關(guān)鍵詞：MeYippee1；表達(dá)模式；酵母雙雜交

中圖分類號(hào)：S533 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

木薯是世界上最重要的主食作物之一，尤其在全球范圍內(nèi)的貧困地區(qū)，木薯淀粉是人們獲取熱量的主要來(lái)源[1]。解析木薯淀粉合成和產(chǎn)量形成的分子機(jī)理對(duì)木薯高產(chǎn)、高淀粉育種具有重要意義。淀粉主要由葡萄糖分子通過(guò)糖基轉(zhuǎn)移酶的作用聚合而成，主要在葉綠體和淀粉體內(nèi)合成，涉及ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）、淀粉合成酶（SS）、淀粉分支酶（SBE）、去支鏈酶（DBE）等[2]。植物激素在調(diào)節(jié)淀粉合成中扮演著重要角色，盡管它們并不直接參與淀粉的生物合成途徑。植物激素，如生長(zhǎng)素（auxin）、赤霉素（gibberellins）、細(xì)胞分裂素（cytokinins）和脫落酸（abscisic acid）等通過(guò)影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育和淀粉合成途徑來(lái)間接調(diào)控淀粉的合成。脫落酸（ABA）和吲哚-3-乙酸（IAA）與玉米胚乳發(fā)育早期和中期淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)顯著相關(guān)[3]。ABA 誘導(dǎo)了荷花轉(zhuǎn)錄因子基因NnABI4 表達(dá)上調(diào)，而NnABI4 可結(jié)合淀粉合成酶基因NnSS1 的啟動(dòng)子促進(jìn)其表達(dá)，從而增強(qiáng)荷花根莖中的淀粉積累[4]。IAA、GA₃（赤霉素）和ZR（玉米素）作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑，能夠刺激木薯營(yíng)養(yǎng)器官的生長(zhǎng)，進(jìn)而增加光合產(chǎn)物的生成；而ABA 作為生長(zhǎng)抑制劑，可以減緩營(yíng)養(yǎng)器官的發(fā)育，限制塊根的縱向生長(zhǎng)，同時(shí)促進(jìn)塊根的橫向擴(kuò)張和體積增大[5]。植物激素調(diào)控木薯塊根形成和淀粉積累的機(jī)理有待進(jìn)一步解析。

SAUR（small auxin up RNA）是一類與生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的基因家族。在植物中，SAUR基因家族編碼的蛋白質(zhì)通常參與調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素的響應(yīng)，在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)、發(fā)育和適應(yīng)環(huán)境變化中起著重要作用。實(shí)驗(yàn)室前期研究證明， 木薯MeSAUR1 結(jié)合AGPase 的小亞基編碼基因MeAGPS1a 的啟動(dòng)子正調(diào)控該基因的表達(dá)，表明MeSAUR1 間接參與了木薯淀粉的合成。酵母雙雜交試驗(yàn)篩選出1 個(gè)Yippee 蛋白成員MeYippee1是MeSAUR1 的候選互作蛋白。Yippee 蛋白是一種高度保守的鋅指結(jié)合蛋白，其同源基因廣泛存在于真菌、植物、動(dòng)物等多種真核生物中。鋅指蛋白在生物體中扮演著多種重要角色，尤其是在基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育等生命過(guò)程中，能夠與DNA、RNA、蛋白質(zhì)或其他小分子特異性結(jié)合，從而參與轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上的基因表達(dá)調(diào)控。Yippee 蛋白在植物中的生物學(xué)功能解析較少。過(guò)表達(dá)水稻OsYIPL1 基因可以提升水稻的萌發(fā)率[6]。另外，Yippee 蛋白基因家族還能調(diào)控植物細(xì)胞的增殖分化，有研究表明其家族成員與MAPK 信號(hào)通路相互作用，從而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)；Yippee 蛋白可能還與免疫反應(yīng)有關(guān)，有研究證明它可以調(diào)節(jié)植物抵抗病原體的侵染[7]。上述研究進(jìn)展為解析Yippee 基因在植物生理過(guò)程中的作用提供了寶貴的信息。

木薯MeYippee1 基因的具體功能尚不清楚。本研究克隆MeYippee1 的編碼區(qū)，開(kāi)展序列分析及基因在不同組織中的表達(dá)模式研究，通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)驗(yàn)證MeYippee1 與MeSAUR1 之間的相互作用，研究結(jié)果為進(jìn)一步研究MeYippee1 在木薯淀粉積累過(guò)程中的功能提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

華南8 號(hào)（SC8）木薯采自國(guó)家木薯種質(zhì)資源圃；RNA 提取試劑盒購(gòu)自北京聚合美生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自莫納生物科技有限公司；qRT-PCR 酶購(gòu)自諾瓦生物公司；克隆基因聚合酶購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega Bio-Tek 公司；缺陷培養(yǎng)基（SD）購(gòu)自北京酷來(lái)搏科技有限公司；大腸桿菌DH5α、酵母菌AH109 購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司；酵母雙雜交載體質(zhì)粒pGBKT7-p53、pGADT7-T、pGBKT7-lam、pGBKT7、pGADT7 由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 MeYippee1 基因的克隆參照 RNA 提取試劑盒Plant Total RNA Isolation Kit Plus 的說(shuō)明書提取RNA。并用MonScript^TM RTIII All-in-OneMix with dsDNase 試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)提供的MeYippee1 的CDS 序列信息，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)MeYippee1 的上、下游引物，并命名為MeYippee1-BD-F/R（表1），在北京擎科生物科技股份有限公司合成。以cDNA 為模板，MeYippee1-BD-F/R 為引物擴(kuò)增MeYippee1。反應(yīng)體系（50 μL）：2×PCRSolution Prime STAR HS （Premix） 25 μL ，MeYippee1-BD-F 1 μL；MeYippee1-BD-R 1 μL，ddH2O 22 μL，cDNA 模板1 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃5 min；98 ℃ 10 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。16 ℃保存產(chǎn)物。

1.2.2 MeYippee1 的生物信息學(xué)分析通 過(guò)GSDS（https：//gsds.gao-lab.org/）在線軟件預(yù)測(cè)木薯MeYippee1 基因的結(jié)構(gòu)； 通過(guò)ProParam（https：//web.expasy.org/protparam/）在線軟件預(yù)測(cè)木薯MeYippee1 的理化性質(zhì)；通過(guò)TMHMM（TMHMM 2.0-DTU Health Tech-BioinformaticServices）在線軟件預(yù)測(cè)MeYippee1 蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域；通過(guò)SignalP-6.0（SignalP 6.0-DTU HealthTech-Bioinformatic Services ） 在線軟件預(yù)測(cè)MeYippee1 蛋白質(zhì)的信號(hào)肽區(qū)域；通過(guò)NetPhos（NetNGlyc 1.0-DTU Health Tech-BioinformaticServices）在線軟件預(yù)測(cè)該蛋白的磷酸化位點(diǎn)；通過(guò)Wolf PSORT[WoLF PSORT： Protein SubcellularLocalization Prediction （hgc.jp）] 在線網(wǎng)站對(duì)MeYippee1 蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)；使用MEGA7.1 軟件的Neighbor-Joining 法構(gòu)建MeYippee1 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3 MeYippee1 的表達(dá)模式分析 設(shè)計(jì)MeYippee1基因的qPCR 引物并命名為MeYippee1-real-F/R（表1），以木薯Tublin 基因作為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)其qPCR 引物并命名為Tublin-F/R（表1），進(jìn)行熒光定量分析。反應(yīng)體系（10 μL）：MonAmpTMChemoHS qPCR Mix 5 μL ， MeYippee1-real-F0.2 μL ， MeYippee1-real-R 0.2 μL ； 的ddH2O2.6 μL，模板2 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min；95 ℃10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，41 個(gè)循環(huán)。

1.2.4 MeYippee1 蛋白的毒性和自激活檢測(cè) 將pGBKT7 和pGBKT7-MeYippee1 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至AH109 酵母，并在色氨酸缺陷型培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察酵母的生長(zhǎng)情況，檢測(cè)MeYippee1 蛋白是否對(duì)酵母生長(zhǎng)有影響。將pGADT7 和pGBKT7- MeYippee1共同轉(zhuǎn)化到AH109 酵母，在色氨酸、亮氨酸缺陷型培養(yǎng)基（SD/T），色氨酸、亮氨酸、組氨酸、腺嘌呤缺陷型培養(yǎng)基（SD/TLHA）和含有X-α-Gal的色氨酸、亮氨酸、組氨酸、腺嘌呤缺陷型培養(yǎng)基（SD/TLHA+X-α-Gal）上分別培養(yǎng)，觀察酵母的生長(zhǎng)情況，檢測(cè)MeYippee1 蛋白是否自激活。

1.2.5 MeYippee1 與MeSAUR1 酵母雙雜交點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證 將pGBKT7-MeYippee1 和pGADT7-MeSAUR1共轉(zhuǎn)化至AH109 酵母，篩選出陽(yáng)性克隆。將陽(yáng)性菌株及對(duì)照菌株點(diǎn)種在不同培養(yǎng)基上，檢查生長(zhǎng)情況和顏色變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 26軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用鄧肯法進(jìn)行單因素多樣本差異顯著性方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MeYippee1 基因的克隆與生物信息學(xué)分析

2.1.1 MeYippee1 基因的克隆 本研究以SC8 木薯品種的cDNA 為模板，設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行RT-PCR，獲得目的條帶（圖1）?；驕y(cè)序發(fā)現(xiàn)，MeYippee1 基因的CDS 區(qū)長(zhǎng)度為321 bp，編碼106個(gè)氨基酸。與phytozome（http：//phytozome-next.jgi.doe.gov/ ） 數(shù)據(jù)庫(kù)中AM560 木薯品種的MeYippee1 基因序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，有1 個(gè)堿基有差別，SC8 木薯的MeYippee1 基因第256 個(gè)堿基為“C”，而AM560木薯的MeYippee1 基因在該位置的堿基為“T”（圖2）。核苷酸的差異導(dǎo)致了氨基酸序列的改變，SC8 木薯MeYippee1 蛋白的第86 個(gè)氨基酸為“P”，而AM560 木薯MeYippee1蛋白在該位置的氨基酸則為“S”（圖3）。

2.1.2 MeYippee1 基因的生物信息學(xué)分析 通過(guò)ProParam 在線預(yù)測(cè)木薯MeYippee1 蛋白分子式為C548H851N155O154S6，分子質(zhì)量（Mw）約為12.27 kDa，理論等電點(diǎn)（pI）為8.69，不穩(wěn)定系數(shù)為14.55，為穩(wěn)定蛋白，總平均親水系數(shù)為–0.377，表明該蛋白屬于親水蛋白。該蛋白含有20 種氨基酸殘基，其中Ala（A）含量與Lys（K）最高，均占8.50%，Pro（P）的含量最低，占0.90%（表2）。

MeYippee1 蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)結(jié)果表明MeYippee1 蛋白沒(méi)有跨膜區(qū)域。通過(guò)SignalP-6.0軟件預(yù)測(cè)MeYippee1 蛋白質(zhì)的信號(hào)肽區(qū)域發(fā)現(xiàn)，MeYippee1 蛋白質(zhì)無(wú)Sec/SPI 信號(hào)肽，不屬于分泌蛋白和跨膜蛋白，符合TMHMM 軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果。通過(guò)NetPhos 軟件預(yù)測(cè)該蛋白的磷酸化位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)MeYippee1 蛋白可能含有4 個(gè)磷酸化位點(diǎn)。MeYippee1 蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白最有可能定位于細(xì)胞質(zhì)中，其次是在線粒體中。

2.1.3 MeYippee1 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 將MeYippee1序列選取與相似程度比較高的19 種其他物種的Yippee 序列[ 紫樹(shù)（ Nyssa sinensis，KAA8533573.1）、巴西橡膠（Hevea brasiliensis，XP_021661656.1 ） 、云南金錢槭（ Dipteroniadyeriana，KAK2658520.1 ） 、文冠果（ Xanthocerassorbifolium，KAH7543806.1）、茶樹(shù)（Camelliasinensis、XP_028081361.1）、狹葉羽扇豆（Lupinusangustifolius， XP_019415243.1）、木豆（Cajanuscajan， XP_020226898.1）、白羽扇豆（Lupinus albus，KAF1893681.1）、決明（Senna tora， KAF7830747. 1）、薯蕷（Diospyros lotus， XP_052183539.1）、酸棗（Ziziphus jujuba var. Spinosa， XP_015886610.1）、蓮藕（Nelumbo nucifera、XP_010267494.1）、東方銀耳（Trema orientale， PON81226.1）、栓皮櫟（ Quercus suber 、XP_023912069.1） 、麻瘋樹(shù)（Jatropha curcas， XP_012084536.1）、白花羊蹄甲（Bauhinia variegata， KAI4338001.1）、牧豆樹(shù)（Prosopis cineraria， XP_054799767.1）、大葉櫟（ Quercus lobata， XP_030934691.1） 、土瓶草（ Cephalotus follicularis， GAV82826.1 ） ] 構(gòu)建MeYippee1 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示，與MeYippee1親緣關(guān)系最近的是巴西橡膠樹(shù)（圖4）。

2.2 MeYippee1 的表達(dá)模式分析

采用qRT-PCR 技術(shù)分析MeYippee1 在SC8木薯的嫩葉、成熟葉、葉柄、塊根、須根、腋芽、頂芽、莖等8 個(gè)不同組織部位的表達(dá)模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MeYippee1 在腋芽的表達(dá)量最高，其次為須根、塊根和成熟葉，在莖和葉柄的表達(dá)量較低，在頂芽和嫩葉表達(dá)量最低（圖5A）。利用本實(shí)驗(yàn)室前期獲得SC8 木薯形成期塊根（種植后80 d）、膨大期塊根（種植后130 d 和180 d）和成熟期塊根（種植后230 d 和280 d）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析木薯SC8 塊根不同發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)MeYippee1 主要在塊根形成期表達(dá)，且與其他時(shí)期的表達(dá)差異顯著（圖5B）。

2.3 MeYippee1 蛋白的毒性和自激活檢測(cè)

2.3.1 MeYippee1 蛋白毒性檢測(cè) 在酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)前，需確保外源蛋白不抑制酵母生長(zhǎng)。將BD-MeYippee1 與BD 載體分別轉(zhuǎn)化至AH109 酵母，通過(guò)比較生長(zhǎng)情況來(lái)評(píng)估目標(biāo)酵母生長(zhǎng)是否受抑制。結(jié)果顯示，2種酵母菌斑生長(zhǎng)相似（圖6），表明MeYippee1 蛋白無(wú)細(xì)胞毒性，適合進(jìn)行后續(xù)的蛋白互作研究。

2.3.2 自激活檢驗(yàn) 將BD-MeYippee1 與AD 載體共同轉(zhuǎn)入AH109 酵母菌株進(jìn)行自激活檢驗(yàn)。共轉(zhuǎn)化BD-MeYippee1 和AD 載體的酵母菌、陽(yáng)性對(duì)照（AD-Large T+BD-p53）和陰性對(duì)照（ADLargeT+BD-laminc）的酵母菌在SD/TL 的培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)。只有陽(yáng)性對(duì)照在SD/TLHA 和SD/TLHA+X- α -Gal 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)， 且其菌斑在SD/TLHA+X-α-Gal 培養(yǎng)基上呈現(xiàn)藍(lán)色（圖7），表明MeYippee1 蛋白不具備自激活特性。

2.4 MeYippee1 與MeSAUR1 酵母雙雜交點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證

本研究采用酵母雙雜交技術(shù)來(lái)探究MeSAUR1 與MeYippee1 之間的相互作用。將含有AD-MeSAUR1 和BD-MeYippee1 的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入酵母菌中，并在不同的選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。在SD/TL、SD/TLHA 以及SD/TLHA+X-α-Gal 培養(yǎng)基上， 轉(zhuǎn)基因酵母菌均能正常生長(zhǎng)， 而在SD/TLHA+X- α-Gal 培養(yǎng)基上，酵母菌落呈現(xiàn)藍(lán)色（藍(lán)色是β-半乳糖苷酶活性的指示），表明在SD/TLHA 培養(yǎng)基中，MeSAUR1 與MeYippee1 之間發(fā)生了相互作用（圖8）。

3 討論

木薯淀粉的合成涉及多種酶，包括ADPG 焦磷酸化酶、顆粒結(jié)合淀粉合酶、淀粉合酶、淀粉分支酶（SBE）、脫支酶[8-12]等，這些酶在淀粉生物合成過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。研究人員已通過(guò)轉(zhuǎn)基因、基因編輯等方式驗(yàn)證了MeGBSSI、MeSBE2.1、MeSBE2.2 等基因參與淀粉合成[13]。IHEMERE 等[14]通過(guò)在木薯中表達(dá)改良的細(xì)菌glgC 基因，成功地增加了AGPase 活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因木薯的淀粉產(chǎn)量顯著增加。還有報(bào)道指出通過(guò)RNA 干擾技術(shù)降低木薯中2 個(gè)淀粉分支酶基因（BE1 和BE2）的表達(dá)，成功培育出了含有高比例直鏈淀粉的木薯品種[15]。然而，木薯淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控研究較少，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有待解析，Yippee 基因家族成員已被證實(shí)參與調(diào)控細(xì)胞分裂和器官發(fā)育[16]，但是尚未有該基因家族參與淀粉合成相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)ADPG 焦磷酸化酶小亞基基因MeAGPS1a 受MeSAUR1 正調(diào)控，本研究通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明MeSAUR1 與MeYippee1 存在互作關(guān)系。

生長(zhǎng)素參與植物庫(kù)器官的發(fā)育及淀粉的合成調(diào)控。生長(zhǎng)素在水稻淀粉合成中起正調(diào)控作用，水稻籽粒發(fā)育過(guò)程中生長(zhǎng)素和淀粉濃度同時(shí)增加。施用IAA 可增加籽粒的淀粉含量，降低水稻生長(zhǎng)素響應(yīng)因子基因OsARF18 表達(dá)，導(dǎo)致生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)改變，影響水稻生長(zhǎng)、發(fā)育及淀粉合成[17]。豌豆的生長(zhǎng)素生物合成基因PsTAR2 突變體的IAA 含量顯著降低，這一結(jié)果導(dǎo)致AGPase 大亞基的編碼基因PsAGPL1 表達(dá)量顯著降低，使得AGPase 活性降低3 倍，突變體的豌豆種子變小，淀粉含量顯著減少[18]。木薯塊根發(fā)育的研究發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)素信號(hào)的增強(qiáng)與淀粉儲(chǔ)存代謝的激活密切相關(guān)。在木薯塊根形成期，須根發(fā)育膨大形成塊根[19]，塊根內(nèi)源生長(zhǎng)素IAA 含量顯著提高[5]。在木薯塊根形成的過(guò)程中，生長(zhǎng)素相關(guān)基因（ARF、SAUR、AUX1 等）的表達(dá)水平提高，促進(jìn)塊根的次生生長(zhǎng)和淀粉合成。本研究發(fā)現(xiàn)MeYippee1 基因主要在木薯塊根形成期表達(dá)，因此推測(cè)MeYippee1和生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)蛋白MeSAUR1 互作，協(xié)同響應(yīng)生長(zhǎng)素對(duì)木薯塊根發(fā)育和淀粉積累的調(diào)控。后續(xù)研究中，將進(jìn)一步分析MeSAUR1 和MeYippee1 互作對(duì)MeAGPS1a 表達(dá)的影響，通過(guò)轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證MeYippee1 在木薯塊根形成和淀粉積累過(guò)程中的功能。