次，確保Buffer 與原生質(zhì)體-磁珠復(fù)合物充分混合均勻。重復(fù)上述的Dig-wash Buffer 洗滌步驟3 次。

（7）DNA 片段化。取40 μL Dig-300 Buffer，加入10 μL 5×TTBL，混合均勻，預(yù)先稀釋TTBL，每個(gè)樣本TTBL 工作液用量為50 μL。取下pA/G-Tnp 轉(zhuǎn)座子孵育的8 連管，瞬時(shí)離心，將8連管置于磁力架上，待液體澄清后（2 min），用移液槍吸盡上清。向每個(gè)樣本中加入50 μL 稀釋的TTBL 工作液，混合均勻。將8 連管置于PCR儀中，37 ℃孵育1 h（可不設(shè)置熱蓋，使PCR 儀保持開(kāi)蓋狀態(tài)進(jìn)行PCR 反應(yīng)，期間每20 min 取下8 連管，輕彈混勻1 次）。

（8）DNA 提取。向37 ℃孵育完成的每個(gè)DNA 片段化樣本中，加入5 μL Proteinase K、100 μL Buffer L/B 和20 μL DNA Extract Beads，充分渦旋混勻。將8 連管置于PCR 儀中，55 ℃孵育10 min，其間顛倒混勻2～3 次。瞬時(shí)離心，將8 連管置于磁力架上，靜置約2～3 min，小心移除上清（切勿吸走磁珠，用10 μL 槍頭盡量將上清吸除干凈）。將上述樣本取下磁力架，每個(gè)樣本中加入200 μL Buffer WA（使用前要加入無(wú)水乙醇），充分渦旋混勻。瞬時(shí)離心收集反應(yīng)液，將8 連管置于磁力架上，靜置2 min，用移液槍吸盡上清。重復(fù)上述的Buffer WB 洗滌步驟2 次。開(kāi)蓋室溫晾置約10 min，直至管內(nèi)無(wú)液體殘留，磁珠表面無(wú)反光（為保證DNA 純度，Buffer WB 要充分晾干揮發(fā)乙醇，但不宜過(guò)度干燥而導(dǎo)致磁珠龜裂）。將上述樣本取下磁力架，加入22 μL 滅菌超純水，用移液槍吹打混勻，室溫洗脫5 min，其間輕輕振蕩2～3 次。將8 連管置于磁力架上，待溶液澄清后（約1 min），吸取20 μL 上清至新的8 連管中，得到提取的DNA 樣本。該DNA 樣本即為CUTamp;Tag 文庫(kù)模版，可置于–20 ℃長(zhǎng)期保存，避免反復(fù)凍融。

（9）文庫(kù)PCR 擴(kuò)增。在PCR 管中配制文庫(kù)PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)體系：純化后的片段化DNA15 μL，2×CAM 25 μL，N5XX 5 μL，N7XX 5 μL，總體積50 μL，使用移液槍輕輕吹打混勻。在PCR儀中，進(jìn)行如下反應(yīng)：72 ℃鏈置換反應(yīng)3 min；95 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸7 s，共12 個(gè)循環(huán)；72 ℃ DNA 合成1 min；4 ℃終止反應(yīng)。

（10）PCR 產(chǎn)物純化。使用磁珠法對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化，將VAHTS DNA Clean Beads（Vazyme# N411）回溫并渦旋振蕩混勻，緩慢吸取100 μL加到文庫(kù)的PCR 反應(yīng)產(chǎn)物中，使用移液槍輕輕吹打10 次，保證整個(gè)體系均勻，室溫孵育5 min。將反應(yīng)管瞬時(shí)離心并置于磁力架上分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心用移液槍吸盡上清，注意不要擾動(dòng)到磁珠。保持PCR 管始終在磁力架上，加入400 μL 新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 s，用移液槍吸盡上清。重復(fù)乙醇漂洗步驟2 次。保持PCR 管始終處于磁力架上，開(kāi)蓋空氣干燥5 min。磁珠晾干后，將PCR管從磁力架上取出，加入22 μL 滅菌超純水洗脫，使用移液槍輕輕吹打10 次充分混勻磁珠，室溫孵育5 min。將PCR 管瞬時(shí)離心，置于磁力架上分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心吸取20 μL 上清轉(zhuǎn)移到新的EP 管中，該純化的PCR 產(chǎn)物樣本即為CUTamp;Tag 文庫(kù)，置于–20 ℃長(zhǎng)期保存，避免反復(fù)凍融。

（11）文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)和長(zhǎng)度分布檢測(cè)。對(duì)構(gòu)建好的CUTamp;Tag 文庫(kù)，通過(guò)濃度檢測(cè)和長(zhǎng)度分布檢測(cè)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。使用Agilent FragmentAnalyzer 5400 全自動(dòng)毛細(xì)管電泳系統(tǒng)進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)量和長(zhǎng)度分布檢測(cè)。

1.2.4 CUTamp;Tag 文庫(kù)測(cè)序和分析 使用Illminanovaseq 6000 對(duì)構(gòu)建的CUTamp;Tag 文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。首先對(duì)Illmina 測(cè)序獲得的CUTamp;Tag 文庫(kù)原始數(shù)據(jù)，采用剪切方式截去測(cè)序數(shù)據(jù)的測(cè)序接頭和低質(zhì)量片段，去除低質(zhì)量的數(shù)據(jù)和保證clean reads的質(zhì)量，具體步驟如下：①刪掉質(zhì)量值小于15 的堿基超過(guò)該reads 堿基數(shù)的40%的reads；②截去堿基為N 的超過(guò)6 個(gè)的reads，③去除帶接頭的reads；④舍棄修剪后短于50 bp 的reads。得到的clean reads 將通過(guò)以下的生物信息學(xué)軟件進(jìn)行分析，分別使用BWA 軟件進(jìn)行Mapping 分析，使用DeepTools 軟件進(jìn)行樣本間相關(guān)性分析，使用MACS2 軟件進(jìn)行peak calling 分析，使用HomerfindMotifsGenome.pl 進(jìn)行motif 識(shí)別，使用Goseq、TopGO 和Bioconductor（2.13）軟件進(jìn)行GO 富集分析，使用KOBAS 軟件進(jìn)行KEGG 富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 COR 誘導(dǎo)橡膠樹(shù)萌條次生乳管分化和樹(shù)皮形成層細(xì)胞的原生質(zhì)體分離

使用COR 誘導(dǎo)橡膠樹(shù)萌條次生乳管分化實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，自然狀態(tài)下橡膠樹(shù)EU2樹(shù)皮的橫切面見(jiàn)圖1A。在20 μmol/L COR誘導(dǎo)處理7 d 的橡膠樹(shù)樹(shù)皮中可觀察COR誘導(dǎo)產(chǎn)生的次生乳管（圖1B）。采集COR 誘導(dǎo)處理1 d 的橡膠樹(shù)萌條樹(shù)皮樣品，使用酶解法分離橡膠樹(shù)萌條樹(shù)皮形成層細(xì)胞的原生質(zhì)體。使用徒手切片的方法對(duì)酶解前后的樹(shù)皮進(jìn)行橫切，可以通過(guò)光學(xué)顯微鏡快速地觀察到樹(shù)皮的結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶解前的橡膠樹(shù)樹(shù)皮從外到內(nèi)分別為表皮、皮層、初生韌皮纖維、初生韌皮部、次生韌皮部和形成層區(qū)，各部分組織都很完整，且形成層區(qū)約有7～11 層形成層細(xì)胞（黑色三角所示），無(wú)其他雜質(zhì)（圖1C）；而酶解后的橡膠樹(shù)樹(shù)皮，表皮、皮層、初生韌皮纖維、初生韌皮部和次生韌皮部等組織都很完整，而形成層區(qū)細(xì)胞已經(jīng)完全酶解（空心三角所示）（圖1D）。對(duì)酶解法獲得的樹(shù)皮形成層區(qū)細(xì)胞原生質(zhì)體（圖1E）進(jìn)行FDA-PI 染色和熒光顯微鏡鏡檢，發(fā)現(xiàn)在原生質(zhì)體懸濁液中，被PI 染色呈紅色的死細(xì)胞和雜質(zhì)較少（圖1F），而被FDA 染色發(fā)綠色熒光的具有活性的原生質(zhì)體數(shù)量較多（圖1G）；再使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法對(duì)具有活性的原生質(zhì)體進(jìn)行計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)COR 處理得到具有活性原生質(zhì)體數(shù)量約為3750 個(gè)/μL，總數(shù)約為3.75×10⁵ 個(gè)，CK樣品中具有活性原生質(zhì)體數(shù)量約為3850個(gè)/μL，總數(shù)約為3.85×10⁵ 個(gè)?？梢?jiàn)使用酶解法獲得橡膠樹(shù)樹(shù)皮形成層區(qū)的有活性的原生質(zhì)體，質(zhì)量較好、數(shù)量較多，能滿足后續(xù)CUTamp;Tag 文庫(kù)構(gòu)建的要求。

2.2 CUTamp;Tag文庫(kù)構(gòu)建和質(zhì)量檢測(cè)

對(duì)酶解法獲得的原生質(zhì)體進(jìn)行重懸，按照原生質(zhì)體的濃度吸取約150 000 個(gè)原生質(zhì)體，分別使用組蛋白H3 乙?；揎椏贵w（COR 處理和CK）、H3K27me3 抗體（陽(yáng)性對(duì)照）和IgG 抗體（陰性對(duì)照），構(gòu)建COR 處理組、CK、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的CUTamp;Tag 文庫(kù)。通過(guò)文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)獲得的各CUTamp;Tag 文庫(kù)的DNA 片段長(zhǎng)度大致在250～1000 bp（圖2A～圖2D），符合CUTamp;Tag 文庫(kù)要求。通過(guò)Illumina 測(cè)序獲得CUTamp;Tag 文庫(kù)的數(shù)據(jù)信息，使用FastQC 軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，數(shù)據(jù)質(zhì)量較好（圖2E～圖2H）。

2.3 CUTamp;Tag 文庫(kù)的數(shù)據(jù)質(zhì)控和參考基因組比對(duì)

通過(guò)對(duì)Illumina 測(cè)序獲得的CUTamp;Tag 文庫(kù)的數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，采用剪切方式截去測(cè)序數(shù)據(jù)的測(cè)序接頭和低質(zhì)量片段，去除低質(zhì)量的數(shù)據(jù)，保證clean reads 的質(zhì)量。修剪之后剩余reads 長(zhǎng)度足夠長(zhǎng)，依然可以用于后續(xù)生物信息學(xué)分析，從而較高效地利用測(cè)序數(shù)據(jù)。

獲得的COR 處理、CK、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照4 個(gè)CUTamp;Tag 文庫(kù)：clean reads 數(shù)量分別為4 782 119、5 926 919、24 499 257 和512 401，除了陰性對(duì)照的數(shù)據(jù)量較少以外，其他3 個(gè)文庫(kù)的clean reads 數(shù)據(jù)量均較好。堿基G 和C 的數(shù)量總和占總的堿基數(shù)量的百分比分別為40.72%、41.17%、37.86%和42.68%，均在正常水平。判斷文庫(kù)質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)， 即Q₂₀ clean 分別為96.13%、96.20%、96.57%和96.39%，Q₃₀ clean分別為89.73%、89.95%、90.56%和90.44%，均屬于同類測(cè)序數(shù)據(jù)的較高水平（表1）。

利用Burrows Wheeler Aligner （BWA）對(duì)4 個(gè)CUTamp;Tag 數(shù)據(jù)與巴西橡膠樹(shù)高產(chǎn)無(wú)性系RY8-79參考基因組[22]的比對(duì)分析。COR 處理、CK、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照4 個(gè)CUTamp;Tag 文庫(kù)的序列比對(duì)上RY8-79 參考基因組的reads 數(shù)量和百分比，分別為4 645 819（97.15%）、5 698 271（96.14%）、23 073 516（94.18%）和340 394（66.43%），除了陰性對(duì)照比對(duì)上數(shù)據(jù)量較少以外，其他3 個(gè)文庫(kù)的比對(duì)上的reads 數(shù)量和百分比均較高。在CUTamp;Tag 的分析中，唯一比對(duì)且非重復(fù)比對(duì)的reads 數(shù)量是關(guān)注的重點(diǎn)，4 個(gè)文庫(kù)數(shù)據(jù)uniquemapped dedup 分別為2 224 053（46.51%）、1 686302（28.45%）、6707253（27.38%）和84 869（16.56%），此項(xiàng)指標(biāo)屬于較好水平（表2）。

2.4 reads 在基因組上的分布統(tǒng)計(jì)

對(duì)4 個(gè)CUTamp;Tag 文庫(kù)的Total mapped reads數(shù)據(jù)比對(duì)到巴西橡膠樹(shù)高產(chǎn)無(wú)性系RY8-79 參考基因組的各個(gè)染色體的密度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。正常情況下，整個(gè)染色體長(zhǎng)度越長(zhǎng)，該染色體內(nèi)部定位的reads 總數(shù)越多。從定位到染色體上的reads 數(shù)與染色體長(zhǎng)度的關(guān)系圖中，可以更加直觀看出染色體長(zhǎng)度和reads 總數(shù)的關(guān)系。如圖3 所示，陰性對(duì)照比對(duì)上基因組各染色體的reads 數(shù)量較少（圖3D），COR 處理、CK 和陽(yáng)性對(duì)照3 個(gè)文庫(kù)數(shù)據(jù)比對(duì)上基因組各染色體的reads 數(shù)量較多，且三者之間的豐富程度相差不大（圖3A～圖3C）?？梢?jiàn)本次構(gòu)建的COR 處理和CK 的CUTamp;Tag 的數(shù)據(jù)質(zhì)量較好。

利用deepTools 軟件的computeMatrix 模塊對(duì)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）上下游3 kb 區(qū)域的CUTamp;Tag信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，是將整個(gè)區(qū)域按照50 bp 的窗口大小劃分成bin，然后計(jì)算每個(gè)bin 中的平均信號(hào)強(qiáng)度，可以獲得每個(gè)樣本的TSS 上游和下游3 kb區(qū)域上的平均信號(hào)分布（圖4A～圖4D），COR 處理、CK 和陽(yáng)性對(duì)照的結(jié)果在TSS 處均有顯著的高峰，而且TSS 上游和下游的曲線很均勻；雖然陰性對(duì)照在TSS 處也有顯著的高峰，但TSS 上游和下游的曲線比較雜亂。同理，利用deepTools軟件的plotProfile 模塊對(duì)gene body 上下游3 kb區(qū)域的CUTamp;Tag 信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得到每個(gè)樣本的gene body 上下游3 kb 區(qū)域上的平均信號(hào)分布（圖4E～圖4H），COR 處理、CK 和陽(yáng)性對(duì)照的結(jié)果在TSS和TES處均有顯著的高峰，TES-TSS連接的曲線很均勻，顯著高于TSS 和TES 之外的區(qū)域；雖然陰性對(duì)照在TSS 和TES 處也有顯著的高峰，但TES-TSS 連接的曲線比較雜亂，也是顯著高于TSS 和TES 之外的區(qū)域曲線。同理，利用deepTools 軟件的computeMatrix 模塊對(duì)peak 峰頂上下游3 kb 區(qū)域的CUTamp;Tag 信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得到每個(gè)樣本CUTamp;Tag 信號(hào)貫穿基因組的TSS 兩側(cè)的分布圖（圖4I～圖4L），橫坐標(biāo)表示reads 相對(duì)于peak summit 的位置信息，縱坐標(biāo)表示每一個(gè)區(qū)域的reads 信號(hào)的聚類結(jié)果，可以看出COR處理、CK 和陽(yáng)性對(duì)照的3 個(gè)文庫(kù)的reads 集中在peak summit 的位置，但漂移出peak summit 的也較多，且上下游的富集reads 信號(hào)較少。從以上結(jié)果可知，引起陰性對(duì)照曲線雜亂的原因可能是陰性對(duì)照的數(shù)據(jù)量少、比對(duì)的結(jié)果少造成的。

2.5 差異基因的GO和KEGG分析

峰最鄰近的TSS 所對(duì)應(yīng)的基因被認(rèn)為是峰相關(guān)基因。使用Goseq 軟件對(duì)各CUTamp;Tag 文庫(kù)的峰相關(guān)基因進(jìn)行GO 富集分析，根據(jù)GO 富集的生物過(guò)程（biological process）、細(xì)胞組分（cellularcomponent）和分子功能（molecular function）3個(gè)類別，對(duì)過(guò)度呈現(xiàn)P 值（over represented Pvalue）最小的30 項(xiàng)中具有峰值項(xiàng)的基因數(shù)量（gene with peak item）最多的幾項(xiàng)進(jìn)行篩選。如圖5A～圖5D 所示：（1）COR 處理的CUTamp;Tag文庫(kù)差異峰對(duì)應(yīng)基因，在GO 富集的3 個(gè)類別中，分別是生物過(guò)程6 項(xiàng)，其中DNA 整合相關(guān)基因220 個(gè)；細(xì)胞組分12 項(xiàng)，其中泛素化連接酶復(fù)合體相關(guān)基因130 個(gè)、泛素化-蛋白轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因128 個(gè)；分子功能12 項(xiàng)，其中泛素化連接酶復(fù)合體相關(guān)基因178 個(gè)、泛素化-蛋白轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因178 個(gè)和ADP 結(jié)合相關(guān)基因166 個(gè)等。（2）CK的CUTamp;Tag 文庫(kù)差異峰對(duì)應(yīng)基因，在GO 富集的3 個(gè)類別中，分別是生物過(guò)程2 項(xiàng)，其中對(duì)生長(zhǎng)素的反應(yīng)相關(guān)基因33個(gè)；細(xì)胞組分12 項(xiàng)，其中泛素化連接酶復(fù)合體相關(guān)基因117 個(gè)和核泛素連接酶復(fù)合物相關(guān)基因115個(gè)；分子功能16 項(xiàng)，其中ADP 結(jié)合相關(guān)基因170 個(gè)、泛素蛋白轉(zhuǎn)移酶活性相關(guān)基因165個(gè)和泛素樣蛋白轉(zhuǎn)移酶活性相關(guān)基因165 個(gè)等。（3）組蛋白H3K27m³ 抗體對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照的CUTamp;Tag 文庫(kù)差異峰對(duì)應(yīng)基因，在GO 富集的3 個(gè)類別中，分別是生物過(guò)程10 項(xiàng)，其中對(duì)蛋白質(zhì)磷酸化相關(guān)基因338 個(gè)和DNA 整合相關(guān)基因144 個(gè)；細(xì)胞組分2 項(xiàng)，其中細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因18 個(gè)；分子功能15 項(xiàng)，其中氧化還原酶活性相關(guān)基因165 個(gè)和鐵離子結(jié)合相關(guān)基因155 個(gè)等。（4）陰性對(duì)照的CUTamp;Tag 文庫(kù)差異峰對(duì)應(yīng)基因，在GO 富集的3 個(gè)類別中，分別是生物過(guò)程14 項(xiàng)，其中光合作用相關(guān)基因13 個(gè)；細(xì)胞組分7 項(xiàng)，其中含蛋白質(zhì)復(fù)合物相關(guān)基因25個(gè)和膜蛋白復(fù)合體相關(guān)基因13 個(gè)；分子功能9項(xiàng)，其中葉綠素結(jié)合相關(guān)基因3 個(gè)和脫氧核糖核酸酶活性相關(guān)基因3 個(gè)等?？梢?jiàn)COR 處理、CK 與陽(yáng)性和陰性對(duì)照文庫(kù)的GO 富集結(jié)果之間存在巨大差異。

使用KOBAS 軟件進(jìn)行峰差異基因KEGG 富集分析，對(duì)P 值和校正后的P 值的最小20 項(xiàng)中，具有輸入的基因數(shù)量（input gene number）較多的幾項(xiàng)進(jìn)行篩選。如圖5E～圖5H 所示，（1）COR處理的CUTamp;Tag 文庫(kù)的差異峰對(duì)應(yīng)的基因校正P 值最低且富集數(shù)量較多的KEGG 通路，依次為植物病原體相互作用（P=0.1288，110 個(gè)基因），類黃酮生物合成（P=0.1631，35 個(gè)基因）、光合作用（P=0.0553，36 個(gè)基因）、氨基糖和核苷酸糖代謝（P=0.6543，71 個(gè)基因）、核糖體（P=0.6543，156 個(gè)基因）等；（2）COR 處理對(duì)照的CUTamp;Tag文庫(kù)的差異峰對(duì)應(yīng)的基因校正P 值最低且富集數(shù)量較多的KEGG 通路，依次為植物病原體相互作用（P=0.0553，107 個(gè)基因），類黃酮生物合成（P=0.1631，36 個(gè)基因）、光合作用（P=0.12，44個(gè)基因）、晝夜節(jié)律-植物（P=0.3826，28 個(gè)基因）、核糖體（P=0.3826，156 個(gè)基因）等；（3）組蛋白H3K27m3 抗體對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照的CUTamp;Tag 文庫(kù)的差異峰對(duì)應(yīng)的基因校正P 值最低且富集數(shù)量較多的KEGG 通路， 依次為類黃酮生物合成（P=7.12E-06，33 個(gè)基因），植物病原體相互作用（P=0.0067，66 個(gè)基因）、次生代謝產(chǎn)物的生物合成（P=0.0067，297 個(gè)基因）、倍半萜和三萜生物合成（P=0.0069，16 個(gè)基因）、光合作用（P=0.0126，29 個(gè)基因）等；（4）陰性對(duì)照的CUTamp;Tag 文庫(kù)的差異峰對(duì)應(yīng)的基因校正P 值最低且富集數(shù)量較多的KEGG 通路，依次為光合作用（P=1.68E-14，15 個(gè)基因），氧化磷酸化（P=2.8E-06，11 個(gè)基因）、萜、哌啶和吡啶生物堿的生物合成（P=0.0219，3個(gè)基因）、RNA 聚合酶（P=0.0459，3 個(gè)基因）、代謝途徑（P=0.1366，31個(gè)基因）等?？梢?jiàn)COR處理、CK 與陽(yáng)性對(duì)和陰性對(duì)照文庫(kù)的KEGG 富集結(jié)果之間也存在較大差異。

3討論

3.1 CUTamp;Tag 技術(shù)為解析橡膠樹(shù)維管形成層分化成次生乳管的分子機(jī)制提供了契機(jī)

橡膠樹(shù)樹(shù)干樹(shù)皮中的次生乳管是天然橡膠合成和貯存的場(chǎng)所，是由維管形成層紡錘狀原始細(xì)胞分化而來(lái)的[7， 9]。形成層細(xì)胞分化次生乳管后，會(huì)不斷向樹(shù)皮外側(cè)推移，乳管細(xì)胞要經(jīng)過(guò)發(fā)生-幼嫩-成熟-衰老-死亡的過(guò)程。按照橡膠樹(shù)樹(shù)皮從里向外依次分布形成層區(qū)（乳管發(fā)生）、水囊皮（幼嫩乳管）、黃皮和砂皮內(nèi)層（成熟乳管）以及砂皮外層和粗皮（衰老和死亡的乳管）[7]。由于天然橡膠生產(chǎn)中的割膠部位主要是形成層和水囊皮以外的組織——黃皮和砂皮內(nèi)層，其中分布有大量的成熟乳管，故稱之為有效產(chǎn)膠部位。只有形成層不斷分化新的次生乳管，才能保障有效產(chǎn)膠部位中成熟乳管的數(shù)量[7]。橡膠樹(shù)樹(shù)干樹(shù)皮中的次生乳管細(xì)胞的命運(yùn)決定發(fā)生在形成層區(qū)。最適合觀察此過(guò)程的時(shí)間為每年的春季新梢生長(zhǎng)期（3—4 月），此時(shí)樹(shù)干的形成層區(qū)開(kāi)始分裂分化活動(dòng)，形成層的細(xì)胞層數(shù)最少（約4 層）[13， 23]，可以在原位跟蹤到形成層分化成次生乳管的過(guò)程。所以研究COR 誘導(dǎo)橡膠樹(shù)維管形成層分化次生乳管的分子機(jī)制，其植物材料僅限于COR 誘導(dǎo)處理的橡膠樹(shù)樹(shù)皮的形成層區(qū)，形成層細(xì)胞且細(xì)胞位于木質(zhì)部和韌皮部之間，難以分離到具有活性且數(shù)量較多的形成層細(xì)胞，也難以獲得足夠量的原生質(zhì)體來(lái)滿足ChIP-Seq 實(shí)驗(yàn)要求，故我們選擇起始量更低且效率更高的CUTamp;Tag 技術(shù)來(lái)研究COR 處理的橡膠樹(shù)樹(shù)皮形成層區(qū)的組蛋白乙?；揎棇?duì)次生乳管分化的調(diào)控。目前，CUTamp;Tag技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于組蛋白修飾/染色質(zhì)結(jié)合蛋白分析、開(kāi)放染色質(zhì)分析、單細(xì)胞組學(xué)、DNA 和蛋白質(zhì)修飾分析、空間生物學(xué)和染色質(zhì)構(gòu)象捕獲（3C）等多種研究方向，并且適用于植物和動(dòng)物的多種模式物種。橡膠樹(shù)維管形成層在分化成次生乳管細(xì)胞的特點(diǎn)，結(jié)合CUTamp;Tag 技術(shù)能夠達(dá)到單細(xì)胞級(jí)別的分析，能夠充分還原形成層細(xì)胞發(fā)生的特異性修飾和基因表達(dá)，為解析橡膠樹(shù)形成層分化次生乳管細(xì)胞的機(jī)制提供了良好的契機(jī)。

3.2 橡膠樹(shù)維管形成層分化次生乳管過(guò)程，可能受到JA 信號(hào)、組蛋白乙?；头核鼗瘏f(xié)同調(diào)控

通過(guò)對(duì)COR 處理橡膠樹(shù)樹(shù)皮CUTamp;Tag 文庫(kù)的峰相關(guān)基因進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，發(fā)現(xiàn)很多生長(zhǎng)素、類黃酮代謝相關(guān)的基因，COR 和對(duì)照處理的文庫(kù)還發(fā)現(xiàn)了大量的蛋白質(zhì)泛素化修飾相關(guān)的基因，如泛素化連接酶復(fù)合體、泛素化-蛋白轉(zhuǎn)移酶。這說(shuō)明COR 誘導(dǎo)橡膠樹(shù)次生乳管分化過(guò)程中，形成層發(fā)生了蛋白質(zhì)乙?；揎?，而且有蛋白質(zhì)泛素化修飾參與其調(diào)控過(guò)程。

蛋白質(zhì)乙?；窃谝阴；D(zhuǎn)移酶的作用下，在蛋白質(zhì)賴氨酸殘基上添加乙酰基的過(guò)程，是細(xì)胞控制基因表達(dá)，蛋白質(zhì)活性或生理過(guò)程的一種機(jī)制。組蛋白乙酰化多發(fā)生在核小體的組蛋白N端堿性氨基酸集中區(qū)的特定賴氨酸殘基上。組蛋白乙?；绞怯山M蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶（HATs）和組蛋白去乙?；福℉DAs）共同決定。在細(xì)胞核內(nèi)，組蛋白乙?；c組蛋白去乙?；^(guò)程處于動(dòng)態(tài)平衡，進(jìn)而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。蛋白質(zhì)泛素化，是蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基位點(diǎn)與泛素分子的羧基端相互結(jié)合的過(guò)程，可改變底物蛋白的穩(wěn)定性、定位、活性和復(fù)合物形成，參與蛋白質(zhì)降解過(guò)程。泛素化調(diào)節(jié)途徑共有3 類酶催化：泛素激活酶（E1）、泛素接合酶（E2）、泛素-蛋白質(zhì)連接酶（E3）。與組蛋白乙?；愃?，組蛋白泛素化也是可逆轉(zhuǎn)的調(diào)控，組蛋白泛素化的動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程由2 個(gè)因素決定：分別是細(xì)胞內(nèi)可以利用的游離泛素，以及組蛋白泛素化或去泛素化酶的活性。同樣是發(fā)生在蛋白質(zhì)賴氨酸殘基位點(diǎn)上的蛋白質(zhì)修飾，2 種修飾方式之間必然存在一些聯(lián)系。目前，關(guān)于乙?；头核鼗叩南嗷プ饔玫难芯窟€很少。最新的研究證明，泛素化和乙?；軌蚬餐{(diào)控植物中蛋白質(zhì)穩(wěn)定性變化[24]。研究發(fā)現(xiàn)依賴于NatA 的NTA 損傷會(huì)導(dǎo)致擬南芥蛋白質(zhì)組的整體不穩(wěn)定，并發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的降解決定子（degron），該degron 標(biāo)記了大多數(shù)非乙?；陌|(zhì)蛋白并可通過(guò)泛素系統(tǒng)降解[24]。在人類疾病研究中，發(fā)現(xiàn)組蛋白泛素化與乙?；瘏f(xié)同作用可以實(shí)現(xiàn)染色質(zhì)酶活性的精細(xì)調(diào)控[25]。甲基轉(zhuǎn)移酶Dot1 的活性可由H4K16（H4K16ac）特異性激活，H4K16ac 直接激活Dot1 的活性，H2B 的泛素化（H2BUb）進(jìn)一步增強(qiáng)了這種效果，從而獲得了Dot1 的最佳催化速率。并通過(guò)冷凍電鏡結(jié)構(gòu)對(duì)比分析和定點(diǎn)突變結(jié)合核小體的酶分析， 證實(shí)了H4K16ac 乙酰化和H2BUb 泛素化對(duì)Dot1 甲基化的變構(gòu)刺激在H3K79 甲基化反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[25]。

而在JA信號(hào)途徑起主導(dǎo)作用的COR 誘導(dǎo)橡膠樹(shù)次生乳管分化過(guò)程中，不僅有組蛋白乙?；揎梾⑴c，也有E3 泛素連接酶參與。經(jīng)典的JA信號(hào)途徑：茉莉酸異亮氨酸（JA-Ile）是植物激素茉莉酸的活性形式，植物對(duì)茉莉酸的應(yīng)答依賴SCFCOI1 復(fù)合物[26-27]，該復(fù)合物具有E3 泛素化連接酶活性[28]。關(guān)鍵的調(diào)控環(huán)節(jié)為COI-JAZ-MYC，其中JAZ 蛋白是茉莉酸信號(hào)途徑的負(fù)調(diào)控因子，通過(guò)抑制MYC 類轉(zhuǎn)錄因子對(duì)下游茉莉酸應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄激活活性，阻斷JA 信號(hào)傳導(dǎo)。當(dāng)JA-Ile與其受體COI1 結(jié)合后，SCFCOI1 復(fù)合物與JAZ 蛋白結(jié)合，使JAZ 蛋白發(fā)生泛素化而被26 s 蛋白酶體降解，從而解除JAZ 對(duì)MYC 轉(zhuǎn)錄因子的抑制作用，啟動(dòng)JA 下游響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄[29-30]。據(jù)報(bào)道，植物轉(zhuǎn)錄共激活因子復(fù)合體Mediator 的一個(gè)亞基MED25，可將COI1 引導(dǎo)至MYC2 靶啟動(dòng)子上，并促進(jìn)JAZ 蛋白通過(guò)泛素化，被26 s 蛋白酶體降解；此外，MED25 可與組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶1（HAC1）相互作用，此互作可選擇性調(diào)節(jié)MYC2靶啟動(dòng)子H3K9 乙?；瑥亩贘A 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用[31-34]。HAC1 在MYC2 靶啟動(dòng)子上的富集與活性依賴于COI1 和MED25。因此，MED25將COI1 與HAC1 依賴的H3K9 乙?；?lián)系起來(lái)，以激活MYC2 對(duì)JA 響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[31-34]。由此可見(jiàn)，組蛋白乙?；揎椇头核鼗揎椩贘A信號(hào)途徑中起很重要的調(diào)控作用。近期，我們發(fā)現(xiàn)HDA 的抑制劑TSA 也能誘導(dǎo)次生乳管分化[16]，且COR 處理顯著提高形成層區(qū)的組蛋白乙酰化程度，且HDA 活性， 尤其是HDA6 的含量和HDA/HAT 基因的表達(dá)均受到JA 的影響（未發(fā)表資料）。據(jù)此，我們推測(cè)橡膠樹(shù)維管形成層分化次生乳管過(guò)程，可能是通過(guò)JA 信號(hào)途徑、組蛋白乙?；揎椇偷鞍踪|(zhì)泛素化修飾來(lái)共同調(diào)控乳管分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄而實(shí)現(xiàn)。