【摘" "要】" "木瓜蛋白酶在醫(yī)藥、食品、日化等領(lǐng)域有重要應(yīng)用，設(shè)法提高其活性和穩(wěn)定性有利于放寬木瓜蛋白酶在工業(yè)應(yīng)用中的條件限制，提高經(jīng)濟(jì)效益。制備了1，4-丁二醇/氯化膽堿低共熔溶劑，并研究其對(duì)木瓜蛋白酶活性和穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，1，4-丁二醇/氯化膽堿低共熔溶劑能夠通過(guò)提高底物的傳質(zhì)速率和酶活性位點(diǎn)附近結(jié)構(gòu)的靈活性來(lái)提高木瓜蛋白酶的活性。利用分子對(duì)接分析了1，4-丁二醇/氯化膽堿在木瓜蛋白酶上可能的作用位點(diǎn)，通過(guò)圓二色光譜證明這一作用并未造成木瓜蛋白酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的顯著改變。并且將木瓜蛋白酶保存在1，4-丁二醇/氯化膽堿低共熔溶劑中能夠顯著提高其穩(wěn)定性。當(dāng)溶解在1，4-丁二醇/氯化膽堿低共熔溶劑體系中的木瓜蛋白酶被置于37 ℃或4 ℃下保存8 d后，其酶活分別保持在初始酶活的72.9%和86.1%。

【關(guān)鍵詞】" "木瓜蛋白酶；活性；穩(wěn)定性；1，4-丁二醇/氯化膽堿；低共熔溶劑

【Abstract】" " Papain is widely used in fields such as medicine， food， and daily chemicals. The improvement of papain activity and stability is beneficial to relax the restrictions of papain in industrial applications and improve economic benefits. In this paper， 1，4-butanediol/ choline chloride deep eutectic solvent was prepared， and its influence on papain activity and stability was studied. The results show that 1，4-butanediol/choline chloride deep eutectic solvent can enhance the activity of papain by increasing the mass transfer rate of substrates and enhancing the structural flexibility near enzyme active sites. The possible interaction sites of 1，4-butanediol/choline chloride on papain were analyzed by molecular docking， and circular dichroism spectroscopy showed that the interaction did not cause significant changes in the secondary structure of papain. It is worth mentioning that storing papain in 1，4-butanediol/choline chloride deep eutectic solvent can significantly improve its stability. When papain dissolved in the 1， 4-butanediol/choline chloride eutectic solvent system is stored at 37℃ or 4℃ for 8 days， its enzyme activity remains at 72.9% and 86.1% of the initial enzyme activity respectively.

【Key words】" " " papain; activity; stability; 1，4-butanediol/choline chloride; deep eutectic solvent

〔中圖分類號(hào)〕 Q556.3" " " " " " " " " "〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕" A " " " " " " "〔文章編號(hào)〕 1674 - 3229（2024）04 - 0089 - 05

0" " "引言

木瓜蛋白酶主要來(lái)自番木瓜的根、莖、葉和果實(shí)，是一種具有三個(gè)二硫橋的單鏈球狀半胱氨酸蛋白酶［1］。由于木瓜蛋白酶有很好的蛋白水解作用，因此被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、日化等多個(gè)行業(yè)，可用于嫩滑肉質(zhì)、促進(jìn)消化、清理創(chuàng)口、治療癌癥、美白祛斑等［2-3］。但是木瓜蛋白酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，在生產(chǎn)、運(yùn)輸、儲(chǔ)存和應(yīng)用的過(guò)程中容易受到環(huán)境溫度、pH等多種因素的影響，在很大程度上限制了木瓜蛋白酶的應(yīng)用條件和價(jià)值。因此設(shè)法提高木瓜蛋白酶的活性與穩(wěn)定性，對(duì)于放寬其在工業(yè)應(yīng)用中的條件限制、延長(zhǎng)其保存和使用時(shí)間具有重要價(jià)值。

低共熔溶劑是由Lewis或Br?nsted酸和堿組成的多組分混合物，其熔點(diǎn)與其組成成分的熔點(diǎn)相比顯著降低，多在常溫下呈液態(tài)。由于環(huán)境友好、成本低廉、制備簡(jiǎn)單、具有較好的生物相容性，低共熔溶劑已經(jīng)成為新興的綠色溶劑，被廣泛應(yīng)用于化學(xué)、材料和生物領(lǐng)域［4-6］，近些年低共熔溶劑開始被應(yīng)用于蛋白質(zhì)等生物大分子的提取，獲得了很好的效果，并被證明對(duì)于一些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定作用［7］。本文選擇了黏性較低的1，4-丁二醇/氯化膽堿低共熔溶劑，研究其對(duì)木瓜蛋白酶活性和穩(wěn)定性的影響。通過(guò)對(duì)比在水系和低共熔溶劑體系中木瓜蛋白酶活性隨溫度、底物濃度、酶促反應(yīng)時(shí)間和存放時(shí)間的變化，探究1，4-丁二醇/氯化膽堿低共熔溶劑對(duì)木瓜蛋白酶活性和穩(wěn)定性的影響。利用圓二色光譜研究1，4-丁二醇/氯化膽堿低共熔溶劑對(duì)木瓜蛋白酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，通過(guò)分子對(duì)接，解釋其可能的作用機(jī)理，為低共熔溶劑應(yīng)用于提高木瓜蛋白酶的活性和穩(wěn)定性提供理論依據(jù)。

1" " "材料與方法

1.1" "材料與試劑

1，4-丁二醇（≥98%）、氯化膽堿（≥98%）、木瓜蛋白酶購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；酪蛋白（優(yōu)級(jí)純）購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠；三氯乙酸（分析純）、磷酸氫二鈉（分析純）、磷酸二氫鈉（分析純）、L-半胱氨酸鹽酸鹽（分析純）、乙二胺四乙酸二鈉（分析純）、酪氨酸（分析純）購(gòu)自天津市化學(xué)試劑供銷公司。

1.2" "儀器與設(shè)備

紫外-可見光譜儀（UV-2550，日本島津）；圓二色光譜儀（Chirascan，英國(guó)應(yīng)用光物理公司）；集熱式恒溫磁力攪拌器（DF-101S，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；水浴恒溫振蕩器（THZ-82A，金壇市榮華儀器制造有限公司）；恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZWY-200D，上海智城分析儀器制造有限公司）。

1.3" "實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1" "低共熔溶劑制備

按照1：1：1的摩爾比稱量1，4-丁二醇、氯化膽堿和水，共同放入玻璃螺口瓶中并在80 ℃的油浴鍋中加熱攪拌，直至成為均一的液體。

1.3.2" "低共熔溶劑含水量對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響

稱取0.2 g木瓜蛋白酶，用溶有乙二胺四乙酸二鈉和L-半胱氨酸鹽酸鹽的0.5 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH=6.5）溶解并定容至250.0 mL的容量瓶中，搖勻后用上述磷酸鹽緩沖溶液繼續(xù)稀釋10倍。移取稀釋后的木瓜蛋白酶溶液2.50 mL于10.00 mL容量瓶中，分別加入7.00，6.00，5.00，4.00和3.00 mL由1.3.1中制得的低共熔溶劑，并用磷酸鹽緩沖溶液定容，得到不同含水量低共熔溶劑溶解的木瓜蛋白酶溶液。低共熔溶劑的含水量分別為30%、40%、50%、60%和70%。檢測(cè)在不同含水量的低共熔溶劑作用下木瓜蛋白酶的活性。

1.3.3" "1，4-丁二醇/氯化膽堿低共熔溶劑對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響

選擇1.3.2中酶活最高的含水量，在pH=6.5、反應(yīng)溫度為70 ℃、反應(yīng)時(shí)間為10 min的條件下，分別檢測(cè)不同底物濃度（2，4，6，10，14，18 mg/mL）下木瓜蛋白酶的活性。

其他條件保持不變，選擇底物濃度為6 mg/mL，分別檢測(cè)不同反應(yīng)時(shí)間（5，10，20，40，60 min）對(duì)應(yīng)的木瓜蛋白酶活性。

其他條件不變，測(cè)定不同反應(yīng)溫度（20，30，40，50，60，70，80 ℃）下反應(yīng)10 min對(duì)應(yīng)的木瓜蛋白酶活性。

1.3.4" "1，4-丁二醇/氯化膽堿低共熔溶劑對(duì)木瓜蛋白酶穩(wěn)定性的影響

將木瓜蛋白酶分成兩份，一份直接溶解到含有乙二胺四乙酸二鈉和L-半胱氨酸鹽酸鹽的磷酸鹽緩沖溶液中，另一份先溶解到上述緩沖溶液中，然后稀釋到1，4-丁二醇/氯化膽堿低共熔溶劑中，使兩份木瓜蛋白酶溶液的終濃度相同。將上述每份溶液分成兩份，分別保存在4 ℃和37 ℃下，在保存不同時(shí)間（0，8，16，23，30 d）后測(cè)定木瓜蛋白酶活性。

1.3.5" "圓二色光譜

將1，4-丁二醇/氯化膽堿低共熔溶劑稀釋到磷酸鹽緩沖溶液中，獲得含有不同濃度低共熔溶劑的溶液，用于稀釋溶解在磷酸鹽緩沖溶液當(dāng)中的木瓜蛋白酶，使得木瓜蛋白酶的終濃度為10 μmol/L，1，4-丁二醇/氯化膽堿的終濃度分別為0，10，20，40 mmol/L。利用Chirascan圓二色光譜儀進(jìn)行圓二色光譜掃描，掃描范圍為190-260 nm，光程為1 mm。掃描結(jié)束后用Pro-Data軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.3.6" "分子對(duì)接

從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（www.rcsb.org）下載木瓜蛋白酶的PDB文件（PDB ID：1PPD），刪除蛋白結(jié)構(gòu)中已經(jīng)存在的配體，之后利用AutoDock Vina軟件將木瓜蛋白酶作為受體蛋白分別與1，4-丁二醇和氯化膽堿對(duì)接［8］，盒子大小為54×44×51 ?。利用PyMOl進(jìn)行對(duì)接結(jié)果的分析和可視化。

2" " "結(jié)果與分析

2.1" "低共熔溶劑含水量對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響

1，4-丁二醇/氯化膽堿低共熔溶劑中的含水量對(duì)于木瓜蛋白酶活性的影響如圖1所示。從圖中可以看出，隨著含水量的升高，木瓜蛋白酶活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在含水量60%時(shí)達(dá)到最高。說(shuō)明低共熔溶劑的含水量對(duì)它與木瓜蛋白酶的相互作用存在影響。由于含水量60%的低共熔溶劑對(duì)木瓜蛋白酶活性促進(jìn)效果最好，因此后續(xù)工作中均采用含水量為60%的1，4-丁二醇/氯化膽堿低共熔溶劑進(jìn)行研究。

2.2" "1，4-丁二醇/氯化膽堿低共熔溶劑對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響

2.2.1" "不同底物濃度下低共熔溶劑對(duì)酶活的影響

從圖2可以看出，底物濃度在2～6 mg/mL之間時(shí)木瓜蛋白酶活性迅速升高，到達(dá)6 mg/mL時(shí)酶活基本達(dá)到高峰，此時(shí)繼續(xù)增加底物濃度，酶活維持在較高范圍內(nèi)基本不變。當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到10 mg/mL時(shí)，木瓜蛋白酶的活性達(dá)到最高，此后隨著底物濃度繼續(xù)增大，木瓜蛋白酶活性開始下降。說(shuō)明在低共熔溶劑體系中，傳質(zhì)速率和催化活性位點(diǎn)的飽和依然是影響木瓜蛋白酶活性的主要因素。與磷酸鹽緩沖溶液體系不同的是，當(dāng)木瓜蛋白酶存在于低共熔溶劑體系中時(shí)，在本研究的底物濃度范圍（2～18 mg/mL）內(nèi)，其活性均高于磷酸鹽緩沖液體系中的木瓜蛋白酶，在底物濃度為6 mg/mL時(shí)，低共熔溶劑體系中的酶活要比磷酸鹽緩沖液中高46.14%，說(shuō)明1，4-丁二醇/氯化膽堿低共熔溶劑對(duì)于木瓜蛋白酶的活性具有較好的促進(jìn)效果，除激活木瓜蛋白酶的催化活性外，對(duì)于低底物濃度下的傳質(zhì)速率也有較好的促進(jìn)作用。

2.2.2" "不同反應(yīng)時(shí)間下低共熔溶劑對(duì)酶活的影響

由于底物濃度的降低以及酶活性的改變，酶促反應(yīng)的速率一般隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低。從圖3中可以看出，1，4-丁二醇/氯化膽堿低共熔溶劑體系中的酶促反應(yīng)也符合這一特點(diǎn)，并且在不同反應(yīng)時(shí)間下酶活均高于磷酸鹽緩沖液中的酶活，說(shuō)明1，4-丁二醇/氯化膽堿低共熔溶劑對(duì)于木瓜蛋白酶活性具有促進(jìn)作用，有利于提高酶催化反應(yīng)速率。

2.2.3" "不同反應(yīng)溫度下低共熔溶劑對(duì)酶活的影響

圖4為不同反應(yīng)溫度下1，4-丁二醇/氯化膽堿低共熔溶劑對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響。在20～80 ℃溫度范圍內(nèi)，1，4-丁二醇/氯化膽堿低共熔溶劑體系中木瓜蛋白酶的活性均高于磷酸鹽緩沖液體系，并且隨溫度升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)溫度達(dá)到70 ℃時(shí)酶活最高，說(shuō)明1，4-丁二醇/氯化膽堿低共熔溶劑體系沒(méi)有改變木瓜蛋白酶的最適溫度。此外，在20 ℃下木瓜蛋白酶在1，4-丁二醇/氯化膽堿低共熔溶劑體系中的活性比同溫度磷酸鹽緩沖液中提高了191.58%；最適溫度70 ℃下這一增幅為23.99%。因此1，4-丁二醇/氯化膽堿低共熔溶劑可用于在較高或較低溫度下提高木瓜蛋白酶活性，從而方便其在更寬的應(yīng)用范圍內(nèi)更好地發(fā)揮效用。

2.3" "1，4-丁二醇/氯化膽堿低共熔溶劑對(duì)木瓜蛋白酶穩(wěn)定性的影響

本文研究了在4 ℃和37 ℃條件下，木瓜蛋白酶在不同溶液體系中的活性隨儲(chǔ)存時(shí)間的變化。從圖5可以看出，無(wú)論是4 ℃還是37 ℃，1，4-丁二醇/氯化膽堿低共熔溶劑均有利于提高酶活。在37 ℃儲(chǔ)存8 d時(shí)，磷酸鹽緩沖溶液中的酶活已經(jīng)降低到原來(lái)的31.0%，而1，4-丁二醇/氯化膽堿低共熔溶劑中保存的木瓜蛋白酶仍然保持了72.9%的相對(duì)酶活。甚至在37 ℃下存放30 d后，仍然保留10.4%的酶活。在4 ℃下磷酸鹽緩沖溶液中的酶活保持時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，在存放8 d時(shí)相對(duì)酶活為初始酶活的56.7%，在23 d左右時(shí)下降到10.1%；而1，4-丁二醇/氯化膽堿低共熔溶劑中保存的木瓜蛋白酶在存放8 d時(shí)依然保持86.1%的酶活，存放23 d后相對(duì)酶活為18.2%。由此可以看出，1，4-丁二醇/氯化膽堿低共熔溶劑體系能夠有效維持木瓜蛋白酶的穩(wěn)定性，有利于酶的長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

2.4" "1，4-丁二醇/氯化膽堿低共熔溶劑對(duì)木瓜蛋白酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

圓二色光譜常被用來(lái)分析蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。本文將木瓜蛋白酶與不同濃度的1，4-丁二醇/氯化膽堿低共熔溶劑混合，掃描其圓二色光譜，從而分析1，4-丁二醇/氯化膽堿對(duì)木瓜蛋白酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。從圖6可以看出，10 μmol/L木瓜蛋白酶與10 mmol/L和20 mmol/L1，4-丁二醇/氯化膽堿相互作用，對(duì)于其圓二色光譜幾乎沒(méi)有影響，說(shuō)明木瓜蛋白酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)在1，4-丁二醇/氯化膽堿中可以保持穩(wěn)定。而在40 mmol/L 1，4-丁二醇/氯化膽堿的條件下，木瓜蛋白酶的圓二色光譜雖然略有不同，但形狀未變，主要由221～222 nm和207～210 nm的負(fù)峰以及191 nm左右的正峰構(gòu)成，這是α-螺旋的主要特征。這些結(jié)果說(shuō)明1，4-丁二醇/氯化膽堿對(duì)于木瓜蛋白酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)幾乎沒(méi)有影響，能夠保持其天然構(gòu)象。

2.5" "1，4-丁二醇和氯化膽堿與木瓜蛋白酶的作用位點(diǎn)

利用分子對(duì)接研究1，4-丁二醇/氯化膽堿的兩種組分分別與木瓜蛋白酶相互作用的位點(diǎn)，結(jié)果如圖7所示。從圖中可以看出，1，4-丁二醇/氯化膽堿與木瓜蛋白酶的作用位點(diǎn)主要包括THR14、LYS17、LYS174和GLY66四個(gè)氨基酸殘基。而木瓜蛋白酶的催化活性中心主要由CYS25、HIS159和ASN175組成［9］，可以看到1，4-丁二醇/氯化膽堿的作用位點(diǎn)非常接近木瓜蛋白酶的催化位點(diǎn)。因此推測(cè)主要是由于1，4-丁二醇/氯化膽堿作用于木瓜蛋白酶的活性位點(diǎn)附近，使其附近的結(jié)構(gòu)更加靈活，從而有利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行。

3" " "結(jié)論

本研究制備了1，4-丁二醇/氯化膽堿低共熔溶劑，并且研究了1，4-丁二醇/氯化膽堿對(duì)木瓜蛋白酶活性和穩(wěn)定性的影響。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，1，4-丁二醇/氯化膽堿低共熔溶劑在不同底物濃度、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度下均對(duì)木瓜蛋白酶活性有提高作用，并且在20 ℃下對(duì)木瓜蛋白酶活性的提高幅度達(dá)到191.58%，在最適溫度70 ℃下這一增幅為23.99%，有利于拓寬木瓜蛋白酶的應(yīng)用條件。此外，木瓜蛋白酶的穩(wěn)定性在1，4-丁二醇/氯化膽堿低共熔溶劑體系中得到了極大的改善，在37 ℃和4 ℃保存8 d后酶活仍可保留初始酶活的72.9%和86.1%。說(shuō)明1，4-丁二醇/氯化膽堿低共熔溶劑能夠大大延長(zhǎng)木瓜蛋白酶在溶液中的保存時(shí)間。這一作用主要是因?yàn)?，4-丁二醇/氯化膽堿作用在木瓜蛋白酶的催化活性位點(diǎn)附近，使其結(jié)構(gòu)更加靈活，從而有利于酶促反應(yīng)進(jìn)行，同時(shí)通過(guò)圓二色光譜證明這一作用并未對(duì)酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)造成顯著影響，木瓜蛋白酶的活性結(jié)構(gòu)基本維持不變。

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責(zé)任編輯" "孫" "澗

［收稿日期］" "2024-04-03

［基金項(xiàng)目］" "河北省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（S202210100007）

［作者簡(jiǎn)介］" "王春暉（2001- ），男，廊坊師范學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院學(xué)生，研究方向：小分子與蛋白質(zhì)相互作用。

［通信作者］" "郭菁菁（1989- ），女，博士，廊坊師范學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院副教授，研究方向：小分子與蛋白質(zhì)相互作用。