摘""要：木薯（Manihot"esclenta"Crantz）具有抗旱、耐貧瘠、適應性強等優(yōu)良的種植特點，是全世界10億多人口的主要糧食作物。CMLs（calmodulin-like"proteins）是一種植物類鈣調(diào)蛋白，是存在于細胞內(nèi)的鈣感受器，與其他鈣調(diào)素結合蛋白相互作用調(diào)控細胞生理過程，參與植物逆境脅迫響應。木薯MeCML42基因受干旱脅迫誘導，為了研究該基因參與的干旱脅迫響應通路，本研究利用酵母雙雜交篩選MeCML42的互作蛋白。首先利用同源重組技術構建pGBKT7-MeCML42誘餌載體，通過自激活檢測證明MeCML42蛋白無自激活活性。毒性檢測實驗證明，MeCML42蛋白對酵母菌沒有毒性，不影響酵母正常生長。通過酵母雙雜交進行cDNA文庫篩選，獲得7個候選互作蛋白。通過酵母雙雜回轉(zhuǎn)實驗驗證了MeCML42與硫氧還蛋白MeCDSP32存在互作關系。甘露醇模擬干旱脅迫發(fā)現(xiàn)，MeCML42與MeCDSP32均受干旱誘導表達，且在脅迫48"h的表達量最高，此結果說明MeCML42蛋白與MeCDSP32蛋白協(xié)同參與了木薯對干旱脅迫的響應。本研究結果為MeCML42參與木薯響應干旱脅迫通路提供新的依據(jù)。

關鍵詞：木薯；MeCML42；酵母雙雜交；MeCDSP32中圖分類號：S533""""""文獻標志碼：A

Screening"of"MeCML42"Interacting"Proteins"in"Cassava

ZHANG"Huimin1，2，3，"GE"Yujian1，2，3，"HOU"Jingyi1，2，"LIANG"Baojuan1，2，3，"REN"Zhixin1，2，3，"GUO"Jianchun2，3，"YAO"Yuan2，3，"WANG"Yajie2，3*，"GENG"Mengting1*

1."College"of"Tropical"Agriculture"and"Forestry，"Hainan"University，"Haikou，"Hainan"570228，"China;"2."Institute"of"Tropical"Bioscience"and"Biotechnology，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Key"Laboratory"of"Biology"and"Genetic"Resources"of"Tropical"Crops，"Ministry"of"Agriculture"and"Rural"Affairs"/"Hainan"Institute"for"Tropical"Agricultural"Resources"/"Key"Laboratory"for"Biology"and"Genetic"Resources"of"Tropical"Crops"of"Hainan"Province，"Haikou，"Hainan"571101，"China;"3."Sanya"Research"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences，"Sanya，"Hainan"572000，"China

Abstract："Cassava"（Manihot"esclenta"Crantz）"has"excellent"planting"characteristics"such"as"drought"resistance，"barren"tolerance"and"strong"adaptability，"and"is"the"main"food"crop"for"more"than"1"billion"people"in"the"world."CMLs"（calmodulin-like"proteins）"are"plant"calmodulin-like"receptors"in"cells."They"interact"with"other"calmodulin-binding"proteins"to"regulate"cellular"physiological"processes"and"participate"in"plant"stress"response."MeCML42"gene"in"cassava"is"induced"by"drought"stress."In"order"to"study"the"drought"stress"response"pathway"involved"in"this"gene，"yeast"two-hybridization"was"used"to"screen"the"interacting"proteins"of"MeCML42."Firstly，"the"decoy"vector"pGBKT7-"MeCML42"was"constructed"by"homologous"recombination"technique，"and"the"self-activation"experiment"showed"that"MeCML42"protein"had"no"self-activation"activity."The"toxicity"test"showed"that"MeCML42"protein"was"not"toxic"to"yeast"and"did"not"affect"the"normal"growth"of"yeast."The"cDNA"library"was"screened"by"yeast"two-hybridization"and"7"candidate"interacting"proteins"were"obtained."The"interaction"between"MeCML42"and"thioredoxin"MeCDSP32"was"verified"by"yeast"double"heterogyclic"experiment."Mannitol"simulation"of"drought"stress"showed"that"the"expressions"of"MeCML42"and"MeCDSP32"were"both"induced"by"drought，"and"the"expression"levels"were"the"highest"at"48"h"under"stress."These"results"indicated"that"MeCML42"and"MeCDSP32"were"synergistically"involved"in"cassava's"response"to"drought"stress."The"results"of"this"study"provide"a"new"basis"for"MeCML42"to"participate"in"cassava"response"to"drought"stress.

Keywords："cassava;"MeCML42;"yeast"two-hybrid;"MeCDSP32

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.11.002

木薯（Manihot"esculenta"Crantz）為大戟科木本植物，是重要的根莖類熱帶作物[1]。木薯塊根具有豐富的淀粉，被認為是生物能源、變性淀粉以及動物飼料的理想原料作物[2-3]。木薯具有一定的干旱耐受性，但苗期的生長嚴重受干旱制約，種植后3～4個月是灌溉木薯的關鍵時期[4]。在這個時期的水分脅迫會導致植物死亡或者儲藏根產(chǎn)量減少高達60%[5]。在干旱條件下，木薯通過快速閉合氣孔和葉片脫落以限制水分的進一步丟失，這是保護植物免受脫水的一種機制[6]。盡管木薯對干旱具有一定的耐受性，但這種耐受性是以犧牲塊根產(chǎn)量為代價的。一些參與木薯的干旱脅迫響應的基因已經(jīng)被挖掘。TURYAGYENDA等[7]通過全基因組關聯(lián)研究（GWAS）挖掘了23個與干旱耐受性相關的顯著單核苷酸多態(tài)性（SNPs），這些SNPs分布在木薯的不同染色體上，與干旱條件下的干物質(zhì)含量、根產(chǎn)量和淀粉產(chǎn)量等性狀相關。MeALDH和MeMSD通過清除ROS來保護細胞免受氧化應激的損害，而MeZFP和MeRD28則可能參與調(diào)節(jié)滲透物質(zhì)，幫助木薯在干旱條件下維持細胞的水分和穩(wěn)定性，這些基因均在抗旱木薯品種中上調(diào)表達。

鈣離子作為重要的次信使，在植物的生長發(fā)育和逆境響應中發(fā)揮著重要作用[8]。CMLs（calmodulin-like"proteins）是一種植物類鈣調(diào)蛋白，起源于真核生物，參與植物的生長發(fā)育并且發(fā)揮重要作用[9]。植物類鈣調(diào)蛋白是存在于細胞內(nèi)的鈣感受器，與其他鈣調(diào)素結合蛋白相互作用調(diào)控細胞生理過程[10]。擬南芥的類鈣調(diào)蛋白CML37正調(diào)控ABA介導干旱脅迫[11]。水稻OsERF48轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控OsCML16基因表達，增強根部生長和干旱耐受性[12]。過表達甜瓜的CmCML13基因，提高擬南芥的抗旱性[13]。研究表明ABA、MeJA、IAA正調(diào)控MeCML42啟動子活性，而SA對MeCML42啟動子活性則為負調(diào)控[14]。本研究通過酵母雙雜交篩選MeCML42的候選互作蛋白，點對點驗證實驗證明MeCML42與MeCDSP32存在互作關系，并利用qPCR分析MeCML42和MeCDSP32在干旱脅迫下的表達特征。本研究結果有助于進一步解析MeCML42在木薯響應干旱脅迫過程的作用。

1""材料與方法

1.1""材料

植物材料為華南8號木薯（SC8），在24"℃培養(yǎng)室中生長。主要試劑：質(zhì)粒提取試劑盒（Plasmid"Mini"Kit）和純化試劑盒（Cycle"Pure"Kit）購自OMEGA公司；酵母雙雜交載體pGBKT7、pGADT7、pGBKT7-lam、pGBKT7-p53、pGADT7-T均由本實驗室提供；AH109酵母感受態(tài)和大腸桿菌感受態(tài)DH5α均購自上海唯地生物技術有限公司；X-α-gal酵母顯色底物購自北京索萊寶科技有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶（EcoRⅠ、BamHⅠ）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；PrimeSTAR"HS（Premix）DNA"PolyMerase酶購自TaKaRa公司、酵母缺陷平板購自Clontech公司；2×Rapid"Taq"Master"Mix酶購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；RNA提取試劑盒（M5"HiPer"Plant"RNeasy"Complex"Mini"Kit“繁可簡”）購自北京聚合美生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（MonScript?"RTIII"All-in-One"Mix"with"dsDNase）和qPCR試劑盒（ChemoHS"qPCR"Mix）購自莫納（武漢）生物科技有限公司。

1.2""方法

1.2.1""誘餌載體pGBKT7-MeCML42的構建""按照聚合美“繁可簡”RNA提取試劑盒說明書提取SC8木薯全株RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測RNA質(zhì)量，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用PrimeSTAR高保真酶，以攜帶重組接頭的引物擴增MeCML42的編碼區(qū)（引物序列見表1）。擴增獲得并回收與預期片段大小一致的目的基因，然后通過聚合美試劑盒說明書將MeCML42回收片段與線性化載體pGBKT7（EcoR"I和BamH"I）連接。將同源重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α大腸桿菌感受態(tài)中，篩選獲得單菌落。利用2×Rapid"Taq"Master"Mix進行菌液PCR反應，通過凝膠電泳鑒定篩選陽性菌落，并進行Sanger測序，獲得測序正確的陽性克隆。

1.2.2""MeCML42蛋白的毒性檢測和自激活""（1）毒性檢測。將pGBKT7空載載體和pGBKT7-"MeCML42誘餌載體分別轉(zhuǎn)入AH109酵母感受態(tài)進行毒性檢測。將轉(zhuǎn)化后酵母菌液涂板在SD/-Trp培養(yǎng)基上，倒置在28"℃的酵母培養(yǎng)箱中生長約3"d，得到酵母單菌落。挑取單菌落，使用2×Rapid"Taq"Master"Mix酶體系進行菌斑PCR驗證，驗證引物為5-BD-F、3-BD-R。選取陽性酵母菌株進行擴大培養(yǎng)，將pGBKT7空載酵母菌液和pGBKT7-MeCML42酵母菌液分別接種至SD/-Trp液體培養(yǎng)基中，搖菌至OD600為0.6。將菌液稀釋為1∶1、1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000等不同濃度，涂布于一缺（SD/-Trp）培養(yǎng)基上，在28"℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3"d，觀察菌落的生長狀況。

（2）自激活檢測。將pGBKT7-MeCML42誘餌載體與pGADT7空載載體共轉(zhuǎn)至AH109酵母感受態(tài)，涂布于二缺（SD/-Trp-Leu）培養(yǎng)基上，稀釋從平板上挑取的陽性菌落，接種于二缺平板（SD/-Trp-Leu）、四缺平板（SD/-Trp-Leu-His-Ade）和SD/-Trp-Leu-His-Ade+X-α-gal平板上。分別以pGBKT7-p53+pGADT7-T和pGBKT7-lam+pGA DT7-T共轉(zhuǎn)化酵母為陽性對照和陰性對照。在28"℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3"d，觀察菌落的生長狀況。

1.2.3""MeCML42的酵母雙雜交文庫篩選""制備攜帶pGBKT7-MeCML42誘餌質(zhì)粒的AH109酵母感受態(tài)細胞。取本實驗室的SC8木薯品種cDNA文庫質(zhì)粒30"μg，加入至1.2"mL酵母感受態(tài)細胞中進行轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化后的酵母菌液涂布于三缺平板（SD/-Trp-Leu-His）上，在28"℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3"d，觀察酵母生長狀態(tài)。將三缺（SD/-Trp-Leu-"His）平板上生長的菌落（大于2"mm）挑到20"μL"0.9%"NaCl溶液中，混合均勻后點板至SD/-Trp-"Leu-His-Ade+X-α-gal平板上，平板倒置在28"℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3"d左右，觀察酵母的生長狀態(tài)。挑取藍色單菌落進行菌落PCR，將獲得的片段進行測序分析，獲得候選互作蛋白。

1.2.4""MeCML42的酵母雙雜交回轉(zhuǎn)驗證""根據(jù)候選互作蛋白測序信息，在木薯基因組數(shù)據(jù)庫搜索CDS區(qū)，設計攜帶重組接頭的引物（表1），克隆候選互作蛋白基因。通過同源重組試劑盒說明書將候選互作蛋白回收片段與線性化載體pGADT7連接，轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌感受態(tài)中，轉(zhuǎn)化方法詳見說明書。挑取單菌落，利用2×"Rapid"Taq"Master"Mix進行菌液PCR反應，通過凝膠電泳鑒定獲得陽性克隆，Sanger測序獲得序列正確的載體并提取質(zhì)粒。將含有候選互作蛋白基因的pGADT7載體與pGBKT7-MeCML42質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化AH109感受態(tài)細胞獲得轉(zhuǎn)基因酵母。將陽性酵母菌液點樣于SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-"His-Ade和SD/-Trp-Leu-His-Ade+X-α-gal培養(yǎng)基平板上，將平板倒置在28"℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，觀察酵母其生長狀態(tài)，驗證候選互作蛋白是否與MeCML42存在互作關系。

1.2.5""MeCML42與互作基因MeCDSP32在干旱脅迫下的表達分析""選取同一生長時期同一表型的SC8木薯植株，使用300"mmol/L甘露醇溶液澆灌至木薯根部，處理0、12、24、48"h后取樣。參照聚合美RNA提取試劑盒說明書提取植株全株總RNA，使用莫納逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)MeCML42和MeCDSP32基因CDS序列，使用NCBI網(wǎng)站設計qPCR引物（表1），分析SC8木薯的MeCML42和MeCDSP32基因在干旱脅迫下的表達量變化。

2""結果與分析

2.1""pGBKT7-MeCML42誘餌載體構建

提取質(zhì)量良好的SC8木薯總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用攜帶重組接頭的特異性引物擴增MeCML42基因的編碼區(qū)。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測顯示得到約400"bp的片段（圖1），條帶單一且明亮，符合片段預期大小（420"bp）。將回收的MeCML42基因片段與線性化pGBKT7載體連接涂板，挑取8個單菌落進行菌落PCR鑒定，將得到陽性菌落測序，獲得序列正確的pGBKT7-MeCML42誘餌載體。

2.2""pGBKT7-MeCML42誘餌載體的毒性和自激活檢測

將pGBKT7空載質(zhì)粒與pGBKT7-MeCML42誘餌質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化AH109酵母，梯度稀釋后接種于SD/-Trp平板，觀察菌斑生長狀態(tài)。結果顯示，pGBKT7空載與pGBKT7-MeCML42誘餌載體轉(zhuǎn)基因酵母生長狀態(tài)大致相同（圖2），說明pGBKT7-MeCML42誘餌載體對酵母細胞無毒性。

將pGBKT7-MeCML42誘餌質(zhì)粒與pGADT7共轉(zhuǎn)至AH109酵母，菌株可在SD/-Trp-Leu培養(yǎng)基上正常生長（圖3）。進一步觀察發(fā)現(xiàn)實驗組（pGBKT7-"MeCML42+pGADT7）和陰性對照（pGBKT7-lam+"pGADT7-T）在四缺培養(yǎng)基中均無生長，只有陽性對照（pGBKT7-p53"+"pGADT7-T）生長出酵母菌斑。結果表明，MeCML42蛋白無法獨自激活下游報告基因，即無自激活能力，可以進行酵母雙雜交實驗。

2.3""酵母雙雜交篩選MeCML42的候選互作蛋白

使用SC8木薯的cDNA文庫篩選MeCML42候選互作蛋白，最終在SD/-Trp-Leu-His-Ade+"X-α-gal平板上共生長出21個藍色菌落（圖4）。說明這21個藍色菌落攜帶的蛋白與MeCML42可能存在互作關系。經(jīng)菌落PCR獲得擴增產(chǎn)物后，進行Sanger測序分析，最終獲得了7個候選互作蛋白基因（表2）。

2.4""MeCML42候選互作蛋白的酵母雙雜交回轉(zhuǎn)驗證

克隆候選互作蛋白MeCDSP32、MeRBCSP、MeUPF0415、MeIF-3-4和MeNADP的編碼區(qū)，分別連接至pGADT7載體，構建回轉(zhuǎn)驗證載體：pGADT7-MeCDSP32"（AD-CDSP32）、pGADT7-"MeRBCSP"（AD-RBCSP）、pGADT7-MeUPF0415"（AD-UPF0415）、pGADT7-MeIF-3-4"（AD-IF-3-4）、pGADT7-MeNADP"（AD-NDAP）。將pGBKT7-"MeCML42（BD-MeCML42）誘餌蛋白分別與AD-MeCDSP32、AD-MeRBCSP、AD-MeUPF0415、AD-MeIF-3-4、AD-MeNADP共轉(zhuǎn)至AH109感受態(tài)細胞中，涂布于二缺（SD/-Trp-Leu）培養(yǎng)基平板上，菌斑經(jīng)PCR鑒定后，將共轉(zhuǎn)化成功的酵母菌液接種于含有SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His-"Ade和SD/-Trp-Leu-His-Ade+X-"α-gal等缺陷培養(yǎng)基平板上。結果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)AD-"MeCDSP32載體的酵母在SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-"Leu-His-Ade、SD/-Trp-Leu-His-Ade+X-α-gal平板上均長出菌斑，且在SD/-Trp-Leu-His-Ade+X-"α-gal培養(yǎng)基平板上的菌斑變藍（圖5），說明MeCDSP32與MeCML42蛋白存在互作關系。

2.5""MeCML42與MeCDSP32在干旱脅迫下表達分析

為了探究MeCML42與MeCDSP32在干旱脅迫下的表達水平，使用300"mmol/L甘露醇溶液處理SC8植株，使用qPCR技術分析MeCML42與MeCDSP32在干旱脅迫不同時間后的表達量變化。結果表明（圖6），MeCML42在干旱脅迫48"h時的表達量顯著高于0"h，提高了17.3倍。MeCDSP32隨著干旱脅迫處理時間越久，表達量越高，干旱脅迫48"h的表達量比0"h提高了12.75倍。MeCML42與MeCDSP32在干旱脅迫48"h的表達量均顯著上調(diào)，說明MeCML42與MeCDSP32參與了對干旱脅迫的響應。

3""討論

類鈣調(diào)蛋白CMLs（calmodulin-like"proteins）是一類類似于鈣調(diào)素（calmodulin，"CaM）的蛋白，二者之間具有高度同源性[15]。CMLs（calmodulin-"like"proteins）是存在于細胞內(nèi)的Ca2+感受器，胞內(nèi)Ca2+水平通量在介導應激反應通路中發(fā)揮關鍵作用[16]。鈣調(diào)素或類鈣調(diào)蛋白是含有不同數(shù)量的“EF-hand”基序的酸性小蛋白。這些蛋白質(zhì)通過其EF-hand結構域與Ca2+的高親和力結合來感知和解碼細胞鈣離子信號，從而誘導蛋白質(zhì)的構象變化并暴露其疏水表面[17]。CMLs與激酶、磷酸酶、轉(zhuǎn)錄因子以及其他信號蛋白發(fā)生相互作用，參與植物的生長發(fā)育、應答環(huán)境刺激等多種生理過程。當植物經(jīng)歷干旱脅迫時，細胞內(nèi)的鈣離子水平會發(fā)生變化，觸發(fā)信號傳導過程，激活鈣感受器，如鈣調(diào)蛋白和類鈣調(diào)蛋白（CMLs）[18]。木薯MeCML42的表達受到干旱脅迫誘導，但是MeCML42蛋白在木薯中參與的干旱脅迫信號通路尚未明確。

本研究通過酵母雙雜交篩選獲得了MeCML42的互作蛋白硫氧還蛋白MeCDSP32，該蛋白屬于葉綠體干旱脅迫誘導蛋白編碼基因（chloroplast"drought-induced"stress"protein"of"32"kD）。CDSP32由2個硫氧還蛋白模塊組成，這2個模塊在質(zhì)體防御氧化損傷方面起著關鍵作用[19]。植物類硫氧還蛋白通過改變蛋白質(zhì)的氧化還原狀態(tài)，在植物生長發(fā)育、非生物脅迫響應過程中具有重要作用。過表達棉花的CDSP32基因可提高擬南芥的耐旱、耐鹽及抗氧化脅迫的能力。過表達煙草CDSP32基因可增強SOD、POD和CAT等抗氧化酶的功能，提高AsA-GSH循環(huán)和Trx-Prx途徑去除H2O2的能力，提高煙草對鎘脅迫的抗性[20]。在干旱條件下，馬鈴薯CDSP32的mRNA和蛋白質(zhì)含量顯著上升，這有助于保護葉綠體免受干旱引起的氧化損傷[21]。本研究分析了MeCML42和MeCDSP32在干旱脅迫下的表達量變化，發(fā)現(xiàn)在48"h時二者的表達量顯著上調(diào)，相比0"h，分別上調(diào)了17.3倍和12.75倍。因此推測，MeCML42與MeCDSP32互作，共同參與了木薯對干旱脅迫的響應。后續(xù)將通過BiFC雙分子熒光互補實驗進一步驗證它們的相互作用，通過轉(zhuǎn)基因分析MeCML42和MeCDSP32的功能，明確在木薯響應干旱脅迫的功能。

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