關(guān)鍵詞：香草蘭；β-D-葡萄糖苷酶；香蘭素；發(fā)酵優(yōu)化

中圖分類號：Q815 文獻標志碼：A

香草蘭（Vanilla planifolia Andrews）又名香莢蘭、香子蘭，屬多年生大型肉質(zhì)藤本香料植物，是蘭科植物中最有實用價值的優(yōu)質(zhì)食用香料，享有天然食品香料之王的美譽，單價僅次于藏紅花[1-3]。新鮮成熟的香草蘭豆莢無特殊香氣，其豆莢經(jīng)殺青、發(fā)汗、干燥、陳化等工藝后可產(chǎn)生香蘭素、香草酸、香草醇等，據(jù)報道其芳香成分可達250多種，是各種高端食品飲料及化妝品等優(yōu)質(zhì)原料，廣泛應(yīng)用于調(diào)配各級高檔食品、化妝品等，在國際市場上供不應(yīng)求[4-10]。

香草蘭發(fā)酵后的眾多芳香成分中，最受矚目及最能反映豆莢品質(zhì)的香味物質(zhì)是香蘭素[11]，其由香草蘭豆莢中的β-D-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化香蘭素葡萄糖苷生成[12-14]，因此在發(fā)酵過程中香蘭素葡萄糖苷含量逐漸降低，香蘭素含量逐漸提升。香草蘭鮮豆莢中香蘭素葡萄糖苷含量達10%以上，但加工后豆莢中香蘭素含量僅占1%～3%，香蘭素葡萄糖苷并不能完全轉(zhuǎn)化為香蘭素。浦帆等[15]研究發(fā)現(xiàn)添加β-D-葡萄糖苷酶，酶促生香效果明顯，可提高豆莢中香蘭素含量。莫麗梅[16]在香草蘭青豆莢中添加β-D-葡萄糖苷酶、果膠酶、纖維素酶，處理后香蘭素含量有明顯提升。張彥軍等[17]使用冷凍-聯(lián)合纖維素酶、果膠酶、β-D-葡萄糖苷酶方法處理香草蘭鮮豆莢，顯著提高香蘭素轉(zhuǎn)化率。WALISZEWSKI 等[18] 使用結(jié)晶酶PML-MX、Zymafilt L-300 和Novozym 3 種纖維素分解酶產(chǎn)物對香草蘭豆莢進行預(yù)脫水和酶促預(yù)處理，結(jié)果表明酶促預(yù)處理使香蘭素含量增加1 倍。以上研究均可證明額外添加酶，尤其是β-D-葡萄糖苷酶對提高香蘭素含量起著重要作用，但酶價格昂貴，而微生物已被證明參與香草蘭發(fā)酵過程[19]，且微生物來源獲得高純度β-D-葡萄糖苷酶制劑的制備工藝較為簡單、酶促效果更佳[20]，從香草蘭豆莢中篩選的微生物應(yīng)用到香草蘭發(fā)酵中也更安全可靠。陳永敢[21]使用產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶的芽孢桿菌輔助豆莢發(fā)酵生香，明顯提高了香草蘭豆莢中香蘭素含量。

本研究以產(chǎn)自馬達加斯加香草蘭發(fā)酵豆莢（M）和中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所香草蘭發(fā)酵豆莢（S）為原料，使用七葉苷選擇性培養(yǎng)基，篩選產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶的微生物菌株，選擇酶活較高的2 株菌按照不同比例混合，噴灑到香草蘭豆莢表面，使用HPLC 技術(shù)和GC-MS 技術(shù)測定發(fā)酵豆莢的香蘭素、香蘭素葡萄糖苷含量和揮發(fā)性物質(zhì)，旨在利用微生物輔助香草蘭豆莢發(fā)酵生香，為提升豆莢品質(zhì)提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

供試香草蘭豆莢：產(chǎn)自馬達加斯加的香草蘭商品豆莢（M）和產(chǎn)自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所的香草蘭商品豆莢（S）。

七葉苷麥克林試劑，香蘭素標準品，上海源葉生物科技有限公司；香蘭素葡萄糖苷標準品，阿拉丁試劑公司；C7～C30 烷烴標準樣品，美國Sigma 公司。

初篩培養(yǎng)基：參考高娉娉等[22]的方法，稱取氯化鈉10 g，胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，瓊脂15 g，七葉苷1 g，檸檬酸高鐵氨2.5 g，蒸餾水1000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，備用。LB 培養(yǎng)基：氯化鈉10 g，胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，備用（發(fā)酵條件優(yōu)化用液體培養(yǎng)基不加瓊脂）。發(fā)酵培養(yǎng)基：參考崔萍等[23]的方法，酵母浸膏1.0%（氮源），葡萄糖2.0%（碳源），蛋白胨2.0%（氮源和碳源），NH₄NO₃ 0.3%（氮源）、KH₂PO₄ 0.4%，自然pH，115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，備用。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶菌株篩選 分別將M和S 2 種香草蘭豆莢用無菌剪刀剪短至約0.2 cm長的小段，取剪短后的豆莢5 g 置于45 mL 無菌水中，180 r/min 震蕩1 h，靜置30 min 后，將上清液進行梯度稀釋，選取10^–5、10^–6、10^–7 稀釋液，分別吸取0.2 mL 稀釋液，均勻涂布至初篩培養(yǎng)皿上，每梯度設(shè)置3 次重復(fù)，在28 ℃的培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h。待長出菌落后，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色，挑選可產(chǎn)生明顯黑色水解圈的單菌落，將單菌落在LB 培養(yǎng)皿上劃線。連續(xù)純化5 次后挑取單菌落接種至LB 培養(yǎng)基斜面，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶菌株的分子鑒定 菌株16S rDNA 分子鑒定參考尚方劍等[24]的方法。采用DNA 離心柱型試劑盒提取菌株的DNA，將總DNA 作為模板， 將細菌特異性引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3′）對DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)進行PCR 擴增。將純化后的產(chǎn)物送至上海派森諾生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.2.3 菌株產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶活力測定 酶活測定參考王彩肖等[25]的方法。

1.2.4 樣品的制備 將香草蘭豆莢置于75 ℃水中殺青5 min，用無菌紗布將豆莢表面水分擦凈。將M3、S7 菌株接種至LB 液體培養(yǎng)基中，將含菌液的培養(yǎng)基在28 ℃和180 r/min 的恒溫搖床中震蕩培養(yǎng)48 h。在無菌環(huán)境下將菌液以8000 r/min離心10 min，棄上清液，再加入50 mL 無菌水，充分搖勻后再次離心，重復(fù)2 次以上操作，調(diào)整菌液吸光度約為0.5 后，作噴菌處理，噴菌比例如表1 所示。將菌液均勻噴灑在殺青后的豆莢表面，每組豆莢10 根噴菌液10 mL，將豆莢置于干燥陰涼處分別發(fā)酵20d和60d后取樣。測量分析前，將樣品低溫凍干粉碎并過60 目篩。

1.2.5 香蘭素與香蘭素葡萄糖苷含量分析 參考楊峰等[13]的方法，稱取0.05 g 凍干香草蘭豆莢粉末，加入50 mL 無水乙醇，充分攪拌后進行超聲萃取，設(shè)置超聲功率100 W，50 ℃條件下萃取10 min；萃取后過濾，重復(fù)進行3 次萃取，合并濾液，定容至50 mL 容量瓶，測豆莢中的香蘭素和香蘭素葡萄糖苷含量，取萃取液用0.22 μm 有機濾膜過濾后進行HPLC 分析。分析條件：反相C18 柱（Zorbax，4.6 mm×100 mm，3.5 μm，Agilent）；流速為0.8 mL/min；進樣量為5 μL；柱溫為25 ℃；檢測波長為280 nm；流動相為0.5%醋酸溶液∶乙腈=85∶15 等梯度洗脫。采用香蘭素標準品、香蘭素葡萄糖苷標準品和出峰保留時間定性，外標法確定物質(zhì)含量。

1.2.6 香草蘭揮發(fā)性成分分析 稱取1 g 凍干香草蘭豆莢粉末于20 mL 頂空進樣瓶中，80 ℃振搖SPME 萃取40 min，250 ℃解吸5 min。GC-MS采用DB–WAX（Jamp;W Scientific， Folsom， CA，USA）石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），升溫程序為：柱溫40 ℃保持3 min，以3 ℃/min速率升溫到90 ℃，以2 ℃/min 速率升溫到120 ℃，以3 ℃/min 速率升溫到240 ℃，保持20 min。樣品進樣不分流，電子沖擊能量為70 eV，離子源和四極桿的溫度分別設(shè)定在230 ℃和150 ℃。掃描范圍為40～450 amu。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 26.0 軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析；采用Origin 2019 軟件、MEGA 11.0 軟件和GenBank 中的BLAST 軟件進行數(shù)據(jù)處理和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶菌株的篩選

從發(fā)酵后的香草蘭豆莢中篩選到21 株可在七葉苷篩選培養(yǎng)基上產(chǎn)生黑色水解圈的菌株，各菌株菌落形態(tài)特征存在差異（圖1），黑色水解圈大小不同，其中菌株M3、M7、S2、S3、S4、S7黑色水解圈較大。從產(chǎn)自馬達加斯加香草蘭豆莢上篩選到的菌株M3 在LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后菌落呈圓形，乳白色，表面光滑濕潤，邊緣整齊。從產(chǎn)自香飲所的香草蘭豆莢上篩選到的菌株S7菌落形態(tài)與M3相似。

2.2 產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶菌株的鑒定

經(jīng)16S rRNA 序列測定后，用BLAST 與GenBank 中16S rDNA 序列進行同源性比較。發(fā)現(xiàn)菌株M1、M3、M6、S1、S3、S7 的16S rRNA序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫中的B. paramycoides MCCC1A04098、L. macroides LMG 18474、B. subtilisDSM 10、B. altitudinis 41KF2b、B. rugosus SPB7、B. paramycoides MCCC 1A04098 相似度分別達到99.79%、99.52%、99.52%、99.93%、99.93%、99.86%（表2）。除6 株菌未檢測出外，其余15 株菌NCBI比對分析結(jié)果表明均為芽孢桿菌，其中，M1、M3、M6、S1、S3、S7 分別為副蕈狀芽孢桿菌（ Bacillus paramycoides ）、長形氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus macroides）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、高空芽孢桿菌（B. altitudinis）、膠質(zhì)芽孢桿菌（B. altitudinis）、副蕈狀芽孢桿菌（B.paramycoides）。對菌株M3 及S7 的測序結(jié)果建立系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2 所示，進一步驗證M3 為Lysinibacillus macroides，S7 為B. paramycoides。

2.3 產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶菌株的產(chǎn)酶活性

鑒定出的15株芽孢桿菌產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶能力如圖3 所示， 菌株產(chǎn)酶活性在0.00294～0.01117 U/mL。分離自馬達加斯加香草蘭豆莢上的長形賴氨酸芽孢桿菌M3 酶活性最高，是副蕈狀芽孢桿菌M8 酶活力的3.8 倍。分離自香飲所香草蘭豆莢上的菌株產(chǎn)酶活力在0.00599～0.00736 U/mL，酶活力變化范圍低于分離自馬達加斯加香草蘭豆莢上的產(chǎn)酶菌株，其中菌株副蕈狀芽孢桿菌S7 酶活力高于本組中其他菌株酶活力。

2.4 香蘭素與香蘭素葡萄糖苷含量變化

從圖4可看出，每組處理噴菌60 d 后的香蘭素含量均高于20 d 時的含量。CK 在20、60 d 時的香蘭素含量分別為0.28%和0.92%。只噴M3菌株的處理在20 d 時香蘭素含量為0.49%，60 d高達2.25%，顯著高于其他處理。只噴S7 菌株的處理，在20、60 d 時的香蘭素含量分別為1.39%、1.52%，上升幅度不大。菌株M3、S7 按照1∶1噴菌處理的豆莢20、60 d 時香蘭素含量分別為0.45%、1.29%，60 d 相較于20 d 的香蘭素含量增加了186.7%。M3 與S7 按照2∶1 噴菌處理的豆莢，在20、60 d 時香蘭素含量分別為1.57%、1.66%。M3 與S7 按照1∶2 噴菌處理的豆莢發(fā)酵20、60 d 時香蘭素含量分別為1.60%、1.80%。綜上，香蘭素含量最高的是只噴M3 菌株處理的豆莢。在20、60 d 時所有噴菌處理的豆莢香蘭素含量均高于CK，說明產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶的功能微生物可有效促進香蘭素產(chǎn)生，提升發(fā)酵豆莢品質(zhì)。

圖5 為不同處理香草蘭豆莢分別在噴菌20、60 d 后的香蘭素葡萄糖苷含量。從圖5 中可得出，噴菌后的20～60 d 內(nèi)，豆莢香蘭素葡萄糖苷含量呈下降趨勢。噴無菌水豆莢在20、60 d 時的香蘭素葡萄糖苷含量分別為1.63%、0.61%，60 d 相較于20 d 的香蘭素葡萄糖苷含量下降了62.6%。只噴M3 菌株處理的豆莢發(fā)酵20、60 d 時的香蘭素葡萄糖苷含量分別為3.25%、0.93%，60 d 相較于20 d 的香蘭素葡萄糖苷含量下降了71.4%。只噴S7 菌株處理的豆莢發(fā)酵20、60 d 時的香蘭素葡萄糖苷含量分別為2.83%、0.88%，60 d 相較于20 d的香蘭素葡萄糖苷含量下降了68.9%。M3 與S7按照體積比1∶1 噴灑處理的發(fā)酵豆莢20、60 d時的香蘭素葡萄糖苷含量分別為3.00%、0.58%，60 d 的相較于20 d 的香蘭素葡萄糖苷含量下降了80.7%；M3 與S7 按照體積比2∶1 噴菌處理的豆莢發(fā)酵20、60 d 的香蘭素葡萄糖苷含量分別為3.31%、0.66%，60 d 的相較于20 d 的香蘭素葡萄糖苷含量下降了80.0%；M3 與S7 按照體積比1∶2 噴菌處理的豆莢發(fā)酵20、60 d 時香蘭素葡萄糖苷含量分別為2.38%、0.79%，60 d 的相較于20 d的香蘭素葡萄糖苷含量下降了66.8%。由此可見，香蘭素葡萄糖苷下降最多的是M3 與S7 按照體積比為1∶1噴菌處理的豆莢，而下降最少的是CK，這說明產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶的微生物菌株可顯著促進香蘭素葡萄糖苷水解。

2.5 香草蘭揮發(fā)性成分分析

采用GC-MS 對噴菌處理發(fā)酵20 d 和60 d 時的豆莢進行揮發(fā)性成分分析，噴菌發(fā)酵20 d 時檢測出的揮發(fā)性物質(zhì)共47 種（表3），其中烷烴類11種、醛類12種、酸類6 種、烯烴1 種、醇類7種、酚類6 種、酮類2 種、其他類2種，占比最多的是醛類，占檢測出所有物質(zhì)的28%（圖6A）。噴菌發(fā)酵60 d 時豆莢的揮發(fā)性成分共有50 種（表4），其中烷烴類有8 種、醛類14 種、酸類4 種、烯烴4 種、醇類10種、酚類5 種、酯類1 種、酮類2 種、其他類2 種，占比最多的依舊為醛類，占總物質(zhì)種類數(shù)量的25.4%（圖6B）。發(fā)酵20 d含量最高的物質(zhì)是香蘭素，其中M3 與S7 按照體積比1∶1噴菌的發(fā)酵豆莢香蘭素含量占比最高為80.77%，其次是只噴菌M3 菌株的豆莢，香蘭素含量為78.49%，M3 與S7 按照體積比1∶2和2∶1 噴菌處理的豆莢香蘭素含量占比約為77.00%，CK 香蘭素含量最低。發(fā)酵60d時含量最高的揮發(fā)物質(zhì)也是香蘭素，M3 與S7 按照體積比1∶2噴灑的香蘭素含量最高，只噴S7處理與CK 差異不大，其他3 個噴菌處理香蘭素含量均約為88.00%。豆莢發(fā)酵20 d 時CK 和只噴M3菌株的處理均檢測到對羥基苯甲醛，且含量僅次于香蘭素。對羥基苯甲醛是合成香蘭素的重要前體物質(zhì)，在發(fā)酵60 d 時每個處理均檢測到對羥基苯甲醛，且含量均大于1.00%。豆莢發(fā)酵20 d時單獨噴菌M3、S7 及二者1∶1混合的處理均檢測到2，3-丁二醇。2，3-丁二醇是香草蘭的特征風(fēng)味物質(zhì)，在發(fā)酵60d時不同處理豆莢中均含有2，3-丁二醇，其中噴灑S7 菌株處理的豆莢中含量高達2.57%，高于其他處理的豆莢。

如圖7所示，有18種揮發(fā)物在2個時間均有被檢出，如香蘭素、愈創(chuàng)木酚、乙酸、反-2-癸烯醛、香草乙酮等，且以上物質(zhì)已被證明大量存在于香草蘭豆莢發(fā)酵前期[14]。只噴M3 菌株處理的豆莢60 d 時檢測出3-羥基丁酮，該物質(zhì)是重要食品香料[26]，具有獨特香味，且其可在無其他碳源的情況下作為B. subtilis 的碳源[21]。

3討論

β-D-葡萄糖苷酶是纖維素酶系中一種重要的水解酶，可以催化風(fēng)味前體糖苷配基（烴基或芳基）與糖基之間的糖苷鍵水解，產(chǎn)生芳香物質(zhì)達到增香效果。微生物來源的β-D-葡萄糖苷酶數(shù)量龐大，價格低廉，制備容易且用途廣泛[27]。本研究以香草蘭豆莢為原料，分離出21 株可產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶的菌株，并鑒定出其中15 株菌均為芽孢桿菌。從產(chǎn)自馬達加斯加的香草蘭豆莢中篩選出的菌株中，產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶活力最高的菌株M3 為長形賴氨酸芽孢桿菌（L. macroides）。從產(chǎn)自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所的香草蘭豆莢中篩選出的菌株中，酶活力最高的菌株S7為副蕈狀芽胞桿菌（B. paramycoides）。鮑捷等[28]篩選到1 株產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶的植物乳植桿菌c4-3，并使用該菌株用于豆?jié){的發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)添加該菌株后能夠有效提升豆?jié){的營養(yǎng)。王玲[29]篩選優(yōu)化了產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶的菌，并將其運用到葡萄酒發(fā)酵中，使葡萄酒的香氣物質(zhì)種類和含量相較于未添加的葡萄酒有顯著差異，具有開發(fā)為釀酒增香酶制劑的潛力。

本研究發(fā)現(xiàn)只噴菌M3 菌株的香草蘭豆莢香蘭素含量最高，產(chǎn)生的揮發(fā)性成分最多，且只噴M3 菌株的豆莢在發(fā)酵60 d 時產(chǎn)生了3-羥基丁酮。李林海等[30]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)條件影響微生物產(chǎn)生3-羥基丁酮，且微生物發(fā)酵是生產(chǎn)3-羥基丁酮的主要方法之一。因此，優(yōu)化微生物培養(yǎng)條件可提升菌株產(chǎn)3-羥基丁酮的能力，增加香草蘭發(fā)酵豆莢香氣。M3 與S7 按照體積比1∶1 噴灑處理的香蘭素葡萄糖苷下降最多為80.7%，說明復(fù)合菌液可有效轉(zhuǎn)化香蘭素葡萄糖苷。傅航等[31]對黃芪渣進行單一菌、2 菌劑復(fù)合、3 菌劑復(fù)合發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)3 菌劑復(fù)合按照1∶1∶1 比例的效果最佳。夏欣欣等[32]使用釀酒酵母和芽孢桿菌經(jīng)混菌固態(tài)發(fā)酵米糠后，谷維素含量和抗氧化活性均顯著提高。焦奕豪等[33]使用酵母菌和枯草芽孢桿菌混合固態(tài)發(fā)酵沙棘果渣，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)固態(tài)發(fā)酵沙棘果渣可改善其營養(yǎng)價值。本研究結(jié)果為僅噴M3菌株在香蘭素含量、整體揮發(fā)性含量等方面效果最佳，M3 與S7 按照體積比1∶1 噴灑處理的香蘭素葡萄糖苷下降最多，后續(xù)研究可以增加噴菌比例，找出可以提高香草蘭品質(zhì)的最佳組合。

從香草蘭豆莢中提取的香蘭素由于其純天然、安全性高、品質(zhì)優(yōu)等被廣泛應(yīng)用于調(diào)配高端食品和化妝品中，但天然香蘭素遠遠不能滿足市場需求[34]，采用微生物輔助發(fā)酵提升香蘭素產(chǎn)量是獲得高品質(zhì)香草蘭豆莢，彌補天然香蘭素產(chǎn)量難以滿足市場需求的重要措施之一。通過測定香蘭素含量、香蘭素葡萄糖苷含量、揮發(fā)成分等方式確定最佳噴菌方式組合，為后續(xù)開發(fā)微生物輔助豆莢發(fā)酵生香，提升品質(zhì)提供可靠的菌株資源儲備和技術(shù)參考。未來擬研究不同發(fā)酵時期、不同噴灑量等對豆莢香氣成分及豆莢表面微生物區(qū)系的影響，揭示其提升豆莢品質(zhì)的微生態(tài)機制，研發(fā)微生物輔助發(fā)酵生香關(guān)鍵技術(shù)，為獲得高品質(zhì)香草蘭豆莢，開發(fā)高附加值產(chǎn)品提供理論與技術(shù)支撐。