關(guān)鍵詞：火龍果；莖腐病；病原菌；假可可毛色二孢菌；拮抗細(xì)菌

中圖分類號：S436.67; S476 文獻標(biāo)志碼：A

火龍果屬仙人掌科（Cactaceae）量天尺屬（Hylocereus）植物，是熱帶、亞熱帶水果，原產(chǎn)于危地馬拉、古巴等國。我國臺灣最先引進栽培火龍果，大陸約于1999年從臺灣引進栽培[1]?；瘕埞麩崃康汀⒖诟泻?，深受人們的喜愛，果實中含有鉀、鎂、鈣、磷、鐵和鋅等多種礦物質(zhì)，維生素豐富，維生素C含量最高，其次是維生素E、泛酸和維生素K1[2]。近年來，我國火龍果產(chǎn)業(yè)飛速發(fā)展，于2021年成為全球火龍果生產(chǎn)第一大國，廣西是全國最大的火龍果種植區(qū)，南寧市火龍果種植面積近1.26 萬hm²，年產(chǎn)量43萬t[3-4]。但是隨著種植面積的增加，其病害問題也暴露出來，火龍果病害嚴(yán)重影響產(chǎn)量和果農(nóng)經(jīng)濟。植物病害是造成農(nóng)業(yè)作物損失的主要因素之一，真菌是植物的主要病原體[5]。國內(nèi)外已報道過多種真菌可引起火龍果病害，包括由新暗色柱節(jié)孢菌（Neoscytalidium dimidiatum）引起的火龍果潰瘍病，其癥狀表現(xiàn)為莖蔓出現(xiàn)橙色和不規(guī)則的紅色斑點，中心隆起灰褐色病變，紅色斑點逐漸變成灰色，病斑不斷擴大，最終導(dǎo)致莖蔓腐爛[6]；由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）引起的枯萎病，其田間癥狀表現(xiàn)為莖蔓組織變褐色、軟化，嚴(yán)重時崩解潰爛，僅剩主要維管束組織[7]；仙人掌平臍蠕孢（Bipolaris cactivora）引起的黑斑病，該病原菌可為害火龍果莖蔓及果實，其癥狀表現(xiàn)為果皮表面出現(xiàn)褪色斑點，病斑擴大后長出霉?fàn)钗颷8]。炭疽菌（Colletotrichum sp.）可引起火龍果炭疽病，感染炭疽病的火龍果莖蔓初期出現(xiàn)紅褐色不規(guī)則病斑，中期病斑不斷變大，并且相連變成黃褐色，后期病斑部位產(chǎn)生黑點[9]。

在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中對抗病害的傳統(tǒng)方法有農(nóng)業(yè)防治和化學(xué)防治，農(nóng)業(yè)防治包括培育作物抗病品種，開展衛(wèi)生防疫防止土壤或種子受污染[10]。目前對于火龍果病害的防治手段主要為化學(xué)農(nóng)藥防治，如使用吡唑醚菌酯、戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑、咪鮮胺、丙環(huán)唑等化學(xué)農(nóng)藥[11]?；瘜W(xué)農(nóng)藥的使用常常面臨藥物耐受性和環(huán)境污染的挑戰(zhàn)。近年來，基于環(huán)境友好性和高效性，生物防治越來越受到大家的關(guān)注。生物防治與化學(xué)農(nóng)藥相比，對環(huán)境的影響較小，有助于保護生態(tài)平衡，且可以減少農(nóng)產(chǎn)品的化學(xué)殘留，提高食品安全性[12]。因此，生物防治火龍果莖腐病是最理想的防治方法。

本研究以廣西火龍果種植基地采集患莖腐病的火龍果莖蔓及從健康火龍果根、莖分離出的內(nèi)生細(xì)菌為材料，采用組織分離法、致病性測定、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定主要病原菌，采用平板對峙法篩選出抑菌效果良好的拮抗菌株，為火龍果病害的診斷和防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 于2021年9月在廣西南寧市隆安縣金穗火龍果基地隨機采集多份病害樣本。

1.1.2 菌株 拮抗菌株為本實驗前期從健康火龍果根、莖分離的內(nèi)生細(xì)菌。其他植物病害菌株：葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、假禾谷鐮刀菌（F. pseudograminearum）、尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）來自廣西民族大學(xué)菌種庫。

1.1.3 主要試劑 2×Bes Taq MasterMix（WithDyel）購自北京百奧萊博科技有限公司；引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司；LB 培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基均按照常規(guī)配方配制。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離及純化 采用組織分離法分離病原菌[13]。用滅菌刀片切取病健交界處4 mm×4 mm 組織塊，用75%乙醇浸泡30s，無菌水漂洗，再用0.1%氯化汞消毒2 min，無菌水漂洗3 次，將組織塊置于無菌吸水紙吸去多余水分，移放至PDA 培養(yǎng)基中，置于28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2～3d，待菌絲生長后挑取菌群邊緣菌絲接種至新的PDA 培養(yǎng)基上進行純化，經(jīng)過3 次純化培養(yǎng)后，采用斜面低溫保藏法保存，備用。

1.2.2 病原菌致病性驗證 采用柯赫氏法則對病原菌進行致病性測定。將純化保存的菌株在PDA培養(yǎng)基上于28 ℃活化3d。取健康的火龍果莖蔓，用75%乙醇將火龍果莖蔓表面消毒，再用無菌水沖洗3 次，用無菌脫脂棉球吸去多余水分。用無菌針刺傷火龍果莖蔓表皮，共刺傷3 處，每處間隔2～3cm，用無菌打孔器取下活化后的菌餅（d=5 mm），將菌餅置于被刺傷的表皮，用無菌脫脂棉球加無菌水覆蓋刺傷部位保濕，套上保鮮袋，于27 ℃室溫培養(yǎng)。以無菌PDA 瓊脂塊為對照組，其他處理方法相同，重復(fù)3次。記錄發(fā)病情況，再次挑取莖蔓發(fā)病處病原菌進行純化培養(yǎng)，與原接種菌株進行形態(tài)比較。

1.2.3 病原菌形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定 對分離的病原菌進行形態(tài)學(xué)鑒定[14]。純化后的病原菌轉(zhuǎn)接至PDA 培養(yǎng)基，于28 ℃恒溫箱暗培養(yǎng)，記錄菌落形態(tài)及顏色變化。用光學(xué)顯微鏡觀察病原菌的菌絲、孢子形態(tài)，對病原菌進行初步鑒定。

采用CTAB 法提取病原菌DNA，分別擴增ITS、EF-1α 和β-tubulin 基因序列，PCR 反應(yīng)體系總體積為50 μL，包括ddH₂O 20 μL，模板DNA6 μL，上、下游引物各2μL，2×Bes Taq MasterMix（With Dyel）20 μL。ITS 基因引物為ITS1 和ITS4，EF-1α 基因引物為EF-668F、EF-278F 和EF-986R，β-tubulin 基因引物為Bt2a 和Bt2b，擴增程序參考LIANG 等[15]的方法。將PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測出明顯條帶后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。所得到的基因序列分別在NCBI 的GenBank 中與已知序列BLAST 進行比對和同源性分析，下載相似性高的基因序列及其模式菌株。使用PhyloSuite 軟件MAFFT 功能分別將ITS、EF-1α、β-tubulin 序列對齊，將對齊序列進行串聯(lián)（concatenate" sequence），采用最大似然法（maximum likelihood）運算，20 000 ultrafastbootstrap 來檢驗系統(tǒng)發(fā)育樹的可靠性，構(gòu)建多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹，確定病原菌的分類地位[16]。

1.2.4 莖腐病拮抗菌的篩選 以莖腐病病原菌為靶標(biāo)，采用平板對峙法對本實驗室前期分離的34株火龍果內(nèi)生細(xì)菌進行篩選[17]。先將內(nèi)生細(xì)菌轉(zhuǎn)接至LB 培養(yǎng)基中，200 r/min、30 ℃培養(yǎng)2 d，離心，取上清液備用；將病原菌菌餅（d=5 mm）接種于PDA 培養(yǎng)基的中間，分別取5 μL 發(fā)酵上清液以十字交叉法接種在距培養(yǎng)基中心2.5 cm 處，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，不接種發(fā)酵液為對照組，重復(fù)3 次，進行初步篩選。然后將具有抑菌效果的內(nèi)生細(xì)菌進行復(fù)篩，測量菌落直徑，計算抑菌率。抑菌率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%。

1.2.5 拮抗菌株無菌發(fā)酵濾液的抑菌活性測定將莖腐病拮抗菌株在LB 培養(yǎng)基中200 r/min，30 ℃培養(yǎng)2 d，取發(fā)酵液12000 r/min 離心10 min，上清液用細(xì)菌過濾器（0.22 μm）過濾，得到無菌發(fā)酵液。用打孔器在PDA 培養(yǎng)基（90 mm）距中心2.5 cm 處均勻打4 個孔，每孔注入100μL 的無菌發(fā)酵液， 在培養(yǎng)基中心接種病原菌菌餅（d=5 mm）。以無菌LB 液體培養(yǎng)基為對照組，于28 ℃培養(yǎng)，待對照組即將長滿培養(yǎng)基時，測量菌落直徑，計算抑菌率，公式同1.2.4。

1.2.6 拮抗菌株無菌發(fā)酵濾液熱穩(wěn)定性測定 將莖腐病拮抗菌株的無菌發(fā)酵液置于100 ℃條件下水浴30 min，冷卻至室溫，測量菌落直徑，計算抑菌率，方法同1.2.5。

1.2.7 拮抗菌株揮發(fā)性化合物的抑菌活性測定取5 μL 拮抗菌株發(fā)酵液接種于二分隔板一側(cè)的PDA 培養(yǎng)基中央，病原菌菌餅（d=5 mm）接種于二分隔板另一側(cè)的PDA 培養(yǎng)基中央，以不接種拮抗菌發(fā)酵液為對照組，28 ℃培養(yǎng)3 d，查看抑菌效果。

1.2.8 拮抗菌株抑菌譜的測定 運用平板對峙法，驗證拮抗菌株L3-4 對新暗色柱節(jié)孢菌、葡萄座腔菌、假禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌的抑菌效果，具體操作步驟同1.2.4。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間發(fā)病癥狀

通過田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，火龍果莖蔓變黃伴有不規(guī)則褐色斑點，發(fā)病嚴(yán)重部位呈深褐色，并且表皮和肉質(zhì)枯萎、腐爛（圖1），最終導(dǎo)致火龍果產(chǎn)量下降。

2.2 病原菌的分離及致病性測定

從感染火龍果莖腐病的莖蔓中分離出5 株具有代表性的分離株，分別進行致病性評價和鑒定。結(jié)果顯示，對照組生長狀態(tài)良好（圖2A），菌株P(guān)Y4（圖2B）和PY6（圖2C）在火龍果莖上產(chǎn)生病斑，其中PY4 導(dǎo)致火龍果莖產(chǎn)生紅色病斑并產(chǎn)生潰瘍，PY6 導(dǎo)致火龍果莖軟化、腐爛。其他3個分離株未表現(xiàn)出任何癥狀。利用組織分離法對發(fā)病部位再次進行病原菌的分離和純化，獲得菌株與原始菌株一致，符合柯赫氏法則，證明PY4和PY6 為引起火龍果莖腐病的病原菌。

2.3 病原菌形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定

菌株P(guān)Y4 在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d 可布滿平板，氣生菌絲發(fā)達，菌絲初期呈灰白色（圖3A），4～5 d 后開始產(chǎn)生黑色素，7 d 后菌絲平板完全變黑（圖3B）。菌絲黑褐色、有分枝、有隔膜（圖3C），厚垣孢子呈鏈狀排列，單孢，無色透明，圓形或卵圓形（圖3D），大小為4.56～13.18 μm×3.99～8.60 μm（平均7.30 μm×5.42 μm）。該菌絲形態(tài)和培養(yǎng)形態(tài)與已報道的新暗色柱節(jié)孢菌（N.dimidiatum）一致，初步將菌株P(guān)Y4 鑒定為新暗色柱節(jié)孢菌（N. dimidiatum）。

利用引物ITS1 和ITS4 進行rDNA-ITS 基因片段擴增，得到550 bp 片段；利用引物EF-278F 和EF-986R 進行EF-1α 基因片段擴增，得到303 bp片段；分別將2 個基因片段的測序結(jié)果在NCBI中進行BLAST 比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ITS 序列與新暗色柱節(jié)孢菌（N. dimidiatum）相關(guān)序列的相似度達99.82%；EF-1α 序列與新暗色柱節(jié)孢菌（N.dimidiatum ） 相關(guān)序列的相似度達100% 。在GenBank 中下載相似及同屬菌株序列，構(gòu)建多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明菌株P(guān)Y4 與新暗色柱節(jié)孢菌（N. dimidiatum）聚在同一分枝上（圖3E）。經(jīng)形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定，確定病原菌PY4 為新暗色柱節(jié)孢菌（N. dimidiatum），該菌是引起火龍果莖腐病的病原菌，國內(nèi)相關(guān)報道較多。

菌株P(guān)Y6 在PDA 培養(yǎng)基上生長3d后菌絲布滿平板，菌絲放射狀生長，氣生菌絲發(fā)達，初期呈白色（圖4A），9d后菌絲開始產(chǎn)生黑色素，隨培養(yǎng)時間增加，菌落顏色不斷變黑，21 d 后，菌絲全部變黑，且產(chǎn)生墊狀子座（圖4B）。分生孢子呈橢圓形或卵圓形，未成熟時呈無色透明單孢（圖4C），成熟后呈褐色或黑褐色，具有縱紋（圖4D），大小為20.65～28.06 μm×10.06～12.75 μm（平均23.47 μm×11.43 μm）。該形態(tài)特征符合毛色二孢屬（Lasiodiplodia）的形態(tài)特征。

利用引物ITS1、ITS4 進行rDNA-ITS 基因片段擴增，得到548 bp 片段；利用引物EF-668F 和EF-986R 進行EF-1α 基因片段擴增，得到514 bp片段；利用引物Bt2a 和Bt2b 進行β-tubulin 基因片段擴增，得到442 bp 片段。將ITS 序列、EF-1α和β-tubulin 序列上傳至GenBank，登陸號分別為OP984838、OQ680029 和OQ579035。分別將3個基因片段的測序結(jié)果在NCBI 中進行BLAST 比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ITS 序列與假可可毛色二孢菌（Lasiodiplodiapseudotheobromae）相關(guān)序列的相似度達99.82%；EF-1α 序列與假可可毛色二孢菌（L.pseudotheobromae）相關(guān)序列的相似度達100%；β-tubulin 序列與假可可毛色二孢菌（L. pseudotheobromae）相關(guān)序列的相似度達99.75%。在GenBank 中下載相似及同屬菌株序列，構(gòu)建多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，PY6 菌株與假可可毛色二孢菌（L. pseudotheobromae）聚在同一分枝上（圖4），因此將該菌株鑒定為假可可毛色二孢菌（L. pseudotheobromae）。

2.4 拮抗菌的篩選

以PY6菌株為供試靶標(biāo)菌，基于平板對峙法，從34株內(nèi)生細(xì)菌經(jīng)過初步篩選和復(fù)篩后發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）L3-4菌株對假可可毛色二孢的拮抗效果最強（圖5A），抑菌率為73.88%，故該菌株為后續(xù)研究目標(biāo)。分別挑取對照組和發(fā)酵液處理組的邊緣菌絲在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)對照組菌絲正常生長（圖5B）；處理組菌絲變形、曲折、斷裂（圖5C）。進一步試驗顯示菌株L3-4無菌發(fā)酵濾液的抑菌率為72.08%（圖5D），說明該拮抗菌的抑菌物質(zhì)主要存在于上清發(fā)酵液中。

2.5 拮抗菌株無菌發(fā)酵濾液熱穩(wěn)定性

菌株L3-4的無菌濾液熱穩(wěn)定測定結(jié)果顯示，100 ℃處理后拮抗菌株L3-4 的無菌發(fā)酵液可抑制火龍果莖腐病病原菌菌絲的生長， 抑菌率為71.16%（圖6），這說明100 ℃處理未對抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)生明顯影響，菌株L3-4所分泌的活性物質(zhì)可能為脂肽抗生素，具體結(jié)構(gòu)有待進一步研究。

2.6 拮抗菌株揮發(fā)性化合物的抑菌活性

用二分隔板將菌株L3-4與菌株P(guān)Y6進行揮發(fā)性化合物的抑菌活性測定（圖7），結(jié)果顯示，與對照組相比，處理組菌絲的生長狀況無明顯差異，菌絲正常生長，未受影響。菌株L3-4 不產(chǎn)生對菌株P(guān)Y6 明顯抑制效果的揮發(fā)性化合物。

2.7 拮抗菌株的抑菌譜分析

拮抗菌株L3-4對4株不同病原菌均有拮抗效果，具有廣譜抑菌效果（圖8）。其中對葡萄座腔菌的抑制效果最好，抑菌率可達77.65%；對假禾谷鐮刀菌的抑菌率為73.13%；對尖孢鐮刀菌的抑菌率為64.07%；對新暗色柱節(jié)孢菌的抑菌率為62.01%，抑菌率均呈顯著差異（Plt;0.05）。

3討論

莖腐病是廣西火龍果的主要病害之一，嚴(yán)重危害火龍果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，通過分離鑒定發(fā)現(xiàn)，廣西火龍果培育基地的火龍果莖腐病病原菌有：假可可毛色二孢菌（L. pseudotheobromae）、新暗色柱節(jié)孢菌（N. dimidiatum）。其中L. pseudotheobromae 是從L. theobromae 分出來的隱含種，形態(tài)學(xué)觀察難以區(qū)分二者的差別，過去由于分子鑒定不可用，病原體可能被識別為L. theobromae[18]。楊德潔等[19]的研究中發(fā)現(xiàn)L. theobromae 對檳榔有致病性，而L. pseudotheobromae 未引起檳榔發(fā)病，因此二者之間對宿主的致病性存在差異。本研究通過致病性測定和形態(tài)學(xué)鑒定，結(jié)合對ITS、EF-1α、β-tubulin 基因序列的分析，明確病原菌的分類地位，確定引起廣西火龍果莖腐病的病原菌為假可可毛色二孢菌（L. pseudotheobromae）。該病原體的宿主范圍非常廣泛，可引起多種植物的病害，如肉桂枝枯病[20]、泡核桃樹干潰瘍病[21]、柑橘果實腐爛[22]等。SANGEETHA 等[23]報道了L. iraniensis 和L. theobromae 能夠侵染火龍果，L. iraniensis 對火龍果造成的病害比L. theobromae更嚴(yán)重，表明毛色二孢屬的多種菌株可導(dǎo)致火龍果發(fā)生病害。本研究為國內(nèi)首次報道假可可毛色二孢菌引起的火龍果莖腐病。

利用微生物防治病害已經(jīng)成為一種可持續(xù)、環(huán)保和無毒的方法，作為拮抗菌株即使在低濃度下也能對多種植物病原體有效。拮抗細(xì)菌可通過多種機制參與生物防治，包括產(chǎn)生脂肽、產(chǎn)生水解酶（如幾丁質(zhì)酶、纖維素酶、葡聚糖酶）、產(chǎn)生微生物揮發(fā)性有機化合物（mVOCs）和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（ISR）[24]。本研究中，枯草芽孢桿菌L3-4菌株對PY6 能夠產(chǎn)生良好的拮抗效果，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)病原菌的菌絲有變形、曲折、斷裂現(xiàn)象；拮抗菌發(fā)酵液經(jīng)過無菌處理后，仍有抑菌活性，表明該拮抗菌株可產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)；100 ℃處理后的無菌濾液對病原菌有抑菌活性，表明拮抗菌產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)非蛋白質(zhì)、酶類；揮發(fā)性化合物抑菌試驗結(jié)果表明，該拮抗菌不產(chǎn)生明顯抑制病原菌的揮發(fā)性化合物。根據(jù)本研究結(jié)果，推測L3-4拮抗菌能產(chǎn)生脂肽類化合物對火龍果莖腐病病原菌產(chǎn)生抑制效果。李浩然等[25]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌的次級代謝產(chǎn)物（SMs）引起釀酒酵母細(xì)胞核膜裂解、DNA 彌散，誘導(dǎo)細(xì)胞壞死，并通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)發(fā)現(xiàn)SMs 處理后的釀酒酵母差異表達基因涉及細(xì)胞自噬、糖類、脂類和氨基酸代謝等多條通路，細(xì)胞壁合成過程和細(xì)胞周期等途徑也受到影響。多數(shù)芽孢桿菌可產(chǎn)生低分子量、兩親性的脂肽，脂肽類化合物的結(jié)構(gòu)和功能多樣，性能穩(wěn)定，表面活性優(yōu)異，脂肽具有廣譜抑菌活性，在抑制真菌生長方面表現(xiàn)優(yōu)異[26]。GOND等[27]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌能夠分泌具有廣譜抗真菌活性的脂肽， 主要包括iturin 和fengycin 家族，在玉米植株根部有病理相關(guān)基因的表達，從而增強了植株的抗病能力。ALINE等[28]研究探討了由枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的脂肽類化合物作為替代生物防治方法，其研究結(jié)果表明surfactin和fengycin 2種混合物使蘋果黑星病發(fā)病率減少70%。內(nèi)生菌是植物組織內(nèi)共生的微生物，有更好的定殖和適應(yīng)潛力，是最合適的生物防治劑之一，具有植物促生活性和抑制病原菌的內(nèi)生細(xì)菌受到廣泛的關(guān)注[29]。楊興有等[30]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌能顯著促進煙草生長勢，對煙草株高、莖圍、葉長等地上部分和根系等地下部分生長均具有顯著的促進作用。本研究中，拮抗菌株L3-4對火龍果莖腐病病原菌有良好的拮抗效果，具有較大的開發(fā)潛能，而對植物是否有促生效果有待進一步研究。